酶化石復合菌粉抑制大鼠腎結石形成及對腎功能的保護作用

李本根,朱 焓,付梓峰,李 成

(遵義醫科大學附屬醫院 泌尿外科,貴州 遵義 563099)

腎結石是工業化社會中最常見的泌尿系統疾病之一,超過80%的腎結石為草酸鈣結石[1]。目前腎結石主要治療方法分為手術治療和非手術治療,以手術取石為主[2]。雖然設備的改進及醫生操作水平的提高使得結石清除達到滿意的療效,但腎結石的10年復發率仍高達50%[3],給患者帶來了沉重的經濟及心理負擔。因此,降低結石復發率顯得至關重要。目前研究認為高草酸尿、高鈣尿癥和活性氧誘導的氧化應激在草酸鈣結石的形成中至關重要[4-7],因此降低尿液中草酸和Ca2+濃度可以預防結石復發。臨床將枸櫞酸氫鉀鈉顆粒作為含鈣結石預防用藥,其治療機理為堿化尿液及提高尿枸櫞酸含量,臨床用藥較為單一。因此,通過益生菌干預調控腸道吸收草酸治療高草酸尿癥預防草酸鈣腎結石成為研究熱點[8]。由武漢康復得生物科技股份有限公司生產的酶化石復合菌粉通過食用菌發酵獲得的草酸降解酶調控腸道對草酸吸收,從而降低尿液中草酸含量,受到泌尿外科學者關注[9-10]。但是否可以抑制腎結石形成及對腎功能是否具有保護作用臨床爭議較大,因此探討酶化石復合菌粉治療效果具有重要意義。本研究通過酶化石復合菌粉治療草酸鈣結石大鼠,觀察結石及腎功能相關指標的變化,從而探索其治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠24只,SPF級,雄性10周齡,體重250～300 g,購買自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。飼養條件:溫度20～26 ℃,濕度為30%～70%。本研究嚴格遵守國際通行的動物福利與倫理準則,動物實驗通過遵義醫科大學附屬醫院實驗動物福利與倫理委員會審批(NO:ZMC21-2207-015)。

1.2 實驗試劑與儀器 酶化石復合菌粉(武漢康復得生物科技股份有限公司);枸櫞酸氫鉀鈉顆粒(武漢維奧制藥有限公司);蘇木素返藍液、伊紅染色液(Servicebio);草酸檢測試劑盒(sigma);鈣檢測試劑盒、尿素檢測試劑盒、肌酐檢測試劑盒(山東博科);大鼠用丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒;組織脫水機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司);兔抗NF-κB p65抗體(AF5006,Affinity);兔抗STAT3抗體(AF6294,Affinity);兔抗TNF-α抗體(AF7014,Affinity);兔抗IL-1β抗體(AF5103,Affinity);石蠟包埋機(Leica);切片機(Leica);攤片機(Leica);顯微鏡(OLYMPUS);全自動酶標儀(北京六一);全自動生化分析儀(山東博科)。

1.3 草酸鈣結石大鼠模型建立 動物適應性飼養7 d后,通過連續28 d飲用1%乙二醇水構建草酸鈣結石大鼠模型[11]。對照組給予普通飲用水,模型組、酶化石粉組、枸櫞酸氫鉀鈉組飲用1%乙二醇水,同時酶化石菌粉組按0.4 g/kg(以成人體重70 kg按體表面積法進行人-鼠間給藥量進行換算)劑量灌胃酶化石菌粉,枸櫞酸氫鉀鈉組按0.9 g/kg(以成人體重70 kg按體表面積法進行人-鼠間給藥量進行換算)灌胃枸櫞酸氫鉀鈉。藥物配制的方法為:稱取酶化石菌粉 9.8 g,溶于245 mL純水,濃度為0.04 g/mL;稱取枸櫞酸氫鉀鈉22.5 g,溶于250 mL純水,濃度為0.09 g/mL。

1.4 生化檢測 第0天及第28天收集尿液,尾靜脈采集血液。造模結束后0、28 d,取大鼠血液、尿液行生化檢測,血液用于測定血清尿素氮、肌酐和 Ca2+濃度;尿液用于測定尿草酸鹽和尿 Ca2+濃度。取血清和尿液樣本,5 000 g離心10 min,上機檢測。開機前檢查供水、檢查電源和檢查廢液連接;打開儀器總電源,打開儀器制冷電源和打開儀器主控電源;打開操作軟件確認儀器狀態,準備試劑探測試劑余量進行定標質控測試,錄入檢測項目尿素氮、肌酐和 Ca2+開始測試,測試完將數據導出,儀器維護保養后關閉儀器電源 。采用生化試劑盒檢測草酸的水平。取大鼠尿液樣本5 000 g離心10 min,按照試劑盒說明書進行草酸檢測,用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度(OD)值。

1.5 大鼠腎組織氧化應激水平檢測 采用ELISA檢測MDA、SOD、GSH-PX、CAT的水平。取28 d后各組大鼠血清,5 000 g離心10 min,按照說明書進行操作,具體操作步驟如下:ELISA試劑盒室溫下復溫,配制標準液,設置空白孔、標準孔和樣本孔,空白孔中不加樣本及酶標試劑,向其余各孔中加入50 μL樣本或標準品,加入酶標試劑100 μL,37 ℃孵育1 h。洗板5次后,加入顯色劑,37 ℃孵育15 min,加入終止液終止反應,在450 nm波長下檢測各孔吸光度值,根據相應公式計算濃度。

1.6 HE染色及偏光顯微鏡觀察大鼠腎臟組織草酸鈣晶體形成 實驗結束后斷頸處死各組大鼠,取左腎腎組織石蠟切片(4～6 μm)經烤片、脫蠟、水化后,用蘇木素染液染色3～5 min,流水沖洗后,用1%鹽酸酒精分化,反藍液反藍,伊紅染色3～5 min后,切片脫水,封片。在偏光顯微鏡下觀察腎組織草酸鈣晶體沉積情況。觀察5個視野中大鼠腎組織腎小管草酸鈣晶體形成情況并拍照,統計每個視野草酸鈣晶體數量,取平均值,共重復10次。

1.7 免疫組化檢測NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎組織中的表達 采用免疫組化檢測NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎組織中的表達情況。大鼠右腎組織切片,烤片、脫蠟、水化后,用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。經5% BSA抗原封閉后,用兔抗NF-κB p65抗體(1∶100)、兔抗STAT3抗體(1∶100)、兔抗TNF-α抗體(1∶100)、兔抗IL-1β抗體(1∶100)進行一抗孵育,4 ℃過夜后,進行辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶100)孵育,經DAB顯色,蘇木精復染反藍,脫水透明后,封片,在顯微鏡(BX43,Olympus)下進行觀察。

2 結果

2.1 各組大鼠尿液、血液生化基線指標 大鼠模型建立成功前,對各組大鼠尿液中的Ca2+、草酸,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+等指標進行檢測,其差異均無統計學意義(P<0.05),提示具有可比性(表1)。

表1 大鼠尿液、血液生化基線指標(n=6)

2.2 酶化石復合菌粉對大鼠腎臟中草酸鈣結晶沉積的影響 如圖1所示,對照組大鼠腎小球結構正常,部分腎小管管腔擴張,無草酸鈣結晶,無炎性細胞浸潤。模型組中,結構紊亂,腎小管管腔內充滿草酸鈣結晶,間質可見炎性細胞浸潤。與模型組對比,酶化石復合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的腎小管結構紊亂減輕,腎小管管腔內充滿草酸鈣結晶減少,炎性浸潤大量減少。

A:對照組;B:模型組;C:酶化石復合菌粉組;D:枸杞酸氫鉀鈉組,箭頭表示結晶位置;標尺為100 μm。

2.3 酶化石復合菌粉對大鼠尿液草酸及Ca2+濃度,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+的影響 如表2所示,28 d尿液中的Ca2+、草酸與對照組相比,模型組顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,酶化石復合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的Ca2+、草酸含量均下降(P<0.05)。28 d血清中,與對照組相比,尿素、肌酐在模型組中升高(P<0.05)。與模型組相比,尿素、肌酐在酶化石復合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的含量下降(P<0.05),而血清Ca2+在各組之間的含量差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 干預28d時大鼠尿液、血液生化指標(n=6)

2.4 酶化石復合菌粉對大鼠血清氧化應激指標的影響 如圖2所示,與對照組比較,模型組CAT、GSH-PX和SOD指標水平下降,而MDA指標水平升高(P< 0.05)。與模型比較,酶化石復合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉組中CAT、GSH-PX和SOD指標水平升高,而MDA指標下降(P<0.05)。

*:與對照組比較,P <0.05;#:與模型組比較,P < 0.05。

2.5 酶化石復合菌粉對大鼠腎臟NF-κB p65、STAT3、TNF-α及IL-1β表達的影響 如圖3及圖4所示,通過免疫組化方法對大鼠腎臟染色,明確大鼠腎臟NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β的表達。結果顯示,與正常組比較,模型組NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎臟組織中的表達上升(P<0.05);與模型比較,酶化石復合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉組中NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β表達降低(P<0.05)。

比例尺 400∶1。

*:與對照組比較,P <0.05;#:與模型組比較,P<0.05。

3 討論

目前研究認為高草酸尿、高鈣尿是引起腎結石發生的重要原因[3-4]。血清肌酐及尿素水平在腎小球損傷或功能減退時升高,研究發現腎結石也可引發血清中的肌酐和尿素含量升高[12-13]。在我們構建的草酸鈣結石大鼠模型中,HE結果顯示模型組大鼠腎組織結構紊亂,部分腎小管管腔內充滿草酸鈣結晶。在本研究中,我們同樣發現,模型組的大鼠(28 d)鈣離子(Ca2+)、草酸在尿液的含量增加,肌酐、尿素在血清中的含量增加。當我們用酶化石復合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,肌酐、草酸在尿液的含量下降,肌酐、尿素在血清中的含量下降。枸櫞酸氫鉀鈉顆粒作為治療腎結石有效藥物之一,其治療機理為堿化尿液及提高尿枸櫞酸含量抑制腎結石形成.而酶化石復合菌粉治療機理則是通過食用菌發酵獲得的草酸降解酶調控腸道對草酸吸收,降低尿液中草酸含量抑制腎結石形成。我們的結果發現酶化石復合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉治療組都可以降低尿液中Ca2+、草酸及血清中尿素、肌酐,但兩者之間無顯著性差異,說明酶化石復合菌粉可以起到類似枸櫞酸氫鉀鈉顆粒減輕腎結石的作用。

近年來,有研究[14]表明氧化應激損傷參與腎結石的發生。結石患者血清中抗氧化酶水平與正常組相比有所下降。CAT作為一種過氧化氫酶,可以分解H2O2并可能調節細胞中活性氧,具有抗氧化應激的作用,保護器官免受活性氧的傷害[11]?；钚匝醯漠a生是氧化應激誘導的關鍵步驟,導致丙二醛(MDA)、NO和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)水平升高,SOD、CAT和GSH-px水平降低[15]。GSH-Px可以保護細胞免受過氧化物引起的氧化損傷[16]。CAT、GSH-Px在結石的腎臟組織中含量低,致使器官喪失了及時清除過氧化產物(如活性氧、MDA)的能力,導致組織損傷[17-18]。在模型組中CAT、GSH-Px、SOD的含量下降,而MDA含量上升,說明模型組大鼠遭受了過氧化損傷。當酶化石復合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,CAT、GSH-Px、SOD含量上升,MDA含量下降,說明藥物減輕了機體的氧化應激損傷。

氧化應激誘導的氧化產物水平的升高會通過NF-κB和JAK-STAT通路導致一系列炎癥因子的釋放[14]。NF-κB家族由五種蛋白質組成,通過形成同源或異源二聚體發揮作用[19]。NF-κB抑制因子α(IκBα)與p65的核定位信號(NLS)的結合,使p50/p65在細胞質中保持非活性;當存在TNF-α時,會激活IκB激酶(IKK),激活的IKKβ磷酸化IκBα,促使IκBβ泛素化并被蛋白酶體降解,隨后p50/p65易位進入細胞核,激活下游基因的表達[20]。NF-κB p65、STAT3在腎結石發生中有重要作用,會促進腎臟器官的損傷,并造成炎癥[21-24]。我們同樣發現,NF-κB p65、STAT3及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)在模型組腎臟組織中的表達量增加;用酶化石復合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,NF-κB p65、STAT3及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)表達量下降。說明酶化石復合菌粉可以減輕腎臟炎癥反應。

綜上所述,酶化石復合菌粉能夠降低尿草酸、Ca2+含量,增強抗氧化應激,具有抑制腎結石形成及對腎功能的保護作用。該結果可為后續的機制研究提供基礎數據或依據。不足之處是本研究僅初步明確了酶化石復合菌粉可以抑制大鼠腎結石形成及對腎功能具有保護作用,有待進一步證實并揭示酶化石復合菌粉對草酸鈣結石形成的抑制及保護腎功能作用機制,有望為臨床草酸鈣結石的防治提供一種新的藥物。