電針預處理對切口痛大鼠中腦導水管周圍灰質5-HT7 受體表達的影響*

呂志峰王 洋呂 楠任偉東李夢杰 周友龍方 潔

（1 河南中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科，鄭州 450000；2河南中醫藥大學第一臨床醫學院，鄭州 450000；3河南中醫藥大學第三臨床醫學院，鄭州 450000）

術后疼痛嚴重影響病人術后康復，其中10%～50%的病人可由急性疼痛逐漸轉變為慢性疼痛，嚴重影響病人的精神狀態和生活質量[1]。隨著舒適化醫療和加速康復外科理念的提出，如何安全有效緩解術后疼痛成為臨床關注的重點。臨床鎮痛藥物包括非甾體抗炎藥、阿片類鎮痛藥、局部麻醉藥等，但這些鎮痛藥物可引發諸多不良反應，如藥物耐受、藥物依賴、胃腸功能以及認知功能障礙等[2]。電針療法以穴位針灸為基礎，結合電流刺激，通過抑制疼痛信號傳遞、調節炎癥因子釋放、改善免疫細胞功能等方式發揮抗炎鎮痛的作用[3]。然而，電針具體通過何種途徑發揮鎮痛作用目前尚未完全明確。

中腦導水管周圍灰質(periaqueductal gray, PAG)是傷害性刺激的中繼站，向上傳遞痛覺信息，向下調控疼痛反應。研究表明，其功能與PAG 釋放的神經遞質及表達的蛋白關系密切，包括5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、c-Fos 蛋白、5-HT7受體(5-HT7R)等[4]。c-Fos 是一種原癌基因，又被稱為即刻早期反應基因，當機體受到外界刺激后，誘導神經元活性增加，c-Fos 蛋白表達明顯升高，因此炎癥因子c-Fos 蛋白通常被認為是神經元活性的標記蛋白[5]。5-HT 是單胺類神經遞質，具有傳遞痛覺信息、調節體溫、睡眠等功能。研究發現，其生理作用取決于作用受體亞型和作用部位[6]。5-HT7R 是5-HT 受體家族中最后發現的受體亞型，廣泛存在于背根神經節、脊髓背角、PAG 等部位，表達于神經元細胞膜，參與情緒、學習記憶以及疼痛等功能調節[7]。因此我們推測電針鎮痛可能與PAG 中5-HT7R的表達有關。

Brennan法是目前較成熟的術后急性疼痛模型，足趾部組織損傷使炎癥介質及致痛因子釋放增加，從而引起手術區域異位痛和痛覺敏感[8]?！碍h跳”穴和“足三里”穴分別是足少陽膽經和足陽明胃經的重要腧穴，針灸兩穴均可達到疏通經絡、改善氣血、調節肢體功能之效[9]。因此，本研究通過重復電針預處理“足三里”和“環跳”穴，觀察足趾部切口痛大鼠的行為學變化、腦脊液中5-HT 水平、PAG 中c-Fos 蛋白和5-HT7R 表達，探討電針預處理緩解術后痛覺敏感的可能作用機制，為臨床鎮痛提供新思路、新方法。

方 法

1.實驗動物及分組

本研究選擇SPF 級雄性SD 大鼠40 只，7～10周齡，體重220～350 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供（實驗動物許可證號：SCXK (京)2019-0008）。該實驗已通過河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（實驗動物倫理審查批準編號：DWLL202108007）。

大鼠在溫度22℃ ～24℃、濕度50%～60%、12 h/12 h 晝夜環境下適應性飼養1 周，自由飲食水。將大鼠按隨機數字表法隨機均等分為四組(n= 10)：對照組（Con 組，既不電針刺激也不造切口痛）；切口痛模型組（IP 組，僅造切口疼痛模型）；正常+電針預處理組（Con + EA 組，僅行電針預處理）；模型+電針預處理組（IP + EA 組，造切口痛模型+電針預處理）。

2.主要儀器及試劑

華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司，SDZ-V 型），智能熱板儀（合肥必海微軟件科技有限公司，ZH-YLS-6BS），vonFrey 纖維絲（Danmic Global 公司，37450-275），華佗牌一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，222104），正置熒光顯微鏡（日本尼康），5-HT 酶聯免疫吸附測定試劑盒（Elabscience，E-EL-0033c），兔抗5-HT7R 抗體（Immunoway 公司，YT4409），兔抗c-Fos 抗體（Immunoway 公司，YT0884），R-PE 偶聯山羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術有限公司，SA00008-2）。

3.實驗方法

（1）電針預處理：造模前，用大鼠固定器對大鼠加以固定，參照大鼠穴位圖譜，電針刺激Con + EA組和IP + EA 組大鼠右側“足三里”和“環跳”穴（頻率為2/10 Hz 的疏密波，刺激強度數值為1 檔，每日1 次30 min），以大鼠右后肢隨著電針頻率輕微抖動作為電針刺激有效的標志，每日1 次，同一時間點連續刺激5 天。

（2）足趾部切口痛大鼠模型：最后一次電針刺激24 h 后，2%異氟烷吸入麻醉大鼠，常規消毒，按Brennan 法建立足趾部切口痛模型：沿大鼠趾部方向，在大鼠右足跟近端0.5 cm 處劃一縱行切口，長度約1 cm，劃開皮膚、皮下筋膜，暴露肌肉，用鑷子分離并挑起肌肉，棉簽按壓止血，規范縫合皮膚，術后碘伏消毒并涂抹紅霉素軟膏。

（3）機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)測定：分別在第1 次電針預處理前2 h (T1)、術前2 h (T2)、術后4 h (T3)、術后24 h (T4)時測定MWT，采用標準化的vonFrey 纖維針刺激大鼠右后趾部切口附近區域，當纖維絲彎曲為S 形，持續6～8 s，觀察大鼠縮足反應。選取0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、15 g 這10 根纖維絲，參照up-and-down 法，首先選取2.0 g 均勻緩慢用力，當大鼠右足出現躲閃、抬起或舔咬，用“X”表示，接下來選擇低一等級的纖維絲；否用“O”表示，接著選高一等級的纖維絲。當首次出現“XO”或“OX”時，再繼續測試4 次，并記錄最后一次使用的纖維絲強度，計算50%機械縮足閾值。若實驗中出現0.4 g 仍有陽性反應或15 g仍為陰性反應，則刺激強度為0.4 g 或15 g。每個時間點測量3 次，每次間隔5 min，取其平均值。50%機械縮足閾值= (10[Xf+kδ])/10000（Xf 為最后一次使用的纖維針的log 值；k 為不同序列對應值；δ 為所用刺激強度的log 值均差，此處約為0.174）。

（4）熱痛閾值測定：使用智能熱板儀測定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。設置熱板儀溫度為52℃±0.2℃，達到溫度后將其右后足貼于熱板，同時開始計時，當大鼠有明顯逃避動作時記時結束，終止時間為30 s。每個時間點測量3 次，每次間隔15 min，取其平均值，測定時間點與MWT 時間點一致。

（5）腦脊液提?。涸谧詈笠淮涡袨閷W測試后，用2%異氟烷將大鼠麻醉后固定至合適狀態，剃去頭背部毛發，切開皮膚，找到枕骨隆凸解剖位置，用1 ml 注射器滑至枕骨大孔后，針尖斜面向上，與頭部保持135°緩慢進針，待感受到明顯的落空感時，停止進針，緩慢抽取腦脊液。后續將腦脊液置入4℃低溫高速離心機進行離心，2500 rpm/min、20 min，取上清液至液氮速凍后于-80℃冰箱凍存。

（6）灌注、固定、取材：抽取腦脊液完成后，將大鼠改為仰臥位，切開皮膚、胸骨，暴露心臟，針頭經左心室進入升主動脈，剪開右心耳，依次推注0.9%氯化鈉注射液及4%多聚甲醛固定液進行心臟灌注。灌注完畢后剪開頭部皮膚，打開顱骨，取出腦組織，置于4%多聚甲醛固定液中待測。

（7）酶聯免疫吸附(ELISA)：依據 ELISA 說明，先后加入腦脊液及生物素標記抗體進行反應，隨后磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)，洗去未結合物質，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)復合物，再次洗滌后依次加入3, 3',5, 5'-四甲基聯苯胺(3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine,TMB)顯色液及終止液，在450 nm 波長檢測樣本吸光度并制作標準曲線，根據標準曲線計算5-HT 含量。

（8）免疫組化及免疫熒光：取固定的腦組織標本，洗滌脫水后石蠟包埋制備切片，脫蠟消除內源性過氧化物酶影響后蒸餾水清洗，PBS 浸泡，正常血清封閉非特異性位點后，加入c-Fos 或5-HT7R 抗體工作液，過夜孵育，PBS 沖洗后加入二抗，后續進行顯色、復染、脫水、透明、制片等步驟，置于顯微鏡觀察拍照，使用Image J 軟件分析結果。

4.統計學分析

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差(±SD)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，三組或三組以上比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1.電針預處理對切口痛大鼠MWT 影響

四組大鼠不同時間點MWT 比較見圖1。在T1、T2時間點，四組大鼠兩兩相比，MWT均無明顯差異。T3、T4 時間點，與Con 組相比，IP 組痛閾值顯著降低(P＜ 0.01)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠的痛閾值明顯升高(P＜ 0.05)。表明電針預處理可提高切口痛大鼠MWT，緩解機械性痛覺敏感。

圖1 四組大鼠四個時間點MWT 比較(n = 10,±SD)**P ＜ 0.01，與Con 組相比；#P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.1 Comparison of MWT at four time points in each group of rats (n = 10,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con; #P ＜ 0.05,compared with group IP.

2.電針預處理對切口痛大鼠TWL 影響

四組大鼠不同時間點TWL 比較見圖2。在T1、T2 時間點，四組大鼠兩兩相比，TWL 均無明顯差異。T3、T4 時間點，與Con 組相比，IP 組痛閾值明顯降低(P＜ 0.05)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠痛閾值顯著升高(P＜ 0.01)。表明電針預處理可提高切口痛大鼠TWL，緩解熱痛覺敏感。

圖2 四組大鼠四個時間點TWL比較(n= 10,±SD)*P＜ 0.05，與Con組相比； ##P＜ 0.01，與IP 組相比Fig.2 Comparison of TWL at four time points in each group of rats(n=10,x±SD)*P＜ 0.05,comparedwith group Con; ##P ＜ 0.01,compared with group IP.

3.電針預處理對切口痛大鼠腦脊液中5-HT 表達影響

ELISA 法檢測四組大鼠腦脊液中5-HT 濃度含量，結果見圖3。與Con 組相比，IP 組和IP + EA組大鼠腦脊液中5-HT 的濃度均顯著升高(P＜ 0.01)，Con + EA 組腦脊液中5-HT 的濃度高于Con 組(P＜0.05)；其余各組兩兩相比，均無顯著性差異。

圖3 四組大鼠腦脊液中5-HT 濃度比較(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與Con 組相比Fig.3 Comparison of 5-HT concentrations in cerebrospinal fluid of rats (n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con.

4.電針預處理對切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達影響

四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白免疫組化見圖4。與Con 組相比，IP 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達顯著增多(P＜ 0.01)；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白明顯減少(P＜ 0.05)；其余兩兩相比差異無統計學意義（見圖5）。表明在疼痛狀態下，機體c-Fos 蛋白合成明顯增加，而電針預處理可減少切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達。

圖4 四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達黑色箭頭指向c-Fos 蛋白，標尺= 50 μm，放大倍數×400Fig.4 Expression of c-Fos protein in the PAG of rats The black arrows indicate c-Fos protein.Scale bar =50 μm, magnification ×400.

圖5 四組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白含量比較(n = 3,±SD)#**P ＜ 0.01，與Con 組相比；P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.5 Comparison of c-Fos protein content in the PAG of rats (n = 3,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con；#P ＜ 0.05,compared with group IP.

5.電針預處理對切口痛大鼠PAG 中5-HT7R 表達影響

四組大鼠PAG 中5-HT7R 免疫熒光見圖6。與Con 組相比，Con + EA 組、IP 組、IP + EA 組PAG中5-HT7R 的表達明顯上調(P＜ 0.05)；與IP 組相比，IP + EA 組PAG 中5-HT7R 的表達明顯增多（P＜ 0.05，見圖7），表明電針預處理可上調切口痛大鼠PAG中5-HT7R 表達。

圖6 四組大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白表達白色箭頭指向5-HT7R 蛋白，標尺 = 50 μm，放大倍數 ×400Fig.6 Expression of 5-HT7R protein in the PAG of rats The white arrows indicate 5-HT7R protein, Scale bar =50 μm, magnification ×400.

圖7 四組大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白含量比較(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與Con 組相比；#P ＜ 0.05，與IP 組相比Fig.7 Comparison of 5-HT7R protein content in PAG of rats(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con;#P ＜ 0.05, compared with group IP.

討 論

電針刺激是一種物理療法，不良反應小、無依賴性，對疼痛的預防性治療療效顯著。研究發現，在足底切口痛大鼠模型中分別用電針和嗎啡進行多次干預，電針和嗎啡均可通過激活阿片類受體，抑制脊髓背角處c-Fos 蛋白表達，發揮鎮痛作用；但多次嗎啡注射出現耐藥性，而重復電針治療可使鎮痛效應累積[10]。研究證實，在適量情況下重復電針刺激可抑制脊髓內膠質細胞活化，促進腦干區域部分神經元興奮，合成釋放多種鎮痛物質，重構突觸結構，繼而實現鎮痛效應的累積[11]。另有研究發現，不同頻率電針鎮痛效果不同，這也說明電針鎮痛存在優勢頻率或優勢波[12]。相關臨床研究證實在術后疼痛中，疏密波鎮痛效果優于連續波，因此本研究以重復電針預處理為干預手段，選取2/10 Hz 疏密波，刺激強度數值為1 檔，每日1 次30 min，連續刺激5 天，以達到累積鎮痛效果。通過測定大鼠的MWT 和TWL 觀察其行為學變化，在T3、T4 時間點，與Con 組相比，IP 組大鼠的MWT 和TWL 均明顯降低；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠痛閾值明顯升高，說明電針干預具有鎮痛效果，可明顯改善術后疼痛引起的痛覺敏化現象。

正常生理狀態下，細胞中很少有c-Fos 蛋白表達，在受到外界刺激后，短期內中樞神經系統神經元活化，機體內c-Fos 基因被迅速激活，經過轉錄、翻譯等一系列過程，合成c-Fos 蛋白。c-Fos 蛋白參與機體多種生理活動，包括大腦發育、學習記憶、細胞增殖分化、信號轉導和疼痛調控等[13]。相關研究發現，在偏頭痛大鼠模型中PAG 內c-Fos 蛋白顯著升高，而電針預處理可明顯減少c-Fos 蛋白表達[14]。本研究中，通過免疫組化檢測各組大鼠術后24 h 時PAG 中c-Fos 蛋白表達，發現與Con 組相比，IP 組大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表達顯著上升；與IP 組相比，IP + EA 組大鼠的c-Fos 蛋白表達有所下調，這與大鼠痛閾值變化相一致，顯示電針預處理可下調大鼠PAG中c-Fos 蛋白，緩解術后疼痛引起的痛覺敏感現象。

研究表明在疼痛模型中，中樞核團和腦脊液內5-HT 含量明顯增加，這說明機體可自主合成釋放5-HT 來對抗疼痛[15]。然而，5-HT 對疼痛調節作用取決于其所處部位、作用受體亞型、疼痛模型等，并不是單一高濃度抑痛、低濃度促痛或者外周促痛、中樞鎮痛[6]。Brenchat 等[16]發現在疼痛過程中PAG 內的5-HT7R 表達明顯上調，說明疼痛刺激可以促進中樞神經系統中神經元表達5-HT7R。而應用5-HT7R 激動劑可以提高機體痛閾值，緩解疼痛[17]。本研究中，與Con 組相比，Con + EA 組、IP 組和IP + EA 組5-HT 及5-HT7R 表達均有所升高，其中IP + EA 組5-HT7R 活化程度更顯著。這些實驗結果與其他研究結果一致。切口痛可增加機體腦脊液中5-HT 濃度和PAG 中5-HT7R 蛋白表達，電針可上調PAG 中5-HT7R 的表達，這也說明電針預處理可能通過5-HT7R 抑制疼痛信號的傳遞從而發揮抗炎鎮痛的作用。然而本研究僅提出了一種電針鎮痛的可能機制，要明確這一鎮痛機制，還需加入5-HT7R拮抗劑或激動劑來進一步行分子生物學驗證；同時，對電針干預緩解術后痛覺敏感的最佳時機、最優方式也需進行探尋比較。

綜上所述，切口痛大鼠手術區域可發生痛覺敏感，而電針預處理可明顯提高切口痛大鼠MWT 和TWL，降低PAG 中c-Fos 蛋白表達，改善大鼠痛覺敏感現象。其鎮痛機制可能與上調PAG 中5-HT7R蛋白表達有關。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。