機械門控離子通道Piezo1 調節巨噬細胞參與炎癥反應研究進展 *

謝亞飛 杭黎華

（江蘇大學附屬昆山醫院麻醉科，蘇州 215300）

炎癥的主要臨床表現為紅、腫、熱、痛以及功能喪失。當機體接受炎癥因子刺激時，會引起局部血管經歷短暫的收縮，導致血管通透性增加以及血管內液外滲。同時炎癥介質可誘導免疫細胞黏附并從血管內皮遷移到損傷部位，導致炎癥細胞浸潤。此外，炎癥介質還會激活痛覺感受器引起疼痛。作為炎癥主要的特征，疼痛一方面向機體發出警告保護正常組織，另一方面通過神經系統引起神經源性炎癥和神經炎癥，最終危害大腦、心臟等重要器官，從而影響病人的勞動能力和生活質量，增加了社會和家庭的經濟負擔。目前的疼痛治療方案僅對50%的病人有效，因此探索疼痛的不同作用機制，找到介導疼痛的新靶點一直是疼痛研究的重要方向[1]。

機械損傷是炎癥的誘發因素之一，它貫穿于整個炎癥病理過程。反復或持續的破壞性機械刺激會導致炎癥性疾病，然而機械力誘發炎癥的機制尚不完全清楚。既往的研究表明機械敏感受體存在于全身組織中，在影響細胞形態和功能方面起著重要作用[2]。壓電型機械門控離子通道組件1 (piezo-type mechanosensitive ion channel component 1, Piezo1)是近年來發現的哺乳動物體內第一個機械門控陽離子通道，可對多種陽離子通透，尤其是Ca2+，這對接受機械性刺激的組織細胞的功能調控至關重要[3]。研究表明Piezo1 在炎癥性疾病的發生和發展中起著至關重要的作用。巨噬細胞是先天免疫系統的多功能細胞，通過感受其微環境中的動態變化參與炎癥反應。Piezo1 是巨噬細胞上顯著表達的一類離子通道，是調控巨噬細胞功能的關鍵一環。本文就Piezo1 調控巨噬細胞參與炎癥反應，參與多種炎癥疾病的過程進行綜述。Piezo1 調控巨噬細胞炎癥反應在疾病中的重要作用是目前研究的熱點之一。本文為方便研究者們更好地理解Piezo1 在炎癥性疾病中的作用機制，深入研究Piezo1 調控巨噬細胞參與炎癥反應的工作奠定基礎。

一、Piezo 概述

生物在長期的進化過程中產生了一種可以將機械刺激轉換成生物信號的高度保守機械敏感性裝置即機械門控離子通道，它對聽覺、痛覺、本體感覺、胚胎發生以及許多其他依賴機械感覺的生物功能起著至關重要的調控作用[4]。機械門控離子通道的概念最早由Corey 等[5]在牛蛙耳蝸毛細胞上記錄到機械刺激產生的電流信號后提出。從此，研究者們開始尋找這一類離子通道，并進行深入研究。有研究表明生物體實現快速機械感受的主要途徑是存在富含機械感受(mechanical sensation, MS)轉導通道的專門感覺細胞[6]。Cox 等[6]研究發現了包括雙孔鉀通道(tandem-pore-domain potassium channels,K2P)、瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道家族等多種機械門控離子通道。但是由于生物體間的差異，哺乳動物機械門控離子通道的研究相對滯后。

直至2010 年，Coste 等[3]在小鼠神經母細胞瘤細胞系中發現了哺乳動物細胞中第一個產生興奮性機械敏感陽離子電流并鑒定出了Piezo 蛋白家族。Piezo 蛋白家族是一類保守的真核機械門控離子通道,由Piezo1 和Piezo2 組成，參與包括觸覺、本體感覺、痛覺等多種機械傳導途徑[7]。Piezo 通道是一種形似螺旋槳形狀的同源三聚體，3 個亞基中38 個跨膜螺旋的異常彎曲排列共同形成了膜平面中的標志性納米碗構型[8]。Piezo 通道分布廣泛，目前已在脊椎動物的肺、膀胱、骨及背根神經節(dorsal root ganglia, DRG)神經元等部位發現其表達[9]。此類通道是一種非選擇性陽離子通道，主要對Ca2+通透，此外還對K+、Na+、Mg2+等陽離子及對Cl-也有一定的通透性[3]。Piezo1 在許多經常接受機械刺激的器官中表達并發揮功能，如血管或淋巴管內皮細胞中的Piezo1 調節血管重塑、瓣膜形態形成和血壓；成骨細胞中的Piezo1 過表達調節骨重塑；肺泡內皮細胞Piezo1 的激活可保護肺泡-毛細血管屏障結構的完整性；尿路上皮細胞中的 Piezo1 感應到尿液堆積而產生的管壁拉伸刺激后啟動排尿反射并促進排尿等[10]。除此之外，Piezo1 的基因突變還可導致人類各個系統疾病的發生，如脫水遺傳性干細胞癥、先天性淋巴發育不良以及乳腺癌的進展等[11]。

Yoda1 是目前已知唯一的Piezo1 特異性激活劑[12]。Syeda 等[13]通過細胞電生理學實驗證實Yoda1 可顯著影響Piezo1 的敏感性，同時也可通過穩定已開放的通道減緩失活動力學，甚至在沒有機械刺激的情況下，也可引起輕微的Piezo1 激活。Piezo1 的抑制劑有很多，包括釕紅、淀粉樣蛋白β、飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸以及GsMTx4 等，其中GsMTx4是當前應用最廣泛的Piezo1抑制劑之一。GsMTx4 是一種蜘蛛毒液肽，可選擇性地抑制屬于Piezo 和TRP 通道家族的機械敏感性陽離子通道[12]。此外，Velasco-Estevez 等[14]研究證實GsMTx4 可抑制溶血磷脂酰膽堿(lyso-phosphatidylcholine, LPC)刺激Piezo1 引起的脫髓鞘作用及神經元損傷，同時GsMTx4 還可抑制LPC 所誘導的星形膠質細胞及小膠質細胞的活化。GsMTx4 是一種重要的藥理學工具，在未來研究Piezo1 的生理學功能中至關重要。

二、巨噬細胞與炎癥反應

巨噬細胞是體內吞噬作用最強的細胞，具有高度可塑性，在機體生長發育過程中主要發揮吞噬和抗原提呈作用，同時還參與調節炎癥反應、血管生成等病理生理過程。受到刺激的巨噬細胞可極化為經典型巨噬細胞（M1 型、促炎型巨噬細胞）和替代性活化巨噬細胞（M2 型、抗炎型巨噬細胞）[15]。M1 型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子（白細胞介素-6、白細胞介素-12 等），并專職提呈抗原，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能[16]。M2 型巨噬細胞僅有較弱抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細胞因子白細胞介素-10 或轉化生長因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β) 等下調免疫應答，在免疫調節中發揮重要作用[17]。機體在發生炎癥反應時，細胞所處物理環境會發生顯著改變，進而刺激巨噬細胞等免疫細胞上的機械敏感性受體，引起相應信號轉導通路激活表現出免疫應答反應。

三、Piezo1 調節巨噬細胞參與炎癥反應

1.信號通路

（1） Piezo1-CaMKII-Mst1/2-Rac1：巨噬細胞是一類具有吞噬作用的特殊免疫細胞。在細胞感染期間，巨噬細胞表面的Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)可識別入侵的微生物從而引起先天免疫應答反應。有研究表明，由TLR 激活的Hippo 激酶Mst1和Mst2 (Mst1/2)在巨噬細胞抗炎反應中發揮著關鍵作用[18]。Geng 等[19]使用大腸桿菌處理骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM)時發現Piezo1 與TLR4 的顯影高度重合。進一步的實驗發現，在感染性腹膜炎小鼠中構建盲腸結扎穿刺模型(cecum ligation and puncture, CLP)可致80%的Piezo1 敲除小鼠死亡，而僅有40%的Piezo1 野生型小鼠死亡。同時可觀察到Piezo1 敲除小鼠的脾臟、肺、肝臟和腎臟的細菌感染顯著高于Piezo1 野生型小鼠。這些結果表明，Piezo1 可能是通過調控TLR4 信號活化Mst1/2，從而調控巨噬細胞抗炎反應而發揮作用。

Piezo1 是一種主要對Ca2+通透的離子通道，激活后促進Ca2+流入細胞質，Yoda1 可加速這一進程[20]。鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化細胞內的多種蛋白從而使細胞內的Ca2+濃度提高[21]。當用Yoda1處理生長在無鈣培養基的BMDM 時，結果顯示Mob1（Mst 生理底物）磷酸化減少，表明細胞外鈣的去除可抑制Yoda1 誘導的Mst1/2 活化。這些結果提示Ca2+是Piezo1 激活激酶Mst1/2 的重要第二信使。當用自分泌肽-2 相關抑制肽（autocamtide-2-related inhibitory peptide, TFA，一種高度特異性和強效的CaMKII 抑制劑）處理巨噬細胞，結果表明抑制CaMKII 可消除Yoda1 對Piezo1 的激活作用[19]。這些結果表明，機械激活的離子通道Piezo1 通過鈣信號誘導的CaMKII-Mst1/2 軸的激活來調節巨噬細胞的殺菌活性。

巨噬細胞的吞噬作用主要取決于肌動蛋白細胞骨架的重組。這一過程受小GTP 酶蛋白家族的調節。Rac1 是小GTP 酶蛋白家族的代表性分子，當使用Yoda1 處理BMDM 時發現只有Rac1 被激活，并且激活的程度在Piezo1 缺陷型和野生型小鼠中有顯著差異，但是在Mst1/2 缺陷的BMDM 中施加Yoda1處理后并沒有觀察到野生型BMDM 中Rac1-GTP（Rac1 的活化形式）量的增加[19]。這些結果表明，Piezo1 通過激活巨噬細胞Mst1/2，從而調控Rac1介導信號轉導增強巨噬細胞吞噬細菌的作用。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)刺激或大腸桿菌感染促進了相應的TLR4 受體與機械傳感器Piezo1 的結合，以誘導鈣內流，激活CaMKII-Mst1/2-Rac1 軸來調節巨噬細胞的殺菌活性。抑制CaMKII 或敲除Mst1/2或Rac1 會導致細菌清除率降低，可產生與Piezo1缺乏相同的后果[19]。

以上研究表明，細菌感染或LPS 刺激時，巨噬細胞的Piezo1 活化可通過介導Ca2+內流，進而激活胞內CaMKII-Mst1/2-Rac1 通路調控巨噬細胞參與炎癥反應，保護機體免受損害（見圖1）。

圖1 Piezo1 信號通路調節巨噬細胞炎癥反應示意圖

（2）Piezo1-AKT-GSK3β-Ccnd1：巨噬細胞在接受機械刺激并向M1 型轉化后，可在局部炎癥微環境中發揮調節正畸牙齒移動(orthodontic tooth movement, OTM)的作用[22]。Xu 等[23]構建了OTM 模型，并通過該模型發現機械刺激可在人和小鼠中顯著誘導巨噬細胞增殖，并且上調BMDM 中Piezo1 的表達參與炎癥反應。使用Piezo1 抑制劑或者敲除Piezo1 可減少巨噬細胞增殖進而延緩OTM，減弱殺菌活性。

Cyclin D1 (Ccnd1)是一種調節細胞周期不可或缺的蛋白質，是Piezo1 激活的AKT-GSK3β 通路的潛在下游靶因子，通過增強Rb 磷酸化促進巨噬細胞發揮抗炎作用[23]。Xu 等[23]在Ccnd1 敲除的轉基因小鼠中研究發現， Ccnd1 敲除可降低機械力刺激所致的巨噬細胞活化及Rb 磷酸化，抑制牙周巨噬細胞的增殖，進而延遲OTM，而Ccnd1 的過表達可明顯刺激巨噬細胞增殖，從而逆轉因Piezo1 拮抗劑GsMTx4 抑制的巨噬細胞殺菌能力。當BMDM 受機械刺激后，Piezo1 活化導致Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度顯著升高，可激活下游AKT-GSK3β-Ccnd1 軸促進巨噬細胞增殖，該增殖是OTM 期間巨噬細胞發揮抗炎作用的關鍵過程（見圖1）。

（3）Piezo1-YAP：最近的研究發現，巨噬細胞極化狀態的變化和細胞因子的分泌是促進成骨和血管生成的潛在機制[24]。在骨科手術中，生物材料置入會刺激巨噬細胞極化，進而產生炎癥-組織增殖-組織成熟這一連續的先天免疫反應[25]。有研究表明，M1 巨噬細胞可分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進血管的萌發和延伸。M2 巨噬細胞分泌血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB)和骨形態發生蛋白-2 (bone morphogenetic proteins-2, BMP-2)有助于血管成熟、穩定和成骨[25]。Luo 等[25]研究提示骨置入材料在早期可將巨噬細胞極化為促炎型(M1)，而在后期可將巨噬細胞極化為抗炎型(M2)，從而在更大程度上促進骨缺損中的成熟骨的形成。巨噬細胞的抗炎型增加（即M2 多于M1），最終可緩解機體的炎癥反應。

靜息狀態下，巨噬細胞內LATS1/2 可調控YAP磷酸化并抑制其生物學活性。當細胞接受刺激后可致YAP 發生去磷酸化并轉運至細胞核發揮作用，調節巨噬細胞參與炎癥反應[25]。Tang 等[26]研究發現用Ti2448 預處理的巨噬細胞可通過增加PDGF-BB和BMP-2 分泌，顯著促進血管生成和成骨分化，從而證實Ti2448 通過Piezo1-YAP 信號軸介導的巨噬細胞極化和相關細胞因子分泌促進血管生成和成骨。在對生物置入性材料表面培養的巨噬細胞進行免疫熒光染色和免疫印跡后也發現表面的巨噬細胞表現出高Piezo1 和YAP 表達。該研究提示，當巨噬細胞表面的Piezo1 通道受到植入性材料的刺激后，導致細胞質中被LATS1/2 抑制的磷酸化的YAP發生去磷酸化并轉運至細胞核，進而促進M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞轉化，釋放PDGF-BB 和BMP-2 調控炎癥反應，從而促進血管生成和成骨作用（見圖1）。

（4）Piezo1-JNK1-mTOR：小膠質細胞在受到LPS 刺激后可引發強烈的免疫反應。Liu 等[27]在高糖誘導的小膠質細胞炎癥反應中發現，在不存在GsMTx4 的情況下，較高濃度的葡萄糖顯著抑制小膠質細胞炎癥反應。若給予GsMTx4 的干預，則顯著增加了高濃度葡萄糖(≥60 mM)組中炎性介質的水平，并且葡萄糖濃度越高，GsMTx4 的作用越顯著。有研究表明，JNK1 和mTOR 信號通路是參與細胞生存、增殖、運動和分化的主要分子機制，且這兩種通路均受細胞內Ca2+信號調節，并已被證明參與Piezo1 的下游機制[28]。Liu 等[27]研究JNK1和mTOR 通路在依賴Ca2+增加的Piezo1 下游機制中的作用，結果顯示隨著葡萄糖濃度的增加，細胞合成代謝反應降低，表現出細胞內Ca2+水平的升高以及JNK1 和mTOR 的表達水平逐漸降低，當給予GsMTx4 的干預可增加JNK1 和mTOR 的表達，抵消高糖和LPS 的聯合作用，增加促炎介質釋放，恢復小膠質細胞功能。因此抑制Piezo1 通道減少Ca2+內流可通過JNK1-mTOR 信號通路減少高糖細胞毒性并恢復小膠質細胞介導的炎癥反應（見圖1）。

2.有氧糖酵解

有氧糖酵解是將葡萄糖轉化為丙酮酸的過程，若該過程受到抑制則可影響巨噬細胞活化后的許多功能，如細胞因子分泌、吞噬作用等。有研究表明，M1 巨噬細胞的激活可導致代謝從氧化磷酸化轉變為有氧糖酵解引起炎癥反應[29]。當巨噬細胞所處微環境發生變化后，其表面的Piezo1 被激活將機械刺激信號轉化為由Ca2+內流引起的免疫反應和代謝狀態的改變。Leng 等[30]針對無鈣培養基中的BMDM施加Yoda1 處理，結果發現巨噬細胞中HIF-1α（調節多種糖酵解相關基因表達的主要轉錄因子）及其核HIF-1α 蛋白水平降低，有氧糖酵解以及炎癥因子分泌水平下降，產生與Piezo1 缺陷BMDM 相似的效應，提示HIF-1α 在Ca2+誘導的糖酵解代謝中的關鍵作用。

既往的研究證實由Piezo1 激活誘導的CaMKII激活參與維持HIF-1α 穩定[31]。Leng 等[30]發現LPS刺激可顯著促進正常BMDM 中的CaMKII 磷酸化以及HIF-1α 水平的升高，施加KN93（CaMKII 酶活性抑制劑）處理后則產生相反結果。在使用siHIF-1α阻斷BMDM 中HIF-1α 的翻譯后，可觀察到HIF-1α的下調消除了正常BMDM 和Piezo1 缺陷BMDM之間的差異。多種實驗結果表明，當細胞微環境發生變化后，首先引起Piezo1 的激活增加Ca2+內流，通過Ca2+-CaMKII-HIF-1α 軸使HIF-1α 易位到細胞核并啟動多個糖酵解基因的復制和轉錄，最終實現吞噬殺菌的作用（見圖1）。

四、展望

Piezo1 是新型哺乳動物機械門控陽離子通道，是重要的膜蛋白，在機械刺激引起巨噬細胞環境變化從而導致的炎癥反應中發揮著至關重要的作用。Piezo1 將機械損傷信號轉化為巨噬細胞內炎癥級聯反應，以驅動炎癥的發生。目前的研究表明，Piezo1 藥物可作為治療機械應激相關免疫炎癥疾病的潛在靶點，是預防炎癥的有力手段。但是，限于目前的研究水平，Piezo1 的藥理作用仍然局限于溶解度和穩定性較差的低親和力藥物，如Yoda1 和GsMTx4，而這些藥物并不適用于體內[20]。因此，需要研究人員做更多的工作來找到更多的治療藥物。

在外周感覺系統中，Piezo 是研究機械疼痛傳導最有潛力的通道。既往的研究表明Piezo2 主要存在于背根神經節、三叉神經節等初級感覺神經元，參與部分機械疼痛反應，但是最近的研究發現，Piezo1 的mRNA 可在小鼠DRG 神經元中表達，并且證實Yoda1 通過激活DRG 神經元中的Piezo1，誘導細胞內鈣的增加[32]。這些研究提示Piezo1 可能參與調控疼痛的過程。因此，進一步研究Piezo1在疼痛中的調控作用，可能為臨床治療疼痛提供一潛在靶位。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。