中藥龍膽草抗鴿毛滴蟲的臨床藥效分析

魏苗伊, 吳世海, 楊富琳, 余宸昀, 孫志剛, 劉馨媛,徐媛媛, 梁冰冰, 李復煌, 孫 鴻, 劉曉曄*, 董 虹*

(1.北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室,北京 102206;2.北京農學院 北京市中獸藥工程技術研究中心,北京 102206;3.北京市畜牧獸醫總站,北京 100029;4.北京優帝鴿業有限公司,北京 100188)

鴿毛滴蟲病是鴿養殖場廣泛流行的寄生蟲病,常發于夏秋兩季,悶熱潮濕環境更有利于鴿毛滴蟲病的發展[1],該病導致鴿采食量下降,嚴重影響了肉鴿的生長速度,給肉鴿養殖業帶來了巨大的經濟損失。近年來,肉鴿養殖場內鴿毛滴蟲帶蟲率居高不下,幼鴿的毛滴蟲陽性率可高達90%,乳鴿死亡率可達30%～80%[2-3]。鴿毛滴蟲病除形成黏膜潰瘍或結節病變外,侵入肝可形成干酪樣損傷,引發肝腫大及充血,并在肝表面形成特征性圓形或球狀黃色病灶。若臍部感染鴿毛滴蟲,則會引起鴿臍部組織腫大及皮下炎癥,或發育不良為僵鴿[4]。目前,我國鴿養殖業的抗鴿毛滴蟲病主要是利用化藥甲硝唑,甲硝唑具有良好的抗禽毛滴蟲病作用,是鴿源禽毛滴蟲病臨床最常用藥物,但其具有一定藥物殘留和毒副作用。此外,由于甲硝唑的長期使用,禽毛滴蟲出現了耐藥寄生蟲株,為鴿源禽毛滴蟲病的臨床用藥帶來困難[5-8]。故我國肉鴿養殖業迫切需要尋找一種能替代甲硝唑的鴿毛滴蟲病治療手段。

在畜禽養殖業中,傳統中藥的應用越來越廣泛。中藥材來源豐富且種植規模日漸加大,中藥制劑成分多樣,在疾病的治療中具有多靶點多功效的優勢,且中藥具有天然、無殘留及低毒性,因此在畜禽疫病防治中,中藥的應用得到了學者們較大的關注[9]。我國傳統中獸醫對鴿毛滴蟲病的辨證為濕熱外邪侵犯機體,阻滯氣機而郁結于肝膽的濕熱內蘊證。

龍膽草,又稱矮腳金龍膽草、魚膽草等,是龍膽科植物干燥根及根莖。始載于《神農百草經》《藥鑒》及梁代陶弘景《名醫別錄》也都有記載[10]。主要分布在中國、俄羅斯、日本和朝鮮,在海拔400～1 700 m的地區生長,多生于土山、荒坡、高山路旁灌木雜草叢中。本品性寒,味苦,具有清肝膽實火,瀉下焦濕熱,健脾消食,舒筋止痛的功效[11-15]。研究表明,其抗菌消炎能力突出[16],但少見在畜禽養殖中應用龍膽草治療的相關報道。因此本試驗通過在患病肉鴿日糧中添加不同濃度的龍膽草水提物,用實驗室方法對采集的樣品進行相關指標檢測,觀察其抗鴿毛滴蟲藥效,旨在為龍膽草水提液在肉鴿養殖業中提供數據支持和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

龍膽草(北京同仁堂大柵欄店);甲硝唑(廣州康牧藥業有限公司);胎牛血清(美國 GiBco 公司,貨號:10099-141);PBS 緩沖液(Aladdin,貨號:P301565-500 mL);青霉素/鏈霉素雙抗(美侖生物,貨號:MA0110);無酶無菌水(Solarbio,貨號:R1600);D2000 plus DNA Ladder(Solarbio,貨號:M1070);臺盼藍(Merck,貨號:V900876-25 G);EasyPure?Genomic DNA Kit(北京全式金生物,貨號:EE121-16);DMEM 高糖培養基(美國 GiBco 公司,貨號:H2387);鴿白細胞介素-6 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,貨號:MM-92583902);鴿白細胞介素-1β ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,貨號:MM-92582101);鴿主要組織相容性復合體Ⅱ類ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,貨號:MM-92581202);鴿轉化生長因子-β ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,貨號:MM-92584201)

1.2 主要儀器

超純水儀(艾肯水精靈,型號:AK-RO-C2);CO2恒溫培養箱(日本 Sanyo 公司,型號:MCO-17AC);精密電子天平(德國哥廷根賽多利斯,型號:BS124 S);旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠,型號:RE-3000);奧林巴斯熒光倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司,型號:IX71);電熱恒溫干燥箱(太倉市試驗設備廠,型號:HZQ-F160);常溫常壓煎藥機(長沙市卓威醫療器械有限公司,型號:YJD20);自動細胞技術儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:C100-SE);小型電子秤(永康市龍蓓工貿有限公司,型號:I2000)

1.3 試驗材料

鴿毛滴蟲分離自北京市順義區優帝鴿業病鴿口腔,經純化、鑒定、可穩定傳代后用于本試驗。稱取龍膽草40 g,置于800 mL超純水中,浸制120 min后先用武火煮沸,后轉為文火煮沸30 min,4層紗布過濾獲得濾液,剩下的藥渣再加入400 mL超純水,以同樣的方法煮沸30 min,濾出藥液,與第1次收集的藥液混合,4層紗布過濾除去殘渣,并加熱濃縮至 40 mL。離心(3 000 r·min-1,10 min),取上清藥液烘干,得到粗制備的水提物并稱重,使用滅菌蒸餾水將各中藥水提物配成提取物濃度為0.1 g·mL-1的中藥原液。使用0.22 μm過濾器過濾除菌,得到單味中藥水提物,4 ℃保存備用。

1.4 鴿毛滴蟲分離鑒定

使用滅菌棉簽在病鴿咽喉部采樣后,放入1.5 mL滅菌離心管中保存并帶回實驗室。將1 mL DMEM培養基(含0.5% 200 IU·mL-1青霉素、0.5% 200 IU·mL-1鏈霉素和10% 胎牛血清)加入含有樣品的離心管中,37 ℃恒溫培養箱靜置培養24 h后將培養物均勻混合,在室溫下滴一滴,制成壓片,用光學顯微鏡進行觀察,若發現呈卵圓形,含1～3根鞭毛,具有移動性的蟲體,則可初步判定為鴿毛滴蟲。

取對數生長期的鴿毛滴蟲株懸浮液,加入1.5 mL離心管中,用DNA提取試劑盒按說明書提取其基因組DNA,4 ℃保存備用。ITS1/5.8 S/ITS2基因被認為是鴿毛滴蟲的標志基因,根據其在NCBI GenBank中的序列(登錄號:KP900042)設計引物,用正向引物(5′-TGCTTCAGCTCAGCGGG-TCTTCC-3′)及反向引物(5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)對其進行擴增[17]。PCR在50 μL的反應體系中進行,2×TaqPCR MasterMix 25 μL,引物各1.5 μL,DNA 模板4 μL,加無酶無菌水補至50 μL。陰性對照使用相同體積的無酶無菌。PCR程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,58.7 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環;72 ℃延伸8 min。PCR陽性產物送至生工生物工程股份有限公司測序,并將每個序列利用NCBI Blast在GenBank中搜索出匹配度最高的序列,下載作為參考序列并采用 MEGA 10.0軟件構建其系統進化樹。

1.5 龍膽草水提物體外抗鴿毛滴蟲活性測定

龍膽草水提物終濃度設為25、50、100 mg·mL-1。計算毛滴蟲蟲體數量,基于其大小及生長速度,制備密度為1×106個·mL-1的活蟲體懸液,將250 μL蟲體懸液與250 μL中藥水提物混勻,加入1.5 mL離心管中,同時設培養基代替藥物作為空白對照組,每個濃度設3個重復。將鴿毛滴蟲置于37 ℃溫箱中培養,分別于12、24、48 h用倒置顯微鏡觀察蟲體狀態,并用無菌吸頭將培養液輕輕吹打均勻,吸取一定懸液計數活蟲體數量,計算藥物對鴿毛滴蟲的相對生長抑制率。為確保結果準確,蟲體全部死亡的組,剩余部分正常轉種,繼續培養24 h,確定無活蟲體,方可判定該濃度可殺滅全部蟲體。

1.6 龍膽草水提物體內抗鴿毛滴蟲活性測定

分別于試驗第 0、7、15、23和31天采集鴿嗉囊分泌物于生理鹽水中,在3 000 r·min-1條件下離心5 min,棄上清液,取1 mL生理鹽水將沉淀物重懸并吹打均勻,取9 μL懸濁液與1 μL臺盼藍染色液混合均勻后將混合液吸取至一次性細胞計數板中,使用細胞計數儀對鴿毛滴蟲進行計數并計算各組的鴿毛滴蟲死亡率。

鴿毛滴蟲死亡率=(T1-T0)/T0×100%

T1:治療后受試鴿嗉囊分泌物內的鴿毛滴蟲數量;T0:治療前受試鴿嗉囊分泌物內的鴿毛滴蟲數量

1.7 蟲體死亡判斷標準

將不運動、邊緣不整、內含大量顆粒的圓形蟲體判定為死亡毛滴蟲?；蠲蜗x呈無色透明狀,蟲體運動時鞭毛或波動膜不停波動;經臺盼藍染色后,死亡毛滴蟲被染成明顯的藍色,蟲體變圓、結構模糊、蟲體內顆?；?、失去原有的透明度、鞭毛/波動膜停止運動、甚至破裂。

1.8 分組與給藥

選用90只體重相近,自然發病成年肉鴿,隨機分為中藥高劑量組(1 000 mg ·只-1)、中藥中劑量組(500 mg·只-1)、中藥低劑量組(200 mg·只-1)、陽性對照組(甲硝唑50 mg·只-1)和陰性對照組(表1)。以上各組每組6只,各設3個重復組,共計90只。注意確保試驗動物體況相似,免疫程序一致。其中藥物組將不同劑量濃度的龍膽草水提物加入基礎日糧中,陽性對照組加入甲硝唑,陰性對照組僅給與基礎日糧,療程3 d。

表1 分組及給藥方法

表2 測序結果與ITS1/5.8S/ITS2基因BLAST結果

1.9 數據處理與分析

2 結 果

2.1 鴿毛滴蟲的分離、鑒定、純化

采樣時,發現鴿口腔黏液增多、變黃,并污染了頸部羽毛?？谇?、喙緣和喉嚨處有針尖大小,干酪樣沉著物(圖1A)疑似鴿毛滴蟲感染。咽拭子直接涂片鏡檢表明,存在大量梨形或橢圓形移動蟲體。大多數蟲體可以看到1～3根鞭毛,部分蟲體鞭毛模糊,但可以繼續移動(圖1B,紅色標注)。

A.病鴿口腔臨床癥狀;B.咽拭子涂片A. Oral clinical symptoms of sick pigeon; B. Throat swab smear

通過測序,得到的基因片段長度為343 bp。在NCBI數據庫中進行BLAST 比對,測序結果與鴿毛滴蟲ITS1/5.8 S/ITS2基因具有98.01%的一致性(表 2);測序結果(T1)與鴿毛滴蟲KX844990一致性最高(圖2)。

圖2 測序產物進化樹分析Fig.2 Evolutionary tree analysis of sequencing products

將病鴿口腔樣本培養后,鴿毛滴蟲經過Percoll溶液的純化處理,在DMEM培養基(含雙抗)中傳代數代后,細菌和雜質得到凈化,得到的鴿毛滴蟲呈半透明狀,具有活動性,呈現出良好的生長活性及繁殖能力,可多次傳代用于后續試驗(圖3)。

A.鴿毛滴蟲(100×);B.鴿毛滴蟲(400×)A. Trichomonas gallinae(100×); B. Trichomonas gallinae(400×)

2.2 龍膽草水提物具備體外抗鴿毛滴蟲作用

龍膽草水提物25 mg·mL-1的毛滴蟲相對生長抑制率在12 h達(99.23±4.23)%,50和100 mg·mL-1的毛滴蟲相對生長抑制率在12 h均達100%,即可以殺滅全部蟲體。此外,各濃度龍膽草水提物在24和48 h均可以殺滅全部蟲體。結果表明:龍膽草水提物對鴿毛滴蟲具有抑制和殺滅作用,龍膽草水提物在12 h殺滅全部蟲體的MEC為50 mg·mL-1(表3)。

表3 中藥水提物體外抗鴿毛滴蟲活性

2.3 龍膽草水提物具備體內抗鴿毛滴蟲作用

龍膽草500 mg·只-1組在第31天仍具有一定殺蟲效果,殺蟲率為20.87%±1.08%,其他各組殺蟲率皆為0。這表明相對于甲硝唑,龍膽草500 mg·只-1組的藥效持續時間更長(表4)。

表4 龍膽草水提物體內抗鴿毛滴蟲活性

中藥組各組殺蟲效果顯著(P<0.05);其中,龍膽草200 mg·只-1組和龍膽草500 mg·只-1組與甲硝唑組殺蟲效果差異不顯著(P>0.05)(表4)。

2.4 龍膽草水提物恢復病鴿體重

對患病肉鴿進行體重稱量并統計,發現龍膽草水提物對體重降低的病鴿有恢復體重的作用。由圖4可知,與對照組相比,中藥組在1～15 d均有體重上升趨勢,在15 d以后呈體重下降趨勢。

圖4 龍膽草水提物對患病鴿體重的影響Fig.4 Influence of Gentian water extract on the body weight of pigeon

2.5 龍膽草水提物提高肉鴿生存率

根據試驗期間患病鴿死亡的記錄統計出各組患病肉鴿存活率,與對照組相比,中藥組及甲硝唑組都可以使肉鴿存活率升高。其中甲硝唑組的肉鴿存活率在7 d降至94%,并保持穩定。與甲硝唑組相比,在15 d以后龍膽草水提物作用組的肉鴿生存率相對下降,但均高于對照組(圖5)。

圖5 龍膽草水提物對患病鴿存活率的影響Fig.5 Effect of Gentian water extract on mortality of pigeon

2.6 龍膽草水提物使鴿毛滴蟲病鴿血清中ALT、AST含量降低、IL-6、IL-1β、TGF-β 3種炎癥因子升高

血清ALT含量在0～15 d呈下降趨勢,15 d降至最低,15～31 d呈上升趨勢。用藥后龍膽草水提物各組血清ALT含量在7～23 d內均低于對照組(圖6A)。其中,在第15天時,龍膽草水提物各組血清ALT含量均極顯著低于對照組(P<0.01),其中龍膽草200 mg·只-1組血清ALT含量最低(圖6B)。

A.龍膽草水提物組第0、7、15、23、31天血清ALT含量;B.龍膽草水提物組第15天血清ALT含量。圖上標注中以*代表組間差異顯著(P<0.05),**代表組間差異極顯著(P<0.01),下同A. Serum ALT levels in the Gentiana water extract group on day 0, 7, 15, 23, 31; B. Serum ALT levels in the Gentiana water extract group on day 15. In the marks on the figure, * represents significant difference between groups (P<0.05), and ** represents extremely significant difference between groups (P<0.01), the same as below

龍膽草水提物各組血清AST含量在第15天時最低,且均低于對照組(圖7A)。其中,在第15天時,龍膽草水提物1 000 mg·只-1組血清AST含量最低,顯著低于對照組(P<0.05),200 mg·只-1與500 mg·只-1組AST含量低于對照組(圖7B)。

龍膽草水提物各組血清AST/ALT含量在第7天時均低于對照組;第15天時龍膽草200 mg·只-1組和龍膽草500 mg·只-1組高于對照組,龍膽草1 000 mg·只-1組低于對照組;第23天時龍膽草200 mg·只-1組和龍膽草1 000 mg·只-1組高于對照組,龍膽草500 mg·只-1組低于對照組;第31天時龍膽草水提物各組血清AST/ALT含量均低于對照組(圖8)。

圖8 龍膽草水提物各組不同時間血清AST/ALT含量對比Fig.8 Comparison of AST/ALT content in serum of Gentian water extract at different time in each group

龍膽草水提物對患病鴿治療后,血清內炎癥因子含量表達見表5,治療前與治療后(用藥15 d),IL-6、IL-1β的含量有所變化。與治療前相比,龍膽草水提物及甲硝唑組IL-6、IL-1β含量明顯升高,治療后龍膽草各組血清IL-6含量均顯著高于對照組(P<0.05);龍膽草水提物200、500 mg·只-1組血清IL-1β顯著高于對照組(P<0.05)(表5)。

表5 龍膽草水提物對血清中IL-6、IL-1β的影響

與治療前相比,龍膽草水提物及甲硝唑組MHC-Ⅱ沒有明顯變化,但TGF-β含量明顯升高。在治療后,各龍膽草水提物組及甲硝唑組血清TGF-β顯著高于對照組(P<0.05)(表6)。

表6 龍膽草水提物對血清中MHC-Ⅱ、TGF-β的影響

3 討 論

按照中獸醫辨證施治理論,鴿毛滴蟲病的發生多由濕熱內蘊引起,所以治療原則應以清熱燥濕為主。研究表明香薷[18]、蒔蘿子揮發油[19]、參菊[20-21]、白頭翁[22-23]、艾葉[24]等中藥以及中藥熏洗聯合甲硝唑[25-29]具有抗毛滴蟲的功效;苦參、雞冠花、花椒[17]等中藥水煎提取物,滴蟲凈、滅滴靈等組方,以及青蒿精油、天竺葵精油等活性成分,可在短時間內降低鴿場毛滴蟲感染率或治愈病鴿。大蒜素、茜草素[30]、蛇床子素[31]、蒲公英的甲醇提取物在體外也能抑制和殺死毛滴蟲,此類具抗毛滴蟲功效的中藥多為清熱燥濕類。龍膽草味苦,性寒,其根及根莖中含有多種化合物,大致分為三萜類、黃酮類、環烯醚萜類、口山酮類、生物堿類[12]。其中環烯醚萜類化合物及口山酮類化合物既是龍膽科植物的特征性成分也是主要的藥效成分[13]。如龍膽苦苷是一種環烯醚萜類化合物,除了可以作為苦味健胃劑還具有保肝、利膽、抗炎及解痙止痛等作用[14]。

龍膽苦苷遇氨水易轉化為龍膽堿、龍膽醛等,其抗炎藥效是龍膽苦苷和龍膽堿的加和,在炎癥早期起到抑制作用[15]。2010版《中華人民共和國藥典》一部中寫道,龍膽草具有“清熱燥濕,瀉肝膽火”的功能,與古方中的清熱瀉火、清熱利濕、清肝明目的功效基本一致,即以清熱為主導,故可以用作在臨床上抗鴿毛滴蟲的天然植物藥物。

治療鴿毛滴蟲病常用的化學藥物有甲硝唑、替硝唑和其他硝唑類藥物,毒副作用大,并且有一定的復發率。當前,天然植物及植物提取物作為飼料添加劑的研究成為了熱點。天然植物藥物來源廣泛、種類多、生產過程對環境污染較小、長期服用無毒副作用。在龍膽草體外抗蟲試驗中,其藥效作用達到了化藥甲硝唑的療效。在龍膽草體內抗蟲試驗中,由于甲硝唑血藥濃度達峰時間及藥物維持時間較短,故在第31天殺蟲率為0,而龍膽草500 mg·只-1組在第31天仍具有一定殺蟲效果,說明在該劑量下,龍膽草藥效持續時間長于甲硝唑(表4)。在肝損傷方面,中藥組血清ALT含量在0～15 d呈下降趨勢,15 d降至最低,后期由于藥效降低,殺蟲效果減弱,蟲體迅速增殖,使得血清ALT含量在15～31 d呈上升趨勢,但仍達到了與甲硝唑組相同的作用趨勢。此外AST/ALT比值能夠粗略地判斷肝疾病的病程、嚴重程度以及病情的預后,在肝發生炎癥時,可使血清AST升高幅度比較ALT大。試驗中,AST/ALT比值在0～15 d呈上升趨勢,15～31 d呈下降趨勢,說明用藥后期能夠改善慢性炎癥。在抗炎方面,龍膽草水提物對病鴿體內炎癥因子水平的影響能夠達到與甲硝唑同樣的水平。此外,龍膽草對體重降低的病鴿有恢復體重的作用(圖4),并可以提高患病肉鴿存活率(圖5),且無顯著毒副作用,因此龍膽草可以用作抗鴿毛滴蟲病潛在的天然藥物開發。

清熱燥濕類藥物種類繁多,可從中繼續挖掘具有抗鴿毛滴蟲功效的藥物,與中藥龍膽草聯合使用,以期達到更好的療效,今后可用作新獸藥、飼料添加劑等。

4 結 論

龍膽草水提物對治療鴿毛滴蟲病具有顯著的臨床藥效,其藥效作用達到了化藥甲硝唑的療效,且無顯著的毒副作用,因此,龍膽草可以用作抗鴿毛滴蟲病潛在的天然藥物開發。