積雪草酸通過調控細胞凋亡和自噬緩解脂多糖誘導肉雞急性腎損傷的研究

邱文粵,蘇依曼,葉嘉莉,章心婷,龐曉玥,王榮梅,謝子茂,張 輝,唐兆新,蘇榮勝*

(1.華南農業大學獸醫學院,廣州 510642;2.韶關學院英東生物與農業學院,韶關 512005;3.黃埔區動物衛生監督所,廣州 510799)

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是由細菌、病毒和其他有毒物質引起的一種腎疾病[1]。細菌感染引起的急性腎損傷是家禽養殖業常見的疾病之一,以腎腫大和腎功能障礙為主要特征,嚴重威脅著家禽養殖業的發展[2]。禽病原性大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起細菌性感染性疾病的重要病原菌,各日齡段的雞都可能被大腸桿菌感染,其中以1個月內的雛雞更易感[3]?？股厥悄壳爸委熂毦约膊〉闹饕幬?然而,抗生素的濫用易使細菌產生耐藥性,加之我國養殖行業減抗、限抗、替抗政策的實施,尋找新的天然產物來替代抗生素的工作顯得更加迫切。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大腸桿菌細胞壁的重要組成成分,當細菌死亡時釋放大量LPS并可引起腎急性損傷[4]。研究表明,LPS可以激活小鼠心肌細胞凋亡和抑制自噬,從而引起心功能障礙[5]。細胞凋亡是機體組織進行自我更新的一種程序性死亡方式,但過度的細胞凋亡是疾病發生的基礎,LPS引起AKI和細胞凋亡有密切關系[6-7]。自噬是細胞維持穩態的一種方式,細胞通過自噬溶酶體途徑降解受損細胞器[8-9]。自噬和凋亡往往相伴出現,相互影響并參與調控疾病的發生發展[10]。

積雪草酸(Asiatic acid,AA)具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性功能[11-13],在許多疾病的預防和治療中受到廣泛關注。研究發現,AA能夠通過減少視網膜細胞凋亡預防青光眼[14];AA還可通過減少內質網應激和觸發自噬改善急性肝損傷[15]。然而,AA對LPS引起肉雞AKI中細胞凋亡和自噬的影響尚未見報道。因此,本研究擬通過肉雞腹腔注射LPS構建AKI模型,旨在探討AA對LPS誘導肉雞AKI的預防效果并從細胞凋亡和自噬角度來闡明其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

從新興大華農公司購買40只1日齡健康雄性黃羽肉仔雞(SCXK 2018-0019),經適應性飼養至7日齡時,隨機分為4組,即空白對照組(Con)、LPS誘導的腎損傷模型組(LPS)、AA低劑量組(LPS+AA 15 mg·kg-1)和AA高劑量組(LPS+AA 30 mg·kg-1)?；谇捌诘难芯砍晒鸞16],本研究選擇了15和30 mg·kg-1劑量的AA進行動物試驗。AA懸浮于羧甲基纖維素鈉懸浮液中,AA處理組的肉雞從7日齡開始,每日用相應劑量的AA灌胃14 d,LPS組和AA處理組的肉雞在第16、18和20日齡時腹腔注射0.5 mg·kg-1LPS構建急性腎損傷模型,Con組注射相應劑量的生理鹽水,在第20日齡腹腔注射LPS 12 h后處死肉雞并采集腎組織樣品,Con組和LPS組肉雞灌胃相等劑量的羧甲基纖維素鈉懸浮液。本次動物試驗經華南農業大學動物使用倫理委員會批準(2021b112)。

1.2 試驗試劑與儀器

脂多糖(E.coli055:B5 L2880)、多聚甲醛固定液購自美國Sigma公司;積雪草酸(98%)購自上海阿拉丁有限公司;羧甲基纖維素鈉購自北京索萊寶;組織包埋塊、電泳液粉末和轉膜液粉末購自武漢塞維爾有限公司;RNA逆轉錄試劑盒(R312-01)、qPCR熒光染料Master Mix (Q711-02)購自南京諾唯贊有限公司;TRIzol裂解液購自日本TaKaRa;MDA、GSH-Px、SOD、CAT檢測試劑盒,RIPA裂解液和PMSF抑制劑購自上海碧云天;辣根過氧化物酶標記二抗購自康為世紀生物公司;Beclin1、ATG5、LC3、P62抗體購自武漢三鷹生物有限公司;BAX、Bak1、BCl2抗體由上海Abmart提供;P53、Cleaved-Caspase3/Caspase3抗體購自沈陽萬類生物公司;GAPDH抗體購自南京巴傲得生物公司。

酶標儀(Elx808)購自美國Bioteck公司;微量紫外分光光度計(Nanodrop-2000)購自美國Thermo Fisher;基因擴增儀(MyCycler Thermal)購自美國Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀(LightCycler480)購自美國Roche公司;光學顯微鏡(DM1000)、正置熒光顯微鏡(DMi8)、組織切片機(RM2235)購自德國Leica;低溫高速離心機(D3024R)購自美國SCILOGEX公司;SDS-PAGE 蛋白電泳儀(BG-power 600)購自上海天能公司。

1.3 組織病理學染色

腎組織包埋由武漢塞維爾提供服務,使用切片機將組織包埋塊切成4 μm的薄片并黏附在病理級載玻片上,37 ℃烘烤過夜。隨后55 ℃融蠟1 h,經透明、梯度酒精脫水后進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, HE)染色,隨后在光學顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.4 腎組織中氧化-抗氧化指標的測定

腎組織在勻漿液中勻漿,12 500×g條件下離心10 min后取上清液,經BCA試劑盒測定蛋白濃度;檢測步驟根據碧云天氧化應激試劑盒說明書嚴格進行操作,采集數據后進行統計分析。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

稱取20 mg腎組織放入含有500 μL TRIzol裂解液的EP管中,手動勻漿后12 500×g離心10 min,并按照TRIzol試劑盒的步驟提取腎組織總RNA;將提取后的RNA在微量紫外分光光度計測定濃度和純度,并稀釋至500 ng·μL-1;按照RNA逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA,稀釋10倍后用于后續試驗。從NCBI獲取引物序列,引物序列由廣州擎科生物公司合成;引物序列見表1,以GAPDH作為管家基因。按照cDNA 2 μL,上、下游引物各0.8 μL,DEPC水6.4 μL和熒光染料Master Mix 10 μL的體系混合后經過實時熒光定量PCR儀檢測其基因表達水平;qRT-PCR的反應條件為預變性95 ℃ 30 s;95 ℃反應10 s,60 ℃反應30 s,反應循環40次,得到熔解曲線并計算其Ct值,隨后分析腎中細胞凋亡和自噬相關基因的表達水平。

表1 qRT-PCR檢測中使用的引物序列

1.6 蛋白免疫印跡

稱取20 mg腎組織至2 mL EP管中,并加入250 μL RIPA蛋白裂解液,手動勻漿后靜置10 min以充分裂解組織蛋白,隨后12 500×g條件下離心10 min;取上清并用BCA試劑盒將蛋白定量至1.25 μg·μL-1,稀釋后的樣品、Lodding buffer體積比按照4∶1進行混合后在100 ℃下沸騰10 min,結束后分裝儲存。將制備好的總蛋白樣品通過12.5%的SDS-PAGE凝膠分離后,經過轉膜步驟轉移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,經PBS清洗3次后與Bak1、BAX、BCl2、Cleaved-Caspase3/Caspase3、P62、Beclin1、ATG5和LC3抗體在4 ℃條件下孵育16 h;PBS清洗3遍后使用HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育1 h,在全自動化學發光系統檢測蛋白條帶的表達。

1.7 免疫組織化學技術檢測Cytc蛋白的表達與分布

腎組織包埋塊經切片機制成4 μm的薄片,黏附在防脫病理級切片,37 ℃烤片過夜后備用。55 ℃烤片1 h,經二甲苯透明和梯度酒精脫水等步驟后,在加熱至即將沸騰的10 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液(pH=6.0)反應10 min進行抗原修復操作。隨后使用85%的甲醇配制3%的H2O2溶液阻斷腎組織中的內源性過氧化物酶;經過3次PBS清洗后,使用10%的馬血清在37 ℃條件下封閉1 h,封閉結束后使用Cytc抗體在4 ℃條件下孵育組織切片18 h;使用辣根過氧化物酶標記二抗在室溫條件下孵育1 h,并在DAB顯示液作用下顯色。在光學顯微鏡下觀察腎組織中Cytc蛋白的表達與分布并采集相片,ImageJ分析上述結果的光密度值。

1.8 免疫熒光技術檢測LC3-II蛋白的表達與分布

腎組織切片的制備同“1.7”,腎組織切片在55 ℃條件下烤片1 h,經二甲苯透明和梯度酒精脫水后,使用1%的Triton溶液進行細胞膜穿孔15 min,隨后使用馬血清在37 ℃條件下封閉腎組織1 h以去除非特異性蛋白的影響,經PBS清洗3遍后使用LC3-II抗體在4 ℃條件下孵育腎組織18 h;PBS清洗3次后使用Cy3標記二抗在室溫下孵育腎組織切片1 h后DAPI染細胞核進行定位?？篃晒獯銣鐒┑渭釉诮M織上后即可封片,并在正置熒光顯微鏡下觀察并采集照片以用于后續分析。

1.9 TUNEL染色檢測細胞凋亡率

腎組織切片在55 ℃條件下烤片1 h,新鮮二甲苯透明和梯度酒精脫水后使用蛋白酶K孵育30 min,經PBS清洗3遍后,使用PBS配制3%的H2O2溶液,組織切片在室溫條件下浸泡20 min以滅活組織內源性過氧化物酶,隨后按照說明書步驟配制Streptavidin-HRP工作液,每個組織滴加50 μL工作液并孵育30 min,再次用PBS清洗3遍后使用DAB顯色液顯色,顯色結束后用蘇木精染細胞核以進行定位,梯度酒精脫水和新鮮二甲苯透明后使用中性樹脂封片,光學顯微鏡下觀察并采集圖像,ImageJ進行分析。

1.10 數據處理

最終數據以“平均值±標準差(mean±SD)”表示,本研究所有試驗數據均來源于至少3個獨立試驗,數據經Excel 2016簡單后處理使用GraphPad Prism 9進行作圖,組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并進行Turkey檢驗;*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較,#表示與LPS組相比較;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AA減輕LPS誘導的肉雞AKI

如圖1所示,Con組腎細胞結構完整,無任何病理變化。LPS組腎小球擴張、剝落,還可見細胞腫脹,腎小球空泡變性和萎縮。AA預處理低劑量組和高劑量組都減輕了LPS引起的肉雞腎的病變,且AA在30 mg·kg-1范圍內呈現劑量依賴性。相比起對照組肉雞腎臟系數,LPS引起肉雞腎臟系數極顯著增加(P<0.001),這是腎腫脹的表現;而AA低劑量和高劑量預處理肉雞都能夠顯著地降低LPS誘導的肉雞AKI中的腎臟系數(P<0.05)。

A. 腎組織病理學檢查(400×);藍色箭頭:腎小管擴張和腎小管上皮細胞脫落;黑色箭頭:腎小球空泡變性;紅色箭頭:腎小球萎縮;B. 腎臟系數:*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較,****P<0.001,#表示與LPS組相比較,##P<0.01,下同;C. 積雪草酸分子結構圖A. Histopathology of kidney (400×); Blue arrow: Dilation of renal tubules and detachment of renal tubular epithelial cells; Black arrow: Glomerular vacuolar degeneration; Red arrow: Glomerular atrophy; B. Kidney coefficient: * is expressed comparison with the control group and between the two groups,****P<0.001, # is expressed comparison with the LPS group, ##P<0.01, the same as below; C. Molecular structure of Asiatic acid

2.2 AA對LPS誘導肉雞AKI中氧化-抗氧化指標的影響

與Con組相比,LPS顯著增加了肉雞腎中的MDA水平(P<0.05),AA低劑量和高劑量都顯著降低了LPS誘導肉雞AKI的MDA水平且呈劑量依賴性(P<0.05)。與Con組相比,LPS均顯著降低了肉雞腎中的GSH-Px、CAT和SOD酶活性(P<0.05),而AA低劑量和高劑量預處理組肉雞腎中CAT和SOD酶活性均顯著升高(P<0.05),AA低劑量雖增加了GSH-Px的活性,但差異不顯著(P>0.05),AA高劑量則顯著增加了肉雞腎中GSH-Px的活性(P<0.05),AA預處理效果呈劑量依賴性(表2)。

表2 AA對LPS誘導肉雞AKI氧化-抗氧化指標的影響

2.3 AA對LPS誘導肉雞AKI中細胞凋亡相關基因和蛋白表達的影響

如圖2所示,與對照組相比,LPS顯著增加了P53、BAX、Caspse3的mRNA水平(P<0.05),增加了Bak1和Cytc的mRNA水平(P>0.05),抑制了BCl2的mRNA水平(P>0.05)。AA預處理顯著降低了LPS肉雞腎中P53、BAX、Caspse3的mRNA水平,且呈劑量依賴性(P<0.05);AA降低了Bak1和Cytc的mRNA水平,但差異不顯著(P>0.05)。AA劑量依賴性地增加了LPS肉雞腎中BCl2的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結果顯示,LPS處理顯著增加了P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表達(P<0.05),而抑制了BCl2蛋白的表達(P<0.05)。AA預處理呈劑量依賴性地降低了LPS肉雞腎中P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表達(P<0.05),而升高了BCl2蛋白表達,但差異不顯著(P>0.05)。

A～F. 細胞凋亡相關mRNA表達水平;G. Western bolt檢測細胞凋亡相關蛋白表達;H～L. 細胞凋亡相關蛋白的表達;*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001),#表示與LPS組相比較(#P<0.05, ##P<0.01和###、####P<0.001);P<0.05表示差異有統計學意義。下同A-F. Apoptosis-related mRNA expression levels; G. Western blot detects relative protein expressions of apoptosis; H-L. Relative protein expressions of apoptosis;* is expressed comparison with the control group and between the two groups (*P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001); # is expressed comparison with the LPS group (#P<0.05, ##P<0.01 and ###, ####P<0.001); P<0.05 indicates a statistically significant difference. The same as below.

2.4 AA對LPS誘導肉雞AKI中Cytc蛋白表達與分布和腎細胞凋亡率的影響

如圖3A、3B所示,與Con組相比,LPS極顯著地增加了肉雞腎組織中Cytc蛋白的表達與分布(P<0.001),而AA預處理在30 mg·kg-1劑量內呈劑量依賴性的降低了LPS肉雞腎組織中Cytc蛋白的表達與分布,且差異極顯著(P<0.001)。為進一步證明AA對LPS誘導肉雞腎細胞凋亡的保護作用,使用TUNEL染色檢測腎細胞凋亡率。TUNEL染色結果如圖3C、3D所示,與Con組肉雞腎凋亡率相比,LPS極顯著增加了腎細胞凋亡率(P<0.001),AA低劑量和AA高劑量預處理組都極顯著地降低了LPS肉雞腎細胞凋亡率(P<0.001),且呈劑量依賴性。

A、B. 免疫組化檢測Cytc蛋白的表達與分布;黑色箭頭:Cytc蛋白表達;C. TUNEL染色;黑色箭頭:凋亡細胞D. 細胞凋亡率A, B. Immunohistochemistry detects the protein expression and distribution of Cytc; Black arrow: the protein expression of Cytc; C. TUNEL staining; Black arrow: apoptotic cell; D. Apoptosis rate

2.5 AA對LPS誘導肉雞AKI中細胞自噬相關基因和蛋白表達的影響

如圖4所示,與Con組相比,LPS處理升高了肉雞腎組織中P62的mRNA水平(P>0.05),同時降低了ATG5(P>0.05)、Beclin1(P<0.05)、LC3-I(P>0.05)和LC3-II(P<0.05)的mRNA水平。AA預處理組肉雞和LPS模型組肉雞腎中P62的mRNA水平差異不顯著,但呈下降趨勢(P>0.05)。AA預處理還呈劑量依賴性地升高了ATG5、Beclin1、LC3-I和LC3-II的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結果顯示,LPS處理升高了肉雞腎中P62的蛋白表達(P>0.05),而AA預處理降低了LPS誘導肉雞AKI中P62的蛋白表達,差異不顯著(P>0.05)。LPS顯著降低了肉雞腎中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表達(P<0.05),而AA預處理顯著地升高了LPS誘導肉雞AKI中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表達(P<0.05),且呈劑量依賴性。

A～E. 細胞自噬相關mRNA表達水平;F. Western blot檢測細胞自噬相關蛋白;G～J. 細胞自噬相關蛋白表達A-E. Autophagy-related mRNA expression levels; F. Western blot detects relative protein expressions of autophagy; G-J. Relative protein expressions of autophagy

2.6 AA對LPS誘導肉雞AKI中LC3-Ⅱ蛋白表達與分布的影響

如圖5A、5B所示,與Con相比,LPS極顯著降低了肉雞腎組織中LC3-II的表達與分布(P<0.001)。而AA高劑量和低劑量都極顯著地增加了LPS組肉雞腎組織中LC3-II蛋白的表達與分布(P<0.001)。

A、B. 免疫熒光檢測LC3-II蛋白的表達與分布A, B. Immunofluorescence detects the protein expression and distribution of LC3-II

3 討 論

細菌感染引起的肉雞AKI是家禽集約化養殖中較常見的疾病之一,它能導致肉雞生長緩慢甚至死亡,給家禽養殖業造成嚴重的損失?？股厥羌毦腥拘约膊〉闹饕委熕幬?但長期使用抗生素會使細菌產生耐藥性,還可引起家禽發生內毒素血癥并導致家禽死亡。目前我國已實施減抗、限抗、替抗政策,加之中國中草藥資源豐富,天然產物在家禽養殖中的作用受到越來越多的關注[17-18]。AA是從積雪草中提取的五環三萜皂苷,已被證明具有抗炎、抗凋亡和抗腫瘤等生物活性[19]。本團隊之前的研究表明,60 mg·kg-1劑量的AA處理肉雞未見明顯毒性,且30 mg·kg-1劑量的AA能更有效地減輕LPS誘導的肝損傷和腎損傷[9,16]。因此,本試驗選擇了15和30 mg·kg-1劑量的AA進行研究。結果表明,AA通過抑制氧化應激和細胞凋亡以及促進細胞自噬減輕LPS誘導的肉雞AKI, 這一結論進一步證明了AA在LPS誘導肉雞AKI中的保護作用。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分,伴隨著細菌的死亡釋放至血液中并作用于腎等器官。LPS常用于誘導炎性因子釋放和建立AKI模型。LPS誘導AKI的機理是其與Toll樣受體4(TLR4)結合并激活炎癥反應和氧化應激[20]。盡管LPS誘導AKI的致病機理已初步闡明,但其具體發病機制和治療策略仍有待進一步研究。研究表明,LPS可引起腎嚴重的病理損傷,包括腎小管擴張、腎小管上皮細胞脫落和腎小球萎縮等病理變化[21]。本研究通過給肉仔雞腹腔注射0.5 mg·kg-1劑量的LPS成功建立AKI模型,結果發現LPS會引起肉雞腎小管擴增、腎小管上皮細胞脫落,腎小球萎縮和腎小球空泡樣病變,前期試驗結果也支持了這一點[16]。AA預處理減輕了LPS誘導肉雞腎的病理損傷,這和前人的研究結果是一致的[22]。此外,LPS處理顯著增加了肉雞的腎臟系數,表明LPS會引起肉雞腎腫脹,這和之前的研究發現是一致的[23];而AA預處理14 d后可以顯著降低LPS誘導肉雞AKI的腎臟系數,這表明AA可以緩解LPS引起的肉雞腎腫脹。LPS不僅可以刺激炎癥因子的釋放同時會誘導過量ROS的產生并激活氧化應激,引起細胞抗氧化酶活性下降和脂質過氧化物MDA水平增加[24-25];研究結果顯示,LPS處理顯著增加肉雞腎組織中MDA水平以及顯著降低GSH-Px、SOD和CAT酶的活性,這和前人的研究結果是相符合的[26]。有趣的是,AA預處理可以顯著降低LPS肉雞腎組織的MDA水平,同時升高GSH-Px、SOD和CAT的酶活性?？傊?上述結果表明,AA能夠抑制LPS引起肉雞腎組織的氧化應激,從而減輕LPS誘導肉雞AKI。

凋亡是細胞自我更新的程序性死亡方式,而過度的細胞凋亡是組織損傷的表現;氧化應激會引起線粒體通透性增加并導致Cytc從線粒體轉運到細胞質中,隨后激活Caspase3并觸發線粒體途徑的細胞凋亡[27]。細胞凋亡的特征還包括促凋亡蛋白P53、BAX和Bak1的表達增加,抗凋亡蛋白的表達減少[28]。先前的研究表明,LPS誘導的器官損傷和細胞凋亡有著密切聯系,LPS可激活過度的炎性反應和氧化應激,進而介導細胞凋亡[29]。本研究發現,LPS處理增加肉雞腎中P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的mRNA表達水平,降低BCl2的mRNA水平;同時,LPS處理增加了肉雞腎中P53、BAX、Bak1和Cleaved-Caspase3的蛋白表達以及降低BCl2蛋白的表達;此外,免疫組織化學的結果顯示,LPS處理顯著增加Cytc在腎組織中的表達;TUNEL結果發現,LPS極顯著地增加腎組織中的細胞凋亡率,這和前人的研究結果是一致的[30]。有意思的是,AA預處理可顯著降低P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的基因和蛋白表達,上調BCl2基因和蛋白的表達;AA還能降低Cytc蛋白在LPS誘導肉雞AKI中的表達,且極顯著抑制LPS誘導肉雞腎組織的細胞凋亡率。上述結果首次表明,AA預處理通過調控細胞凋亡相關基因和蛋白表達水平減輕了LPS誘導的肉雞AKI。

自噬是溶酶體降解受損的細胞器并進行自我更新的過程,在維持細胞穩態方面具有重要作用[31]。P62 是具有多結構的蛋白,在細胞信號轉導、增殖和炎癥中起著關鍵作用[32];Beclin1是調節自噬活性的關鍵因子,當Beclin1表達減弱時表明自噬被抑制[33-34]。ATG5和LC3是自噬的重要標志物,抑制自噬會導致ATG5和LC3蛋白的表達降低[35-36]。研究表明,LPS可引起過度自噬誘導細胞損傷[37];然而,也有研究證明LPS處理可以抑制細胞自噬,導致細胞功能障礙并誘導器官損傷[38]。本研究發現,LPS處理降低了肉雞腎組織自噬相關基因和蛋白的表達水平,而AA預處理顯著增加LPS誘導的肉雞AKI中自噬相關基因和蛋白的表達水平;此外,免疫熒光結果顯示,AA預處理極顯著地增加了LPS誘導的肉雞AKI中LC3-II蛋白的表達。本研究首次表明AA預處理能通過促進自噬減輕LPS誘導肉雞的AKI。

4 結 論

總之,積雪草酸(AA)通過降低腎氧化應激水平、減少細胞凋亡和促進細胞自噬減輕LPS誘導的肉雞急性腎損傷(AKI),這為AA成為潛在的家禽飼料添加劑提供了有力的理論依據。