光動力療法對兩種黑素瘤細胞遷移與侵襲的影響及作用機制

黎松 張敏 李藹諭 吳亞光

[摘要]目的：初步探究光動力療法（Photodynamic therapy，PDT）對兩種黑素瘤細胞遷移、侵襲的影響及作用機制。方法：取生長至對數期黑素瘤細胞A375和B16-F10，胰酶消化離心后計數后接種至六孔板內，培養使細胞融合度達到80%～90%以上后孵育光敏劑1 mmol/L 5-氨基酮戊酸（5-ALA）2 h后使用635 nm紅光照射治療，根據照射能量的不同分為0 J（對照組）、2.4 J（PDT 2.4J組）、4.8 J（PDT 4.8 J組）。采用劃痕愈合實驗和Transwell侵襲實驗分別檢測不同水平的PDT對B16-F10及A375系兩種細胞遷移和侵襲能力的影響。采用蛋白質印跡法檢測遷移和侵襲相關蛋白[Ki-67、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）]的相對表達量。結果：細胞劃痕和Transwell實驗的結果顯示，PDT處理24 h后，相比對照組，PDT 2.4 J組及PDT 4.8 J組在B16-F10及A375兩種細胞系中，劃痕愈合率及侵襲細胞數目均明顯減少（P＜0.01）；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組的劃痕愈合率及侵襲細胞數目明顯減少（P＜0.01）。兩PDT組在Ki-67、VEGF及MMP9三種蛋白的表達水平上均明顯低于對照組（P＜0.01）；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組在三種蛋白的表達水平上更低（P＜0.01）。結論：光動力治療可顯著抑制黑素瘤細胞系A375和B16-F10的侵襲與遷移能力，其機制可能是光動力治療能夠抑制促腫瘤生長相關因子的釋放有關。

[關鍵詞]光動力療法；黑素瘤細胞；遷移；侵襲

[中圖分類號]R739.7? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）02-0056-04

Effect of Photodynamic Therapy on Migration and Invasion of Two Melanoma Cells and Mechanism of Action

LI Song1，ZHANG Min1，LI Aiyu2，WU Yaguang1

[1.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Army Medical University（South West? Hospital），Chongqing 400038，China; 2.Department of Dermatology，People's Hospital of Shapingba District，Chongqing 400030，China]

Abstract： Objective? A preliminary investigation of the effects and mechanisms of photodynamic therapy （PDT） on the migration and invasion of two types of melanoma cells. Methods? Melanoma cells A375 and B16-F10， which grew to the log stage， were digested and centrifuged by pancreatic enzyme， counted， and inoculated into six-well plates. After culture， cell fusion reached more than 80% to 90%， the cells were incubated with photosensitizer 1 mmol/L 5-aminoketovalerate （5-ALA） for 2 h， and then treated with 635 nm red light irradiation.According to the different irradiation energy， it was divided into 0 J （control group）， 2.4J （PDT 2.4J group）， 4.8J （PDT 4.8J group）. Scratch healing test and transwell invasion test were used to detect the effects of photodynamic therapy on the migration and invasion of melanoma cell lines A375 and B16-F10. Western blotting was used to detect the relative expression of migration and invasion-related proteins [Ki-67， vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9）]. Results? The results of cell scratches and Transwell experiments showed that after 24 hours of PDT treatment， compared with the control group， the scratch healing rate and the invasion of cells in the PDT 2.4 J group and PDT 4.8 J group were in the B16-F10 and A375 cell lines. The number was significantly reduced （P＜0.01）， compared with the PDT 2.4 J group， the scratch healing rate and the number of invaded cells in the PDT 4.8 J group were significantly reduced （P＜0.01）. Compared with the PDT 2.4 J group， the PDT 4.8 J group had the expression levels of the three proteins is lower （P＜0.01）. Conclusion? Photodynamic therapy can significantly inhibit the invasion and migration of melanoma cell lines A375 and B16-F10. The mechanism may be related to the inhibition of the expression of migration and invasion-related proteins.

Key words： photodynamic therapy; melanoma cells; migration; invasion

惡性黑素瘤約占皮膚癌的4%，發病率較低，但其具有高致死率[1]。在極早期，手術切除治療的率可達到90%以上，然而，一旦發生遠處轉移，就很難有效治愈黑素瘤[2-3]。因此，常采用各種治療策略，包括化療、放療、靶向治療、免疫治療以及不同類型治療的組合來治療晚期黑素瘤[4]。常規手術和化療通常會引起免疫抑制作用，使癌細胞逃避免疫監視[5]。靶向療法，免疫治療等新興方法極大地改變了黑素瘤的治療方法，在生存結果方面，免疫療法比發生腫瘤轉移時的任何其他形式的治療具有較好的療效[6]。然而，免疫治療領域仍然存在一些障礙，例如治療耐藥性和可負擔性[7]。除了僅在少數免疫反應性黑素瘤患者中取得有限的成功外，免疫療法可能會導致針對正常組織的嚴重自身免疫。PDT使用無毒光敏劑（Photosensitizer，PSs），通過吸收光而激活，成為PSs的三聯體，與分子氧反應產生細胞毒性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）來殺死癌細胞[8]。故本研究探討光動力療法對黑素瘤細胞遷移、侵襲的抑制作用及機制研究。

1? 材料和方法

1.1 細胞和試劑：A375黑素瘤細胞系及B16-F10為本實驗室長期使用及凍存的細胞株。采用此兩種常用的細胞系進行相互驗證。兩種細胞系在Dulbecco's Modified Eagle's培養基[DMEM，Highveld Biological（Pty）Ltd.，South Africa]中培養，并添加10%（v/v）滅活的胎牛血清[Highveld Biological（Pty）Ltd.]，100 U/ml青霉素（P3032，Sigma，美國）和100 μg/ml鏈霉素（S-91370，Sigma，美國），并在5% CO2、95%濕度、37℃??下孵育。Ki-67抗體，血管內皮生長因子（VEGF）抗體，基質金屬蛋白酶9（MMP9）抗體均購自Abcam公司。

1.2 劃痕實驗：取生長至對數期黑素瘤細胞A375和B16-F10，胰酶消化離心后計數后接種至六孔板內，培養使細胞融合度達到80%～90%以上后孵育光敏劑1 mmol/L 5-氨基酮戊酸（5-ALA）2 h后使用635 nm紅光照射治療，根據照射能量的不同分為0 J（對照組）、2.4 J（PDT 2.4 J組）、4.8 J（PDT 4.8 J組），ALA-PDT分別作用0、12、24 h，拍照并采用Image J測量劃痕愈合面積。

1.3 Transwell實驗：取對數生長期的黑素瘤細胞A375和B16-F10，常規胰酶消化計數后用2%血清培養基把細胞以5×105/ml分別接種到包含8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室內，根據不同分組為單獨小組進行光照能量0 J、2.4 J、4.8 J的處理。下層24孔板的孔內加入含有10%胎牛血清的培養基600μl，置于細胞培養箱中培養24 h，之后取出且用PBS清洗小室3次，小室外的細胞使用4%多聚甲醛固定15 min，1%結晶紫染色15 min，拍照計數，實驗重復3次。

1.4 蛋白質印跡分析：將來自A375和B16-F10的30 ug細胞提取蛋白加載到預制（10% w/v）SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并電轉移到硝酸纖維素膜上（Hybond ECL Amersham，RPN203D，GE）。然后5%脫脂牛奶封閉1 h，在4℃下一抗過夜。第2天，洗滌膜5次，每次10 min，之后加入二抗在室溫下孵育1 h，然后洗膜5次，同上。使用SuperSignal West Pico化學發光ECL檢測試劑（Thermo Scientific Pierce，Waltham，Massachusetts，USA）獲得信號的可視化。計算Ki-67、VEGF、MMP9的表達水平。

1.5 統計學分析：采用SPSS 22.0處理分析數據，計量資料用（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及多因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 光動力療法對黑素瘤細胞遷移、侵襲的影響：細胞劃痕和Transwell實驗的結果顯示，PDT處理24 h后，相比對照組，PDT 2.4 J組及PDT 4.8 J組在B16-F10及A375兩種細胞系中，劃痕愈合率及侵襲細胞數目均明顯減少（P＜0.05）；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組的劃痕愈合率及侵襲細胞數目明顯減少（P＜0.05），表明光動力療法抑制了黑素瘤細胞遷移和侵襲的能力。見表1、圖1。

2.2 光動力療法對黑素瘤細胞中遷移和侵襲相關蛋白表達量的影響：對照組、PDT 2.4 J組及PDT 4.8 J組在兩種細胞系（B16-F10，A375）中相比較發現，PDT 2.4 J組及PDT 4.8 J組在Ki-67、VEGF及MMP9三種蛋白的表達水平上均明顯低于對照組（P＜0.05）；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組在三種蛋白的表達水平上更低（P＜0.05）。見圖2、表2。

3? 討論

皮膚癌常見類型有基底細胞癌、鱗狀細胞癌和皮膚惡性黑素瘤，前兩種類型是通常被稱為非黑素細胞或非侵襲性皮膚癌，因為它們不起源于皮膚黑素細胞，也不會擴散到周圍的健康組織[9-10]。然而，皮膚惡性黑素瘤往往會擴散到周圍組織，因此被認為是具有轉移性、侵襲性的[11]。黑素瘤起源于表皮的最深區域和真皮的起始區域，那里是產生黑色素的黑素細胞所在的區域。因此，它是從單個黑素細胞發展而來的，該細胞要么惡性轉化，要么由于發育不良痣的功能障礙[12-13]。轉移性黑素瘤被認為是皮膚癌Ⅳ期的晚期形式，當表皮中的癌細胞轉移并進展到遠離原發部位的身體其他器官時就會發生[14]。黑素瘤的早期診斷是至關重要的，轉移前的早期階段，因為一旦擴散，很難定位其起源，因此往往會阻礙治療和患者的生存率[15]。黑素瘤的最常見原因歸因于紫外線輻射（Ultraviolet，UV）暴露、家族史和黑素瘤個人史[16]。其具有較高的多藥耐藥性、極低的患者存活率和容易復發的傾向。皮膚惡性黑素瘤是最致命的皮膚癌，占皮膚癌相關死亡的75%以上[17]。盡管目前有多種療法，包括化學療法、免疫療法、放射療法和生物化學療法，但晚期轉移性黑素瘤往往對化學療法難以治愈，5年生存率僅為15%[18-19]。

過去30年來，PDT作為一種非常規的癌癥治療方法得到了廣泛研究。涉及將光敏藥物施用于靶向癌細胞，并將激光定位在適當的波長上用于激發PS[20]。PS的激發導致細胞毒性ROS的產生，例如單線態分子氧、羥基自由基和/或超氧陰離子，通過氧化應激癌細胞實現光細胞毒性，從而誘導對其細胞生物分子（即脂質、蛋白質和核酸）造成損害，使其失去活性[21]。這種非常規的治療方式比傳統的癌癥治療方式侵入性更小，其專門針對癌性腫瘤區域，因此產生局部破壞且副作用有限。PDT的兩種作用機制都發生在依賴氧氣的環境中，兩種類型都產生氧氣[22]。然而，1型反應產生超氧陰離子自由基，而2型反應產生單線態氧。決定這種作用方式的因素包括：PS濃度、PS定位、細胞內三磷酸腺苷的量、細胞的基因組成以及作為激光照射的通量和波長。然而，PDT誘導的免疫刺激作用也與腫瘤損傷相關的急性炎癥密切相關[23]。盡管在非黑素瘤皮膚癌治療方面取得了進展，但PDT治療黑素瘤的應用還沒有得到實質性的推進，主要是由于其有效性受到光線穿透深度差和缺乏理想PS的限制[24]。

在本研究中采用了兩種黑素瘤細胞系，通過細胞劃痕和Transwell實驗的結果顯示，在經過PDT處理24 h后，相比對照組，PDT 2.4 J組及PDT 4.8 J組在B16-F10及A375兩種細胞系中，劃痕愈合率及侵襲細胞數目均明顯減少；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組的劃痕愈合率及侵襲細胞數目明顯減少。這表明隨著劑量以及時間的增加，黑素瘤細胞受抑制程度也隨之增加。張召力等人在B16-F10細胞系中也發現高劑量組抑制遷移和侵襲的能力更強[25]。為了進一步探究相關機理，筆者對相關蛋白進行檢測，發現ALA-PDT組在Ki-67、VEGF及MMP9三種蛋白的表達水平上均明顯低于對照組；相比于PDT 2.4 J組，PDT 4.8 J組在三種蛋白的表達水平上更低。腫瘤血管生成是腫瘤細胞轉移生殖的重要因素，VEGF是促生長因子，能夠加速血管腔的形成[26]。Ki-67與細胞增殖密切相關，其表達水平可反應細胞的增殖活性。MMP9能夠降解細胞外基質，在腫瘤的遷移和侵襲中發揮關鍵作用。在本研究中，PDT處理后，VEGF、Ki-67及MMP9的水平均下降，表明PDT處理能夠抑制促腫瘤生長相關因子的釋放，從而抑制腫瘤細胞的遷移侵襲。

PDT具有成為轉移性黑素瘤理想腫瘤干預的巨大潛力，能夠選擇性地破壞原發腫瘤及其微環境，同時激發免疫系統攻擊任何剩余或復發的黑素瘤細胞。然而，PDT尚未被接受為癌癥患者的一線臨床選擇這一事實主要是因為其效率低下。例如，局部應用5-ALA受到皮膚滲透性差和生物利用度低的限制，僅適用于一些非惡性皮膚癌。未來可能需要將PDT與其他治療策略相結合才能實現癌癥的完全緩解和治愈。

[參考文獻]

[1]Hou Y J，Yang X X，Liu R Q，et al.Pathological mechanism of photodynamic therapy and photothermal therapy based on nanoparticles[J].Int J Nanomedicine，2020，15：6827-6838.

[2]Shivashankarappa A，Sanjay K R.Photodynamic therapy on skin melanoma and epidermoid carcinoma cells using conjugated 5-aminolevulinic acid with microbial synthesised silver nanoparticles[J].J Drug Target，2019，27（4）：434-441.

[3]木尼拉·馬哈德，哈斯也提·艾力，帕麗達·帕拉哈提.miR-3182調控結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的作用機制研究[J].河北醫藥，2021，43（14）：2110-2113.

[4]張學軍，亓發芝.內質網應激蛋白ATF4調控STAT3信號通路促進黑色素瘤細胞生長及轉移的研究[J].中國美容醫學，2018，27（7）：? 83-86.

[5]Baldea I，Giurgiu L，Teacoe I D，et al.Photodynamic therapy in melanoma-where do we stand？ [J].Curr Med Chem，2018，25（40）：5540-5563.

[6]劉星含，許玉君，厲怡，等.靈芝提取物對4種人腫瘤細胞生長的抑制作用及機制研究[J].中國免疫學雜志，2020，36（24）：2976-2980.

[7]地里夏提·庫爾班，陳召.Notch1調控PI3K/AKT信號通路促進黑素瘤細胞發展的研究[J].中國美容醫學，2019，28（1）：93-96.

[8]Naidoo C，Kruger C A，Abrahamse H.Photodynamic therapy for metastatic melanoma treatment： a review[J].Technol Cancer Res Treat，2018，17：1533033818791795.

[9]Mohammadalipour Z，Rahmati M，Khataee A，et al.Differential effects of N-TiO2 nanoparticle and its photo-activated form on autophagy and necroptosis in human melanoma A375 cells[J].J Cell Physiol，2020，235（11）：8246-8259.

[10]李娜，曹娟，郁繼國，等.miR-26a對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖，凋亡，遷移和侵襲的影響及機制研究[J].眼科新進展，2017，37（7）：619-622.

[11]Castro K A D F，Costa L D，Guieu S，et al.Photodynamic treatment of melanoma cells using aza-dipyrromethenes as photosensitizers[J].Photochem Photobiol Sci，2020，19（7）：885-891.

[12]Akasov R A，Sholina N V，Khochenkov D A，et al.Photodynamic therapy of melanoma by blue-light photoactivation of flavin mononucleotide[J].Sci Rep，2019，9（1）：9679.

[13]Lopes S M M，Pineiro M，Pinho E Melo TMVD. Corroles and hexaphyrins： synthesis and application in cancer photodynamic therapy[J].Molecules，2020，25（15）：3450.

[14]Gonzalez Lopez E J，Martínez S R，Aiassa V，et al.Tuning the molecular structure of corroles to enhance the antibacterial photosensitizing activity[J].Pharmaceutics，2023，15（2）：392.

[15]Pereira N A M，Laranjo M，Pina J，et al.Advances on photodynamic therapy of melanoma through novel ring-fused 5，15-diphenylchlorins[J].Eur J Med Chem，2018，146：395-408.

[16]de Souza V B，da Rocha V N，Piquini P C，et al.Effects of substituents on the photophysical/photobiological properties of mono-substituted corroles[J].Molecules，2023，28（3）：1385.

[17]Lamberti M J，Mentucci F M，Roselli E，et al.Photodynamic modulation of type 1 interferon pathway on melanoma cells Promotes Dendritic Cell Activation[J].Front Immunol，2019，10：2614.

[18]Nguyen K，Khachemoune A.An update on topical photodynamic therapy for clinical dermatologists[J].J Dermatolog Treat，2019，30（8）：732-744.

[19]Alemayehu A B，Ghosh A.Phenol and resorcinol-appended metallocorroles and their derivatization with fluorous tags[J].Sci Rep，2022，12（1）：19256.

[20]Tanaka T，Ueta K，Osuka A.Development of the peripheral functionalization chemistry of meso-free corroles [J]. Chemistry， 2021，27（63）：15605-15615.

[21]熊斯穎，楊艷，邵蕾等.淺表切削聯合光動力療法治療面部鱗狀細胞癌的療效與安全性探析[J].中國美容醫學，2020，29（8）：59-61.

[22]Li Z，Wang C，Deng H，et al.Robust Photodynamic therapy using 5-ALA-incorporated nanocomplexes cures metastatic melanoma through priming of CD4+CD8+ double positive t cells[J].Adv Sci （Weinh），2019，6（5）：1802057.

[23]Negri L B，Martins T J，da Silva R S，et al.Photobiomodulation combined with photodynamic therapy using ruthenium phthalocyanine complexes in A375 melanoma cells： Effects of nitric oxide generation and ATP production[J].J Photochem Photobiol B，2019，198：111564.

[24]Yang W，Zhang F，Deng H，et al.Smart nanovesicle-mediated immunogenic cell death through tumor microenvironment modulation for effective photodynamic immunotherapy[J].ACS Nano，2020，14（1）：620-631.

[25]張召力，李淑香.光動力療法對黑色素瘤細胞遷移、侵襲的影響及作用機制[J].癌癥進展，2021，19（12）：1211-1213，1253.

[26]Nackiewicz J，Kliber-Jasik M，Skonieczna M.A novel pro-apoptotic role of zinc octacarboxyphthalocyanine in melanoma me45 cancer cell's photodynamic therapy （PDT） [J].J Photochem Photobiol B，2019，190：146-153.

[收稿日期]2023-05-11

本文引用格式：黎松，張敏，李藹諭，等.光動力療法對兩種黑素瘤細胞遷移與侵襲的影響及作用機制[J].中國美容醫學，2024，33（2）：56-59.