產朊假絲酵母發酵蛋白桑的培養基優化

侯俊豪，陳帥君，吳 疆，米琴娜，張熙凱，童應凱

天津農學院農學與資源環境學院生物技術系 天津 300384

0 引 言

蛋白質桑樹又稱飼料桑樹，是我國的一種優質蛋白桑樹品種。桑葉寬而豐滿，具有極其豐富的營養物質，粗蛋白質含量20%～30%，桑樹分支上的蛋白質有8%以上，碳水化合物含量0%～5%，還含有17 種氨基酸及鉀、鈣、銅、鋅、錳、VC、VB和VA，尤其是脫氧核糖核酸。脫氧核糖核酸是一種很強的葡萄糖苷酶抑制劑，具有抑制糖轉化、提高人體免疫力和抗病性等藥理作用［1-2］。桑樹葉含有豐富的蛋白質、脂肪酸、碳水化合物、纖維素及多種維生素［3］和礦物質。經過提取工藝優化，蛋白桑的蛋白質提取率可達40%以上，粗蛋白的含量與大多數豆科類牧草非常接近，但粗纖維含量更低，鑒于此，蛋白桑飼料［4-5］的研究和開發利用成為熱點。將桑葉加入斷奶仔豬的飼料中可提高仔豬的抗氧化能力和抗病能力［6］。李玉榮［7］的研究報道中提到，在保育豬的飼料中添加5%的新鮮桑葉后，豬群的腹瀉率降低，血清中尿素氮含量提高，血糖和總膽固醇含量降低，能夠提高豬的生長能力，并具有較強的抗痢性。王崇洲等［8］的研究結果表明，在肉兔飼料中加入15%的桑葉能顯著提高肉兔的全凈膛和半凈膛率，以及肌肉中脂肪、蛋白質、風味氨基酸等的含量，肉色紅度、亮度和肌肉pH顯著升高。在日糧中添加桑葉粉后，泌乳水牛的生長激素、催乳素和甲狀腺素等激素的分泌增加，日產奶量、乳汁中蛋白質和脂肪含量顯著升高［9］。研究發現，在肉羊飼糧中添加桑葉能夠降低羊肉膻味，提高熟肉率和嫩度，肉中蛋白質和脂肪等營養物質含量也有明顯提升［10］。

在當前優質牧草資源嚴重短缺、飼料價格上漲的背景下，把桑葉作為新型的飼料資源，不僅能提高利用率，還能提升蠶桑體系的綜合經濟效益。但桑葉中存在單寧、植酸等抗營養因子，攝入過多會使牲畜的攝取能力受到限制，最終使其生長能力下降。發酵、蒸煮等能在一定程度上降低豆科作物中的單寧、植酸等抗營養因子含量，但如何降低或消除桑葉中的抗營養因子，且將桑葉更好地應用于動物飼料，需要進一步深入探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產朊假絲酵母，保藏于天津農學院生物技術系微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

加入主原料10 g（其中含8 g 蛋白桑及2 g 麩皮），以此為培養基底物，加入一定量的蒸餾水。

1.1.3 供試材料

蛋白桑粉：市場購蛋白桑，60 ℃烘干2 h后粉碎獲得。

1.2 單因素試驗

1.2.1 確定最佳KH2PO4用量

根據上文1.1.2 培養基的配方，在已有原料的基礎上分別加入0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 g KH2PO4。按照培養基制備方法進行試驗。試驗結束后，在40 倍光學顯微鏡下，用血球計數法測定產朊假絲酵母菌的菌數，以確定最佳的KH2PO4用量。重復試驗3 次。

1.2.2 確定最佳（NH4）2SO4用量

根據上文1.1.2 培養基的配方，在已有原料的基礎上分別加入0.05、0.1、0.15 g的（NH4）2SO4固體顆粒。按照培養基制備方法進行試驗。試驗結束后，在40 倍光學顯微鏡下，用血球計數法測定產朊假絲酵母菌的菌數，以確定最佳的（NH4）2SO4用量。重復試驗3 次。

1.2.3 確定最佳MgSO4用量

根據上文1.1.2 培養基的配方，在已有原料的基礎上分別加入0.5、1、1.5 g MgSO4。按照培養基制備方法進行試驗。試驗結束后，在40 倍光學顯微鏡下，用血球計數法測定產朊假絲酵母菌的菌數，以確定最佳的MgSO4用量［11］。重復試驗3 次。

1.2.4 確定最佳葡萄糖用量

根據上文1.1.2 培養基的配方，在已有原料的基礎上分別加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g 的葡萄糖固體顆粒。按照培養基制備方法進行試驗。試驗結束后，在40 倍光學顯微鏡下，用血球計數法測定產朊假絲酵母菌的菌數，以確定最佳的葡萄糖用量。重復試驗3 次。

1.2.5 確定最佳加水量

根據上文1.1.2 培養基的配方，在已有原料的基礎上分別加入0.1 g（NH4）2SO4、0.01 g KH2PO4、0.6 g葡萄糖、0.001 g MgSO4，改變培養基中蒸餾水的添加量為10、12、14、16、18、20 mL。按照培養基制備方法進行試驗。試驗結束后，在40 倍光學顯微鏡下，用血球計數法測定產朊假絲酵母菌的菌數，以確定最佳加水量。重復試驗3 次。

1.3 正交試驗

1.3.1 對添加劑的正交試驗

根據單因素試驗結果，為探究產朊假絲酵母的最適宜生長條件、優化培養基配方，進行KH2PO4、蒸餾水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO4五因素四水平 L16（45）正交試驗，正交因素水平設計見表1，正交處理表見表2。按照上文1.1.2 中的培養基制備方法進行發酵。發酵結束后，使用40 倍光學顯微鏡，用血球計數板進行計數，得到產朊假絲酵母菌菌數，最后篩選出最優組合。

表1 產朊假絲酵母菌發酵正交水平Tab.1 Orthogonal fermentation level of Candida utilis

表2 產朊假絲酵母菌發酵正交處理表Tab.2 Orthogonal fermentation treatment table of Candida utilis

1.3.2 正交試驗準確性驗證

在單因素試驗的基礎上，根據正交試驗結果，得到產朊假絲酵母菌的培養基最佳配方。重復試驗3 次，驗證其準確性。

1.4 產朊假絲酵母菌菌數的測定方法

取一支50 mL的離心管,在離心管中加入1 g培養好的樣品，加入蒸餾水至30 mL，旋渦振蕩儀振蕩3 min左右，振蕩結束后用移液管吸取1 mL樣品加入10 mL 刻度試管，加蒸餾水至10 mL，振蕩混勻，用微量移液器吸取100 μL菌液在血球計數板上，用40 倍光學顯微鏡觀察和計數。公式如下：

酵母細胞數值/1 g=（80 個小方格細胞總數/80×400×104×稀釋倍數）/樣品量

1.5 數據處理方法

利用顯微鏡和血球計數板測定產朊假絲酵母菌的菌數。利用Excel軟件，算出平均值和極差，并繪制柱形圖。利用SPSS數據處理軟件，處理數據的計算標準差、相關性和顯著性。

2 結果與分析

2.1 KH2PO4 對產朊假絲酵母菌發酵的影響

為了探究KH2PO4含量對產朊假絲酵母發酵的影響，設置了以下幾組不同的KH2PO4含量試驗，結果見圖1。

圖1 KH2PO4 對酵母菌發酵的影響Fig.1 Effect of KH2PO4 on yeast fermentation

在培養基中加入KH2PO4，磷和鉀是微生物生長繁殖所必需的因素。KH2PO4整體呈現弱酸性，在培養基中具有緩沖液作用，能夠維持酵母菌生長繁殖所需要的離子環境。當KH2PO4加入量過多時，培養基中pH波動幅度較大，導致酵母菌數量減少。

后續正交試驗中的KH2PO4水平選取0.015 g及其左右的數值濃度（即0.01、0.015、0.02、0.025 g）進行。

2.2 (NH4)2SO4 對產朊假絲酵母菌發酵的影響

為了探究（NH4）2SO4含量對產朊假絲酵母發酵的影響，設置了以下幾組不同的（NH4）2SO4含量試驗，試驗結果見圖2。

圖2 （NH4）2SO4 對酵母菌發酵的影響Fig.2 Effect of（NH4）2SO4 on yeast fermentation

在發酵過程中，產朊假絲酵母菌消耗碳源，產生酸性物質，導致培養基中的酸堿環境發生變化，影響產朊假絲酵母菌的生長繁殖。（NH4）2SO4是一種酸性鹽，其中的銨離子是緩沖離子，在為培養基提供氮源的同時，也作為緩沖液調節培養基中的酸堿平衡。當（NH4）2SO4加入量過多時，產朊假絲酵母菌的生長繁殖速率下降，產朊假絲酵母菌數量也因此減少。

后續正交試驗中的（NH4）2SO4水平選取0.1 g及其左右的數值濃度（即0、0.05、0.1、0.15 g）進行。

2.3 MgSO4 對產朊假絲酵母菌發酵的影響

為了探究MgSO4含量對產朊假絲酵母發酵的影響，設置了以下幾組不同試驗，結果見圖3。

圖3 MgSO4 對酵母菌發酵的影響Fig.3 Effect of MgSO4 on yeast fermentation

MgSO4中含有大量的鎂離子，鎂離子是一種活化劑，能夠為產朊假絲酵母菌的生長繁殖提供無機營養元素。MgSO4可促進培養過程中各反應的進行，能夠加快產朊假絲酵母菌的生長繁殖速度，使培養基上產朊假絲酵母菌的菌數增多。當MgSO4加入量過多時，培養基中鹽含量較高，細胞的滲透壓增大，導致酵母菌失水死亡，使產朊假絲酵母菌菌數減少。

后續正交試驗中的MgSO4水平選取0.001 g及其左右的數值濃度（即0、0.000 5、0.001、0.001 5 g）進行。

2.4 葡萄糖對產朊假絲酵母菌發酵的影響

為了探究葡萄糖含量對產朊假絲酵母菌發酵的影響，設置了以下幾組不同葡萄糖含量試驗，試驗結果見圖4。

圖4 葡萄糖對酵母菌發酵的影響Fig.4 Effect of glucose on yeast fermentation

葡萄糖在產朊假絲酵母的發酵培養基中有重要作用。發酵系統中，葡萄糖為主要供能物質。在培養基中，葡萄糖為碳源，能為產朊假絲酵母菌的生長繁殖提供所需要的營養物質。發酵過程中，將葡萄糖轉化為其他物質，作為原料可以使反應繼續順利進行。葡萄糖濃度過高會抑制菌體的生長繁殖，導致產朊假絲酵母菌的菌數減少。

后續正交試驗中的葡萄糖水平選取0.9 g及其左右的數值濃度（即0.6、0.9、1.2、1.5 g）進行。

2.5 加水量對產朊假絲酵母菌發酵的影響

為了探究水的含量對于產朊假絲酵母發酵的影響，設置了以下幾組不同的加水量試驗，試驗結果見圖5。

圖5 加水量對酵母菌發酵的影響Fig.5 Effect of water addition on yeast fermentation

水是微生物生長所必需的物質。本次試驗中，在培養基中加入一定量的蒸餾水，為產朊假絲酵母菌提供良好的生長繁殖環境，同時將其作為溶劑，溶解培養基中的蛋白桑、麩皮和無機鹽。加入蒸餾水后，讓培養基中各組分充分混合均勻。但若添加量過多會導致培養基中各物質的濃度降低，從而影響酵母菌的生長繁殖速率，使得產朊假絲酵母菌的菌數減少［12］。

后續正交試驗中的水添加量水平選取16 mL及其左右的數值（即12、14、16、18 mL）進行。

2.6 正交試驗結果分析

根據單因素試驗結果，對5 個單因素進行正交試驗，測定產朊假絲酵母菌數量，最終數據見表3、4。

表3 正交試驗結果及標準差Tab.3 Orthogonal experimental results and standard deviation

葡萄糖在發酵過程中能提供碳源，是影響酵母菌發酵最主要的因素［13］，可在產朊假絲酵母菌發酵的培養基中（NH4）2SO4作為氮源存在，在整個發酵過程中具有重要作用。KH2PO4呈弱酸性，在培養基中可作為緩沖液，能夠維持酵母菌生長繁殖所需要的離子環境，也會在一定程度上對產朊假絲酵母菌的生長繁殖產生影響［14］。MgSO4作為活化劑，促進發酵過程中各種反應的進行。由表3 可知，葡萄糖、水和（NH4）2SO4的含量呈正相關，而MgSO4和KH2PO4的含量與測試結果呈負相關。由表4 可知，5 個因素對產朊假絲酵母菌數量的影響都極顯著（P＜0.01）。

表4 5 個因素對產朊假絲酵母菌菌數影響的方差分析Tab.4 Variance analysis of influence of five factors on number of Candida utilis

由表3 中K值分析可知，產朊假絲酵母菌最佳培養基配方為1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸餾水，經3 次重復得到的菌數平均值為10.05 億/g。

3 結 語

本試驗主要是對桑葉進行研究，以產朊假絲酵母粉為發酵菌種，發酵培養基中的底物為8 g蛋白桑和2 g麩皮，對KH2PO4、蒸餾水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO45 種單因素進行正交試驗，根據結果，得到發酵產朊假絲酵母的最佳培養基中各種微量元素的含量為1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸餾水。在120 ℃下滅菌25 min，冷卻至室溫，加入0.1 g的產朊假絲酵母粉，置于電熱恒溫培養箱中28 ℃培養48 h，此時得到的產朊假絲酵母菌數量最多、產朊假絲酵母能在最佳條件下生長繁殖，菌數能夠達到10.05 億/g酵母菌?！?/p>