萸連丸對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎小鼠記憶性濾泡輔助性T 細胞的調節作用

周文，張哲言，黃莉，鄧柏齡，劉端勇，陳文瀟，趙海梅（.南昌醫學院/江西省衛生健康藥效與安全性評價重點實驗室，江西南昌 005；.江西中醫藥大學研究生院，江西南昌 000；.江西中醫藥大學中醫學院，江西南昌 000；.江西中醫藥大學方證研究中心，江西南昌 000）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種病因和發病機制尚不完全清楚的慢性非特異性直結腸炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）。IBD在我國的發病率和流行率逐年攀升，因其病因復雜多樣、病程遷延漫長、復發率高且病變程度差異大[1]，已成為難治性消化系統疾病之一[2]。濾泡輔助性T 細胞（Follicular T helper cell，Tfh）可以幫助B 細胞產生有效和持久的免疫應答以對抗抗原的侵襲，在免疫反應中起關鍵作用；Tfh 細胞功能異常時，可導致在清除外來抗原的同時誘導自身反應性抗體的產生，從而引發抗體介導的自身免疫性疾病[3]。大多數學者認為Tfh 細胞介導的免疫功能失調與炎癥性腸病的發生發展密切相關[4]，而記憶性濾泡輔助性T 細胞（Memory follicular T helper cell，mTfh）與Tfh 細胞相似，在體內通過同源抗原的再刺激后協助記憶B細胞快速增殖并分化為漿細胞[5]，因此推測mTfh細胞失衡與潰瘍性結腸炎的發生發展相關。

萸連丸出自《百一選方》卷六，名見于《證治要訣類方》卷四，由黃連和吳茱萸按1∶1 組成。黃連清熱燥濕、解毒瀉火，吳茱萸散寒止痛、降逆止嘔，兩者寒熱并用、辛開苦降，主治瀉泄和痢疾。近年來有不少研究表明，黃連和吳茱萸可通過免疫代謝途徑有效治療潰瘍性結腸炎[6]；左金丸（黃連∶吳茱萸=6∶1）可能通過調控Tfh/Tfr 細胞平衡，以及結腸組織的Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達水平來改善潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜損傷[7]。萸連丸能否通過影響mTfh 細胞亞群水平來發揮對潰瘍性結腸炎的治療效果尚不清楚。故本研究擬通過探討萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠mTfh 細胞亞群水平的調控作用，為萸連丸治療潰瘍性結腸炎的免疫藥理學研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 9 周齡雄性BALB/c 小鼠，SPF 級，體質量（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019- 0004，動物質量合格證號：430727210100896848。動物飼養于江西中醫藥大學動物科技中心，恒溫（20～26 ℃）、恒濕（相對濕度40%～70%），全價標準飼料喂養，適應性飼養1周后開始實驗。本動物實驗經過江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批文號：JZLLSC20210160。

1.2 藥物及試劑 黃連，黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號：D21030104；吳茱萸，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號：2109003；吳茱萸、黃連經江西中醫藥大學藥學院胡生福教授鑒定分別為吳茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）的干燥成熟果實和黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖。美沙拉嗪腸溶片，葵花藥業集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號：201121；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量為36 000～50 000），蘇州天可公司，批號：025K2021；白細胞介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（貨號：MM-3660302）、白細胞介素15（IL-15）ELISA 試劑盒（貨號：MM-0172M2），均購自江蘇酶免實業有限公司；流式熒光抗體Anti-mouse APC-Cy7-CD4（貨號：552051）、Anti-mouse APC-CCR7（貨號：565868）、Anti-mouse FITC-CXCR5（貨號：560577）、Anti-mouse PE-Cy7-CD62L（貨號：560516）、Anti-mouse PE-GL7（貨號：561530），均購自美國BD公司；WB抗體Anti-rabbit-AMPK-α（貨號：AF6423）、Anti-rabbit-p-AMPK-α（貨號：AF3423），均購自美國Affinity Biosciences公司；WB抗體Anti-rabbit-Roquin-1/2 clone 3F12 Antibody，德國Merck 公司，貨號：MABF288；WB 抗體Antirabbit -GAPDH，英國Abcam公司，貨號：ab181602；糞便隱血（FOB）檢測試劑盒，珠海貝索生物公司，貨號：B210102。

1.3 主要儀器 3001-1950 型全波長多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；170-3930 型半干轉膜儀、041BR137750 型電泳儀，美國BIO-RAD 公司；FluorChem M 型凝膠成像系統，美國ProteinSimple 公司；FACS-CantoⅡ型流式細胞儀，美國BD公司。

1.4 藥物制備 取一定量的吳茱萸飲片，常規水煎煮3 次后過濾去渣，將濾液合并后濃縮至適量；將黃連飲片與吳茱萸水煎液按生藥1∶1 的比例攪拌燜潤，待水煎液被完全吸收后置于烘箱中烘干（100 ℃、2 h）；用多功能粉碎機將萸黃連粉碎后過2 號篩，備用；使用前以雙純水配制成濃度為0.025 g·mL-1的萸連丸溶液。用多功能粉碎機將美沙拉嗪腸溶片粉碎，用雙純水配制成濃度為0.015 g·mL-1的美沙拉嗪溶液。

1.5 分組、模型復制及給藥 將40 只BALB/c 小鼠隨機分為正常組、模型組、萸連丸組和美沙拉嗪組，每組10 只。參考相關研究[8]方法復制DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型：適應性喂養1周后，正常組小鼠給予正常飲用水，其余各組小鼠給予3% DSS 溶液自由飲用7 d，在第8 天開始改為正常飲用水；小鼠飲用DSS溶液后，每天進行糞便隱血試驗。模型復制成功標準：采用貝索試紙法進行糞便隱血試驗，檢測小鼠糞便中有無血紅蛋白，評分≥2 分即表明小鼠糞便潛血陽性，腸道出血、潰瘍形成即可入組，否則排除入組。模型復制后第8天開始，按動物與人的體表面積換算給藥劑量，萸連丸組給予0.5 g·kg-1萸連丸溶液灌胃，美沙拉嗪組給予0.3 g·kg-1美沙拉嗪溶液灌胃，給藥體積均為20 mL·kg-1，正常組及模型組給予等容積生理鹽水灌胃，每日1 次，連續7 d。實驗過程每天記錄小鼠的精神狀態和體質量情況。

1.6 樣本采集 第15 天以戊巴比妥鈉麻醉小鼠，冰上分離結腸、脾臟組織。將結腸組織自然鋪展于冰袋上，測量小鼠回盲部至肛門的結腸長度；用預冷的PBS緩沖液沖洗腸內容物并吸干水分，稱取結腸質量，計算：結腸質量指數（%）=結腸質量（g）/小鼠體質量（g）×100%。將制備切片所需的距肛門3 cm 的結腸組織樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定保存；剩余結腸組織分裝至凍存管并立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.7 結腸組織病理形態學觀察 4%多聚甲醛溶液固定1 周后，取0.5 cm 左右結腸組織；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，經65 ℃石蠟浸泡1.5 h 后包埋，制備4 μm 切片；切片脫蠟后進行常規HE 染色，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察結腸組織病理變化[9]。

1.8 ELISA 法測定結腸組織中IL-6、IL-15 的表達水平 將結腸組織充分剪碎后，按100∶1∶1的比例分別加入RIPA 裂解液、Cocktail 和PMSF；在4 ℃冰箱中孵育40 min 后，用超聲勻漿機研磨至充分裂解；置于高速冷凍離心機中以13 000 r·min-1（離心半徑=14 cm）離心40 min，取上清。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，使用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度值，計算IL-6、IL-15的表達水平。

1.9 流式細胞術測定脾臟組織中mTfh 細胞亞群的表達情況 分離小鼠脾臟組織并研碎，加入紅細胞裂解液，避光孵育15 min，制備單細胞懸液。取100 μL脾臟單細胞懸液于EP 管中，加入1 μg FC Block 阻斷封閉，4 ℃下避光孵育5 min。加入相應體積的表面流式抗體CD4-APC-Cy7、CXCR5-FITC、CCR7-APC、CD62L-PE-Cy7、GL7-PE，混勻；室溫下避光孵育30 min 后，用1 mL 1×Perm/Wash Buffer 洗滌2 次；加入500 μL Stain Buffer，定容后上機檢測。采用FlowJo V10軟件分析流式結果。

1.10 Western Blot 法測定結腸組織中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表達水平 制備結腸組織上清液，采用BCA 法測定樣本蛋白濃度，并計算上樣量。采用8%～10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并將其轉移至裁剪好的PVDF 膜上；5% BSA封閉2 h后，加入一抗［Roquin-1（1∶800）、AMPK-α（1∶1 500）、p-AMPK-α（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃搖床孵育過夜；TBST溶液洗滌3次后，加入二抗（1∶10 000），室溫下孵育75 min，再洗滌后曝光并顯影；采用ImageJ圖像分析軟件測定各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.11 統計學處理方法 采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析；計量資料以均數±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠體質量、結腸長度、結腸質量及結腸質量指數的影響 結果見表1 。正常組小鼠精神狀態良好，反應敏捷，善食好動，大便性狀正常。與正常組比較，模型組小鼠精神萎靡，毛色暗淡，拱背聚群，食欲不佳，大便不成形，體質量顯著下降（P＜0.01），結腸長度顯著縮短（P＜0.01），結腸質量明顯增加（P＜0.05），結腸質量指數顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，萸連丸組及美沙拉嗪組小鼠的體質量明顯上升（P＜0.05），結腸長度顯著延長（P＜0.01），結腸質量明顯降低（P＜0.05），結腸質量指數顯著下降（P＜0.01），小鼠精神狀態及大便性狀得到改善。結果表明，萸連丸可有效改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的癥狀。

表1 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠體質量、結腸長度、結腸質量及結腸質量指數的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of Yulian Pills on body mass，colon length，colon mass and colon mass index of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

表1 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠體質量、結腸長度、結腸質量及結腸質量指數的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of Yulian Pills on body mass，colon length，colon mass and colon mass index of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組萸連丸組美沙拉嗪組劑量/（g·kg-1）--0.5 0.3體質量/g 22.56±0.93 20.93±1.05**22.98±1.54#22.03±0.77#結腸長度/cm 9.85±0.39 8.46±0.34**9.61±0.38##9.23±0.51##結腸質量/g 0.25±0.01 0.26±0.01*0.25±0.01#0.22±0.03#結腸質量指數/%1.10±0.02 1.28±0.01**1.12±0.03##1.00±0.11##

2.2 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理形態的影響 結果見圖1。正常組小鼠結腸組織腸壁未見充血、水腫和增厚，黏膜光滑且腺體規整，腸上皮細胞排列整齊，隱窩結構完整，無炎性細胞浸潤與潰瘍。與正常組比較，模型組小鼠腸壁有所增厚且伴有充血水腫，腸壁完整性被破壞，腺體紊亂，腸上皮細胞排列錯亂，隱窩結構變形，大量炎性細胞浸潤和潰瘍形成，結腸組織病理損傷嚴重。與模型組比較，萸連丸組及美沙拉嗪組小鼠的腸上皮細胞有不同程度修復，部分腺體增生，伴少量炎性細胞浸潤與潰瘍，結腸組織病理損傷得到較明顯改善。結果表明，萸連丸可有效改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織黏膜損傷。

圖1 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理變化的影響（HE 染色）Figure 1 Effect of Yulian Pills on histomorphological changes in the colon of mice with ulcerative colitis（HE staining）

2.3 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中IL-6、IL-15 表達的影響 結果見表2。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中的促炎細胞因子IL-6、IL-15 表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，萸連丸組及美沙拉嗪組小鼠結腸組織中的IL-6、IL-15 表達水平顯著降低（P＜0.01）。結果表明，萸連丸能明顯抑制DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中的促炎細胞因子IL-6、IL-15的表達水平。

表2 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中IL-6、IL-15表達的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Yulian Pills on the expressions of IL-6 and IL-15 in the colonic tissue of mice with ulcerative（±s，n=10）

表2 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中IL-6、IL-15表達的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Yulian Pills on the expressions of IL-6 and IL-15 in the colonic tissue of mice with ulcerative（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別正常組模型組萸連丸組美沙拉嗪組劑量/（g·kg-1）--0.5 0.3 IL-6/（pg·mL-1）205.37±46.38 279.18±56.19**166.71±40.49##200.77±62.92##IL-15/（pg·mL-1）3 491.94±653.19 4 308.81±626.52**2 479.14±575.23##2 559.48±671.04##

2.4 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠脾臟組織中mTfh細胞亞群表達的影響 結果見圖2。與正常組比較，模型組小鼠脾臟組織中CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+細胞表達水平均顯著升高（P＜0.01），而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+細胞表達水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，萸連丸組及美沙拉嗪組小鼠脾臟組織中CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+細胞表達水平顯著降低（P＜0.01），而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+細胞表達水平顯著升高（P＜0.01）。結果表明，萸連丸可有效調節DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠脾臟組織中mTfh細胞亞群GL7、CD62L的表達水平。

圖2 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠脾臟組織中mTfh 細胞亞群表達的影響（x ±s，n=10）Figure 2 Effect of Yulian Pills on the expression of mTfh cell subpopulation in spleen of mice with ulcerative colitis（x ±s，n=10）

2.5 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表達的影響 結果見圖3。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，萸連丸組及美沙拉嗪組小鼠結腸組織中的Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，萸連丸能夠促進DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中Roquin-1/AMPK-α 通路的活化。

圖3 萸連丸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表達的影響（±s，n=10）Figure 3 Effect of Yulian Pills on the protein expressions of Roquin-1，AMPK-α and p-AMPK-α in the colonic tissue of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

3 討論

根據潰瘍性結腸炎（UC）的臨床表現，可將其歸屬于中醫學的“腸澼”“便血”“泄瀉”“痢疾”等疾病范疇。該病多因先天稟賦不足，后天失養，陰陽失調，加之感受外邪導致反復發作，脾虛肝旺為其主要病機之一[10]。根據法隨證立、方從法出的原則，常選擇萸連丸用于治療肝脾失調型潰瘍性結腸炎。研究[11]表明，萸連丸及其有效組分具有抗炎、抑菌等藥理作用，可通過修復腸道黏膜損傷治療潰瘍性結腸炎。本研究結果顯示，萸連丸可有效改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的癥狀，結腸組織病理損傷得到較明顯改善。

免疫記憶是免疫反應的核心法則，清除完抗原之后少部分未凋亡的效應性T細胞可進一步分化為效應記憶性T 細胞（Effector memory T cells，Tem）和中央記憶性T細胞（Central memory T cells，Tcm），兩者以CD4+/CD8+來區分[12]。同樣mTfh 細胞在受到抗原刺激前會較長時間有效存活于體內并處于休眠狀態，當再次遇到同源抗原時會重新激活發揮免疫作用[13]。因此，mTfh 細胞在長效的抗體記憶反應中扮演重要角色。而免疫記憶功能的紊亂是潰瘍性結腸炎反復發作的主要原因之一，因此，mTfh 細胞及其亞群的平衡是治療潰瘍性結腸炎的重要策略之一。研究[14]發現，黃芪多糖能夠通過干預ATP/P2X7R 信號調控Tfh、mTfh 細胞及其亞群之間的平衡，從而對慢性潰瘍性結腸炎小鼠發揮治療作用。姜黃素能夠通過調控結腸炎小鼠mTfh 細胞及其亞群細胞mTfh1/mTfr/mTfh17 的數量和比例，維持其平衡，進而減輕肥胖小鼠結腸炎的炎癥反應和腸道黏膜損傷[15]。Tfh（CD4+CXCR5+T）細胞代表了一個新的輔助T 細胞亞群，根據表面趨化因子受體（CCR7）表達水平不同，可將mTfh 細胞分為中樞型記憶性Tfh 細胞（Central memory follicular T cells，Tcm-Tfh）和效應型記憶性Tfh 細胞（Effector memory follicular T cells，Tem-Tfh）2 種不同表型，即CD4+CXCR5+CCR7+T 細胞和CD4+CXCR5+CCR7-T 細胞。在本研究中對2 種不同表型的mTfh 細胞亞型進行了檢測，結果發現萸連丸治療后潰瘍性結腸炎小鼠脾臟組織中的CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+細胞表達水平顯著下降，而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+細胞表達水平明顯上升。結果表明，萸連丸可抑制潰瘍性結腸炎小鼠的Tem-Tfh 細胞水平，促進Tcm-Tfh 細胞水平，通過維持其穩態進而有效緩解潰瘍性結腸炎的炎癥反應。

Tfh 經典的分化路徑始于樹突狀細胞對初始CD4+T細胞的活化，IL-6與其受體相互作用，可誘導活化的CD4+T 細胞中BCL-6 的表達，因此IL-6 是誘導Tfh分化的關鍵性細胞因子[16]。另外，Roquin-1（Rc3h1）、Roquin-2（Rc3h2）蛋白能夠抑制參與Tfh 細胞分化和遷移的ICOS 的表達，以下調BCL-6 表達，進而限制自發性Tfh細胞的分化和生發中心的形成，且ICOS和IL-6 存在協同作用，參與Tfh 細胞的分化[17]。研究[18]發現，在DSS 誘導的結腸炎模型中，Tfh 細胞炎癥浸潤與結腸組織病理學損傷評分呈正相關。因此，IL-6作為誘導Tfh 細胞分化的核心細胞因子在潰瘍性結腸炎模型組中表達水平升高，治療后其表達水平降低；而Roquin-1/2 蛋白負調控mTfh 細胞的分化，其在潰瘍性結腸炎模型組中表達水平降低，治療后表達水平升高，與本研究結果一致。AMPK 是細胞能量代謝的關鍵分子，與炎癥的發生發展密切相關[19]。有研究[20]表明，四神丸可通過激活AMPK 來恢復細胞能量感應功能，進一步維持細胞能量穩態，以改善DSS誘導的結腸炎小鼠的結腸黏膜屏障損傷。在本研究中，經萸連丸治療后，潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中AMPK-α、p-AMPK-α蛋白表達水平明顯升高，提示萸連丸可能通過調控AMPK信號以糾正細胞能量代謝紊亂，進而修復腸道黏膜屏障。有研究顯示，Roquin-1 和AMPK-α 可直接相關且兩者相互作用[21-22]，促炎細胞因子IL-15 在潰瘍性結腸炎患者腸道黏膜中的表達水平明顯高于正常人群[23]，與本研究結果一致。結果表明，萸連丸可能是通過激活Roquin-1/AMPK-α 信號通路，下調炎性細胞因子IL-6、IL-15 表達來實現對DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的治療作用。

綜上所述，萸連丸對DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎具有治療作用，能夠改善結腸組織病理損傷，可能與激活Roquin-1/AMPK-α 信號通路，下調炎性細胞因子IL-6、IL-15表達，調控mTfh細胞亞群穩態有關。但由于mTfh 細胞分離技術還不夠成熟，尚未進行相關蛋白在靶細胞上表達水平的驗證，且萸連丸調節mTfh 細胞的物質基礎和作用靶點還有待進一步研究。