酶法制備野黃芩素的工藝研究

程雨婕，劉云華，黃志芳，陳燕，劉玉紅，易進海（1. 成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611130；. 四川省中醫藥科學院中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室，四川成都 610041）

野黃芩素為4’，5，6，7-四羥基黃酮，其7-O-β-葡萄糖醛酸苷為野黃芩苷。野黃芩苷具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、改善心腦缺血、神經保護等多種藥理作用[1-4]，但其口服生物利用度低、體內半衰期短[5-7]。而野黃芩素具有更強的生物活性、口服易于吸收[4，8]，與野黃芩苷相比，其相對生物利用度為301.8%[9]，具有更好的藥用價值。野黃芩素在植物中的含有量很低，難以從相關植物中大量提取。目前野黃芩素主要采用化學合成[10-12]和酸水解[13-14]等方法制備，但多存在使用有毒溶劑、副產物多、高溫、操作復雜、成本高等缺點，因此亟需尋找新的野黃芩素制備途徑。相較于野黃芩素，野黃芩苷的來源較為豐富，廣泛分布于唇形科黃芩屬和菊科飛蓬屬植物中，因此，可從含有量相對較高的植物如燈盞細辛（燈盞花）中獲取野黃芩苷，再通過生物轉化的方法獲得野黃芩素[15]。黃芩莖葉葡萄糖醛酸水解酶（Scutellaria baicalensis stems and leaves glucuronic hydrolase，sbslGUS）是一類能夠水解β-葡萄糖醛酸苷鍵的酶，本課題組前期已對sbslGUS 進行了提取工藝研究，并利用sbslGUS 酶解黃芩苷制備黃芩素。本研究提取燈盞花中的野黃芩苷，應用sbslGUS 酶解野黃芩苷轉化為野黃芩素，經分離純化獲得高純度的野黃芩素提取物，可為野黃芩素化合物的制備提供新的途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 型高效液相色譜儀系列（美國Agilent 公司）；KQ-300E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q Integral 3 型超純水機（美國Millipore 公司）；IKA C-MAG HS7 型加熱磁力攪拌器（德國IKA 公司）；Sorvall Lynx 4000型高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業世紀儀器有限公司）；R-3型旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）；ZKF035型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）。

1.2 材料 黃芩莖葉采自陜西澄城，經四川省中醫藥科學院李青苗研究員鑒定，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的莖葉。燈盞花購自云南澤生生物科技有限公司，經四川省中醫藥科學院李青苗研究員鑒定，為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草。野黃芩苷對照品（純度≥98%，批號：DST191012-026），野黃芩素對照品（純度≥98%，批號：DST191221-030），成都德思特生物技術有限公司；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 測定方法

2.1.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～12 min，40% B；12～30 min，40%～55% B）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：278 nm；進樣量：5～10 μL。理論塔板數按野黃芩素峰計算應不低于3 000。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品儲備液的制備 取野黃芩苷對照品、野黃芩素對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL 含野黃芩苷163.2 μg、野黃芩素181.0 μg 的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 燈盞花水煎液供試品的制備：取燈盞花切段，加水煎煮，濾過，得燈盞花水煎液。取燈盞花水煎液適量，置10 mL量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

酶解產物供試品的制備：取黃芩莖葉（粉碎過40 目篩），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室溫攪拌提取3 次，每次15 min，過濾，合并濾液，得sbslGUS 提取液；sbslGUS 提取液與燈盞花水煎液于一定溫度水浴酶解，加入3倍酶解體系量乙醇終止反應，轉移至量瓶中，超聲處理（300 W，40 kHz）20 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密移取混合對照品儲備液0.5、1、2、4、5、10 mL至10 mL量瓶，加70%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1.1”項下方法測定。以溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。結果表明野黃芩苷、野黃芩素分別在8.16～163.2、9.05～181 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

表1 野黃芩苷和野黃芩素的標準曲線回歸方程、相關系數與線性范圍Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of scutellarin and scutellarein

2.1.5 精密度試驗 取一定濃度的混合對照品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，計算峰面積的RSD。結果顯示，野黃芩苷、野黃芩素的RSD分別為0.16%、0.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 配制供試品溶液，室溫放置，照“2.1.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣。野黃芩苷、野黃芩素峰面積的RSD分別為0.89%、0.62%，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 按供試品溶液制備方法平行制備6 份供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件依次平行測定，計算得野黃芩苷、野黃芩素質量濃度的RSD分別為2.35%、1.33%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 精密量取已知含量的供試品溶液6 份，加入適量混合對照品儲備液，混勻，照“2.1.1”項下色譜條件進行含量測定，計算得野黃芩苷、野黃芩素的平均回收率分別為100.88%、100.11%，RSD 分別為1.05%、0.73%，表明該方法回收率良好。

2.2 燈盞花提取工藝研究

2.2.1 吸水率試驗 稱取燈盞花（切段）100 g，加水10 倍，回流提?。ㄖ蠓校? h后，浸泡過夜，濾除未被吸收的水液，計算吸水率約為479%。故后續實驗中首次煎煮時多加5倍水補足藥材吸水量。

2.2.2 煎煮條件篩選[16]煎煮次數、加水量、煎煮時間為影響提取的主要因素，采用4 因素3 水平進行正交試驗研究，優選最佳煎煮條件。以野黃芩苷為評價指標，采用正交試驗對煎煮次數（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）進行優選。稱取燈盞花100 g（切段），共9 份，按L9（34）正交試驗設計方案安排試驗（見表2和表3），加水煎煮（第1 次多加5 倍），濾過，合并濾液，測量體積。取水煎液照供試品溶液的制備方法處理，即得1～9 號供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件測定，計算水煎液中野黃芩苷總量。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Design and results of orthogonal test

由表3 可知，C 因素極差小于空白列，故將C 因素與空白列合并計算誤差。方差分析結果見表4。

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

方差分析結果顯示，煎煮次數（A）有顯著性差異，加水量（B）無顯著性差異。由表3 正交試驗結果可知，各因素作用主次為A＞B＞C，最佳方案為A3B3C3，但三因素2、3水平間差異均不大，從節約能耗、降低成本、提高生產效率等考慮，選擇次佳水平，擬定燈盞花煎煮條件為A2B2C2。

2.2.3 驗證實驗 稱取燈盞花（切段）100 g，按照擬定方案A2B2C2和最佳方案A3B3C3進行驗證實驗，重復3 次。結果見表5。由表5可知，擬定方案A2B2C2相較于最佳方案野黃芩苷提取率略有降低，但加水量、煎煮時間和次數均減少，應為最優方案。綜上，確定燈盞花提取工藝為：燈盞花切段，加10 倍水（第1 次多加5 倍）提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，得燈盞花水煎液。

表5 驗證實驗結果（n=3）Table 5 Results of verification test（n=3）

2.3 酶解條件研究[17-18]以野黃芩苷酶解轉化率為評價指標，對影響酶解效果的主要因素抗氧化劑、酶用量、酶解pH 值、溫度、反應時間等酶解條件進行考察。

野黃芩苷酶解轉化率＝m2×M1/（m1×M2）。m1為野黃芩苷質量，m2為野黃芩素的實際測得量，M1為野黃芩苷的相對分子質量，M2為野黃芩素的相對分子質量。

2.3.1 抗氧化劑對轉化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，分別加入1%亞硫酸鈉、1%亞硫酸氫鈉、1%偏重亞硫酸鈉，另設不加抗氧化劑對照（以燈盞花質量計，下同），于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率，結果分別為78.0%、81.4%、83.1%、76.7%。結果表明，1%亞硫酸氫鈉和1%偏重亞硫酸鈉均能提高野黃芩苷的轉化率，其中1%偏重亞硫酸鈉效果更優，故選擇1%偏重亞硫酸鈉作為抗氧化劑。

2.3.2 酶用量對轉化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、按照酶與底物之比（以生藥計）1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，分別加入燈盞花水煎液5、10、20、40 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率，結果分別為86.2%、82.8%、74.5%、61.9%。結果表明，野黃芩苷的轉化率隨著酶用量的減小而逐漸降低，酶與底物之比為1∶5 時轉化率最高?？紤]實際生產成本，選擇酶與底物之比為1∶10，既減少酶的用量，同時也能獲得較高的轉化率。

2.3.3 pH 對轉化率的影響 取sbslGUS提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，調節酶解體系pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率，結果分別為72.7%、85.2%、86.1%、85.7%，表明在pH 5.5～6.5 轉化率可達85%以上，故選擇酶解pH值約6.0。

2.3.4 酶解時間對轉化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴分別酶解10、15、20、25 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率， 結果分別為82.7%、 82.8%、 83.2%、84.4%。結果表明，酶解10 h 已基本酶解完全，各酶解時間轉化率差異不大。

2.3.5 酶解溫度對轉化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，分別于35、40、45、50、55、60 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率，結果分別為79.9%、82.0%、82.5%、80.0%、64.4%、25.3%。結果表明，隨著酶解溫度的升高，野黃芩苷的轉化率增加，但≥55 ℃時，野黃芩苷轉化率迅速下降，提示溫度過高可能會導致酶活力降低，從而影響野黃芩苷酶解，故選擇酶解溫度為40～45 ℃，此時野黃芩苷轉化率較高。

2.3.6 抗氧化劑用量對轉化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，分別加0.1%、0.5%、1%、2%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項下方法測定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計算轉化率，結果分別為79.4%、82.3%、82.5%、83.4%。結果表明，野黃芩苷的轉化率隨著偏重亞硫酸鈉用量的增加而提高，0.5%偏重亞硫酸鈉即可使野黃芩苷的轉化率達80%以上，從節省成本考慮，故選擇添加0.5%偏重亞硫酸鈉。

2.4 野黃芩素的分離 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加0.5%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴分別酶解10、15、20 h。測定水液和沉淀中野黃芩素的含量，計算水液中野黃芩素占比，結果分別為18.4%、13.4%、10.7%。表明酶解時間延長有利于野黃芩素的沉淀分離，酶解20 h 水液中損失較小，故酶解時間選擇20 h。

綜上，由燈盞花制備野黃芩素工藝擬定為：取黃芩莖葉（粉碎過40 目篩），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室溫攪拌提取3次，每次15 min，濾過，合并濾液，得sbslGUS 提取液；取燈盞花切段（黃芩莖葉10 倍量），加10 倍水（第1 次多加5 倍）煎煮提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，得燈盞花水煎液；燈盞花水煎液與sbslGUS提取液混勻，加入0.5%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃酶解20 h，除去上清液，沉淀抽濾，減壓干燥，即得野黃芩素粗提物。

2.5 酶解工藝放大試驗 取燈盞花500 g 和黃芩莖葉50 g，按照擬定工藝進行提取酶解。試驗重復3 次。結果見表6。

表6 酶解試驗結果（n=3）Table 6 Results of enzymatic hydrolysis test（n=3）

2.6 野黃芩素純化工藝研究 為進一步除去粗提物中雜質，提高野黃芩素含量，采用乙醇提取、活性炭脫色和分步結晶精制純化粗提物。

2.6.1 野黃芩素純化工藝參數的確定 對乙醇濃度和乙醇用量進行考察，比較70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇對粗提物中野黃芩素的提取效果。結果顯示，80%乙醇中野黃芩素溶解度最大，野黃芩素與80%乙醇料液比為1∶150（m/V）時，提取效果好。比較不同活性炭用量對提取液的脫色效果，結果顯示，加入相當于粗提物質量10%的活性炭，脫色效果好且野黃芩素損失小。

2.6.2 野黃芩素純化工藝試驗 取粗提物，按野黃芩素與80%乙醇料液比1∶150（m/V）加入80%乙醇加熱回流30 min，再加入相當于粗提物質量10%的活性炭加熱回流30 min，趁熱抽濾。濾液濃縮至有明顯沉淀析出，靜置過夜，濾過，得沉淀Ⅰ；取濾液繼續濃縮靜置過夜，濾過，得沉淀Ⅱ；合并沉淀Ⅰ和Ⅱ，減壓干燥，即得高純度野黃芩素提取物。按照上述純化工藝進行試驗，重復3次，結果見表7。

表7 純化試驗結果（n=3）Table 7 Results of purification test（n=3）

野黃芩素粗提物經乙醇提取、活性炭脫色、濃縮結晶純化后，野黃芩素含量由62%～64%提高至87%～89%。

3 討論

野黃芩素具有不穩定的多酚羥基結構，在酶解過程中易被氧化。有報道[19-20]在制備野黃芩素時多充入氮氣或加抗氧化劑保護目標產物。在預實驗中考察充氮和加抗氧化劑對野黃芩苷轉化率的影響，結果顯示，加抗氧化劑對野黃芩素的保護效果更優。經比較抗氧化劑的種類和用量，確定加0.5%偏重亞硫酸鈉。本研究探究了酶解時間對轉化率的影響，結果顯示酶解10 h 野黃芩苷基本酶解完全，延長酶解時間對轉化率影響不大，但有利于水液中懸浮的野黃芩素沉淀，減少野黃芩素的損失，綜合考慮選擇酶解時間為20 h。

在考察野黃芩素的純化工藝時，采用分步結晶對目標產物進行純化。粗提物經乙醇提取、活性炭脫色、濃縮結晶，得到含量大于87%的野黃芩素，收率大于84%。該純化工藝操作簡便，有機溶劑可回收重復使用，適合工業化大生產。綜上，本研究應用黃芩莖葉中提取得到的sbslGUS 酶解野黃芩苷制備高純度的野黃芩素提取物，工藝簡便可行，適合工業化生產，為野黃芩素化合物的制備提供了新的途徑。