培土清心顆粒治療特應性皮炎的蛋白質組學研究

劉俊峰，張凱，莫秀梅，3，王賽婭，晏烽根，3，葉思琪，賈金靖，張瑜，陳達燦，3，于曉波［.省部共建中醫濕證國家重點實驗室/廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 500；.河北大學生命科學學院，河北保定 0700；3.粵港澳中醫藥與免疫疾病研究聯合實驗室，廣東廣州 500；. 蛋白質組學國家重點實驗室/北京蛋白質組研究中心/國家蛋白質科學中心·北京（鳳凰中心）/軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，北京 006］

特應性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，具有頑固難治、易復發的特點，全球患病率逐年升高[1]。特應性皮炎的發病原因及機理尚未完全闡明，是內在因素（遺傳背景下免疫功能失衡、皮膚屏障功能異常）與外在因素（環境）相互作用的結果，是一種系統性疾病[2-3]。由于病情長期反復、劇烈瘙癢及睡眠障礙，患者容易出現心理問題，嚴重者伴有焦慮、抑郁甚至自殺傾向，嚴重影響患者的生活質量。目前西醫對特應性皮炎的治療藥物主要是激素、抗組胺藥、免疫抑制劑、生物制劑等，雖能暫時緩解病情，但長期使用存在毒副作用的問題，并且給患者家庭和社會造成沉重的經濟負擔。

依據特應性皮炎的特點、癥狀，可將其歸屬于中醫學的“四彎風”范疇，由于先天稟賦不耐，或后天飲食失調，導致脾虛、心火亢盛，感受風、濕、熱之邪而發病[4]。中醫藥治療特應性皮炎歷史悠久，且有一定的優勢。中藥“培土清心顆?！笔菑V東省中醫院研制的創新藥物，由太子參、白術、山藥、薏苡仁、連翹、白茅根、白鮮皮、珍珠母、甘草9味中藥組成，具有健脾清心、祛風止癢的功效，主要用于治療心火脾虛型特應性皮炎。通過多中心隨機對照臨床研究[5]顯示，培土清心方可以有效改善特應性皮炎患者的病情，緩解瘙癢，提高患者的生活質量，且安全性較好。前期研究[6-8]表明，培土清心方可以通過調節Th1/Th2/Th17/Treg 免疫失衡和腸道菌群發揮治療特應性皮炎的作用。通過網絡藥理學分析[9]顯示，培土清心顆?？赡芡ㄟ^抗炎、調節免疫、調控細胞凋亡以及調節氨基酸代謝以達到治療特應性皮炎的目的。

蛋白質組學研究[10-11]表明，特應性皮炎患者血液中均存在系統的炎癥蛋白表達。血清蛋白質組學為生物標志物監測提供了一個敏感的選擇，對于研究疾病診斷、預測治療應答、藥物作用靶點、預后等方面的標記物有很大的潛力[12]。故本研究擬采用數據非依賴采集質譜（DIA-MS）技術檢測培土清心顆粒治療前后特應性皮炎患者血清蛋白質的差異表達，尋找作用靶點，以期進一步闡明中藥培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集來自廣東省中醫院大德路門診的特應性皮炎患者的血液樣本，健康人群血液樣本來自招募的志愿者。其中特應性皮炎患者5 例，男性2 例，女性3 例，年齡7～12 歲，平均10.8 歲；均符合Hanifin&Rajka 診斷標準[4]。采用培土清心顆粒（由江陰天江藥業有限公司制備）治療12 周，6～7 歲，每次4 g，每日2 次；8～16 歲，每次6 g，每天2 次。治療前后進行臨床結局評價[4]，包括病情嚴重程度評分（EASI、SCORAD）、瘙癢程度評分、患者自評（POEM）、生活質量指數；治療前后采集患者血液樣本，分離血清備用。健康志愿者5例，年齡及性別與治療組的差異無統計學意義（P＞0.05），既往無過敏性疾?。òㄟ^敏性鼻炎、哮喘、過敏性結膜炎等）病史。受試者或監護人均簽署知情同意書，本研究通過廣東省中醫院倫理委員會審查，倫理審查批文號：BF2021-111-01。

1.2 主要試劑及儀器 10 mmol·L-1二硫蘇糖醇（DTT）、50 mmol·L-1碘乙酰胺（IAA），生工生物工程（上海）股份有限公司；尿素、碳酸氫銨（ABC），美國Sigma-Aldrich 公司；50 mmol·L-1碳酸氫銨溶液（ABC）、胰蛋白酶（批號：TRY001C），北京華利世科技有限公司。超濾管（30 kDa），美國MilliporeSigma 公司；EASY-nano-LC 1200 型液相系統、Q Exactive HF 質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 血清樣本的FAST 酶切 取出-80 ℃保存的血清樣本，以4 ℃、10 000×g離心3 min，取上清2 μL；加入200 μL 50 mmol·L-1ABC，室溫下以12 000×g離心15 min，重復洗滌3 次。更換收集管，加胰蛋白酶（0.02 μg·μL-1，由50 mmol·L-1ABC 配制）200 μL，37 ℃下水浴酶解13～16 h，室溫下以12 000×g離心15 min。再各加200 μL 純水，室溫下以12 000×g離心15 min。將濾液轉移至1.5 mL EP 管中，置于離心濃縮系統熱吹干，加熱溫度為42 ℃。

1.4 血清樣本的DIA 質譜檢測 色譜條件：將多肽樣本溶于30 μL A 液（0.1%甲酸水溶液）中，進樣5 μL，以4.5 μL·min-1流速載樣至預柱上，然后以600 nL·min-1流速在分析柱上進行分離。色譜分離梯度程序為：0～15 min，B 液（含0.1%甲酸的80%乙腈溶液）從7%至15%線性上升；15～85 min，B 液從15%至30%線性上升；85～110 min，B 液從30%至50%線性上升；然后在2 min 內，B 液上升至95%并維持到120 min。質譜條件：離子源噴霧電壓：2.1 kV；一級掃描范圍為m/z300～1 400，分辨率為60 K（m/z200），AGC target 為3e6，Maximum IT 為80 ms；二級掃描分辨率為15 K（m/z200），AGC target 為5e4，Maximum IT 為40 ms，碰撞能量為30，電荷狀態為2～6，動態排除時間為30 s。采用293T 細胞對質譜儀器進行質量控制，檢測期間儀器穩定性、重復性較好。

1.5 統計學處理方法及數據分析 患者治療前后各臨床指標變化的比較采用配對t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。蛋白質組學分析結果通過Spectronaut 軟件導出搜庫數據，共鑒定2 865 個肽段和407 個蛋白。將搜庫文件導入悟空云平臺（https：//www.omicsolution.com/wkomics/main/）進行數據中位數標準化、缺失值填充、Log2 轉換處理，以獲得高質量數據進行后續統計分析。使用limma 包進行兩組間的差異分析，根據P＜0.05、變化倍數（Fold Change）＞1.2篩選出差異蛋白；然后對所有差異蛋白進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和層聚類分析；最后通過GO數據庫（https：//geneontology.org）及KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）對差異蛋白進行GO 功能富集分析（包括生物學過程、細胞組分、分子功能3個方面）和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 培土清心顆粒對特應性皮炎患者相關療效指標的影響 結果見表1。與治療前比較，特應性皮炎患者治療后的臨床核心評價指標包括病情嚴重程度評分（EASI、SCORAD）、瘙癢程度評分、患者自評（POEM）、生活質量指數等均得到明顯改善，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，培土清心顆粒對特應性皮炎療效確切。

表1 培土清心顆粒對特應性皮炎患者相關療效指標的影響（±s，n=5）Table 1 Effects of Peitu Qingxin Granules on the related therapeutic indicators of patients with atopic dermatitis（±s，n=5）

表1 培土清心顆粒對特應性皮炎患者相關療效指標的影響（±s，n=5）Table 1 Effects of Peitu Qingxin Granules on the related therapeutic indicators of patients with atopic dermatitis（±s，n=5）

注：與治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01

療效指標EASI/分SCORAD/分POEM/分瘙癢程度評分/分生活質量指數/分治療前12.35±7.47 50.41±12.15 20.00±6.04 8.00±1.22 13.60±1.67治療后2.67±3.15*29.02±6.59*13.00±9.30*4.80±2.28*6.40±2.97**

2.2 特應性皮炎患者與健康人群的差異蛋白分析 對預處理的健康對照組及特應性皮炎組的血清蛋白質組學數據進行方差分析，根據P＜0.05、變化倍數＞1.2 篩選出變化差異較大的蛋白質。2 組共分析出特應性皮炎患者有28 個差異性蛋白，其中12 個蛋白表達水平上升，16個蛋白表達水平下降，見圖1。其中差異性排前列的蛋白質包括ALAD（δ-氨基乙酰丙酸脫水酶）、LTA4H（白三烯A-4 水解酶）、FGA（纖維蛋白原α 鏈）、F11（凝血因子XI）、LCP1（淋巴細胞胞漿蛋白1）等，見圖2。

圖1 特應性皮炎患者與健康人群差異表達蛋白的火山圖Figure 1 Volcano plots of differentially expressed proteins between atopic dermatitis patients and healthy people

圖2 特應性皮炎組與健康對照組的主要差異表達蛋白（±s，n=5）Figure 2 The main differentially expressed proteins between atopic dermatitis group and healthy control group（±s，n=5）

通過GO 功能富集分析發現，差異蛋白主要參與的生物進程包括固有免疫應答、細胞外基質、細胞黏附等；主要與外泌體、細胞外間隙、胞外區、細胞膜等細胞組分有關；主要參與的分子功能包括鈣離子結合、鋅離子結合、轉化生長因子β 結合等，見圖3-A。通過KEGG 通路富集分析發現，差異蛋白主要涉及PI3K-AKT 信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、ECM-受體相互作用、血小板活化、NF-κB信號通路、中性粒細胞外陷阱形成等信號通路，見圖3-B。

圖3 特應性皮炎組與健康對照組差異表達蛋白的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 3 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins between atopic dermatitis group and healthy control group

2.3 培土清心顆粒治療前后特應性皮炎患者的差異蛋白分析 對預處理的特應性皮炎患者治療前、后的血清蛋白質組學數據采用limma 包進行差異分析，根據P＜0.05、變化倍數＞1.2 篩選出變化差異較大的蛋白質。結果特應性皮炎患者經培土清心顆粒治療前后共分析出12 個差異蛋白，其中8 個蛋白表達水平上升，4 個蛋白表達水平下降，見圖4。差異性排前列的蛋白質包括表達顯著上調的ALAD、FGA、IGHV3-64D，以及表達顯著下調的IGHV3-38，見圖5。對治療前后的差異蛋白進行層聚類分析，結果表明治療前后樣本變異度可控，差異蛋白質之間存在一定的相關性，聚類分析熱圖見圖6-A。對治療前后的差異蛋白進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結果顯示治療前后組間分離趨勢明顯（見圖6-B），表明差異表達蛋白對于特應性皮炎患者治療前后的區分度明顯。

圖4 特應性皮炎患者治療前后差異表達蛋白的火山圖Figure 4 Volcano plots of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

圖5 特應性皮炎患者治療前后的主要差異表達蛋白（±s，n=5）Figure 5 The main differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment（±s，n=5）

圖6 特應性皮炎患者治療前后差異表達蛋白的相關性分析Figure 6 Correlation analysis of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

進一步通過GO 功能富集分析發現，差異蛋白主要參與的生物進程包括血小板脫顆粒、血小板聚集、細胞外基質、對藥物的反應等；主要與胞外外泌體、細胞膜、細胞外間隙、細胞質等細胞組分有關；主要參與的分子功能包括鈣黏蛋白結合（包括細胞間的黏附）、相同的蛋白質結合、金屬離子結合、細胞黏附分子結合等，見圖7-A。通過KEGG 通路富集分析發現，差異蛋白主要涉及脂質與動脈粥樣硬化、補體途徑、金黃色葡萄球菌感染、NF-κB 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等信號通路，見圖7-B。

圖7 特應性皮炎患者治療前后差異表達蛋白的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 7 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

2.4 培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用靶點 對“特應性皮炎患者與健康人群的差異蛋白”與“培土清心顆粒治療前后特應性皮炎患者的差異蛋白”取交集，發現ALAD、FGA、IGHV3-64D 等3 個蛋白靶點在特應性皮炎患者中的表達顯著下調，而在培土清心顆粒治療后顯著上調，提示這3個差異蛋白可能是培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用靶點，見表2。

表2 培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用靶點Table 2 The target of Peitu Qingxin Granules in the treatment of atopic dermatitis

3 討論

特應性皮炎是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，濕疹樣皮炎、瘙癢及病情反復是其臨床特點。廣東省名中醫陳達燦教授認為特應性皮炎多由稟賦不耐、胎毒遺熱、外感淫邪、飲食失調，致心火過勝，脾虛失運而發病，脾虛心火亢盛是特應性皮炎的核心病機[13-14]，培土清心法是其基本治法，培土清心顆粒依該法而創制。該方由太子參、白術、山藥、薏苡仁、連翹、白茅根、白鮮皮、珍珠母、甘草組成，既有四君子湯中正平和、健脾培土之義，又有導赤散清心導赤、泄邪從下之功。方中遣白術以培土健運，補脾胃；而連翹為瘡家要藥，可清心火，解熱毒；二者共奏清心培土之功效，為君藥。白茅根涼血清熱，利尿消腫，甘寒而不傷正；太子參、薏苡仁、山藥健脾除濕，平補脾胃；以上諸藥助君藥以調理心脾，共為臣藥。珍珠母長于安神定驚，潛陽息風；白鮮皮善清熱燥濕，祛風止癢；以上二藥安神、止癢，同屬佐藥。全方緊扣病機，輕靈平正，清而不傷正，養而不留邪，共奏培土清心，祛風止癢之功。本研究結果表明，培土清心顆粒治療后，特應性皮炎患者的臨床核心評價指標[15]包括病情嚴重程度評分（EASI、SCORAD）、瘙癢程度評分、患者自評（POEM）、生活質量指數等均得到明顯改善，培土清心顆粒能夠有效緩解瘙癢，改善癥狀，提高患者生活質量，與多中心隨機對照研究[5]結果一致。

本研究采用DIA-MS 技術檢測并分析了特應性皮炎患者與健康人群的血清差異蛋白，以及培土清心顆粒治療前后特應性皮炎患者的血清差異蛋白，尋找培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用靶點。特應性皮炎患者與健康人群比較，共分析出28 個顯著差異表達蛋白，其中12 個蛋白表達上調，16 個蛋白表達下調。表達顯著上調的差異蛋白包括CA1（碳酸酐酶1）、F11、ICAM-1（細胞間黏附分子）、可溶性CD14等；表達顯著下調的蛋白包括ALAD、 LTA4H、FGA、IGHV1-3、IGHV3-64D等。研究發現，ICAM-1在特應性皮炎患者血清和皮損中的表達均顯著上調，參與了特應性皮炎的發生，并能夠反映病情嚴重程度[16-17]；可溶性CD14 與皮疹嚴重程度相關，可能是疾病活動標志物[18]。此外，LTA4H也是本研究中發現的一個重要差異蛋白，LTA4H 為雙功能鋅金屬酶，包含環氧化物水解酶（EH）和氨肽酶活性，其中EH可催化LTA4 轉化為促炎介質白三烯B4（LTB4）。因其具有氨肽酶活性，對各種合成三肽的N端精氨酸具有高親和力，因此其除了促炎的EH 活性外，還可以通過其氨肽酶活性來抵抗炎癥，該活性可通過裂解另一種中性粒細胞引誘劑三肽Pro-Gly-Pro（PGP）滅活。研究[19]表明，血清LTA4H 是一個用于早期預測通過變應原免疫治療（AIT）變應性鼻炎有效的潛在生物標志物。因此，LTA4H 在特應性皮炎發病機制中的作用值得進一步研究。其余大部分差異性蛋白與特應性皮炎的相關性尚未見文獻報道，可為闡明特應性皮炎發病機制提供研究方向。

特應性皮炎患者經培土清心顆粒治療前后比較，共分析出12個差異蛋白，其中8個蛋白表達水平上升，4 個蛋白表達水平下降。其中ALAD、FGA、IGHV3-64D 等3 個蛋白靶點在特應性皮炎患者中的表達顯著下調，而在培土清心顆粒治療后顯著上調，可能是培土清心顆粒的作用靶點。ALAD 由8 個相同的亞基組成，催化2 個δ-氨基乙酰丙酸分子縮合形成血紅素、細胞色素和其他血紅素蛋白的前體膽色素原。ALAD 是一種硫醇依賴性酶，可以代表循環氧化狀態，其活性的改變與氧化應激密切相關，因此被認為是人類病理中氧化應激的標志物[20]。人體血液中的ALAD 水平是大氣鉛污染的生物監測指標，也是低濃度鉛暴露的敏感性指標。特應性皮炎作為體質和環境交互作用引發的疾病，其中環境因素如鉛的暴露受到廣泛關注。研究發現，室內空氣中的鉛含量可能與特應性皮炎的癥狀相關[21]；孕晚期暴露高水平鉛會增加6 個月男孩患特應性皮炎的風險[22]；出生時臍帶血中高水平鉛會導致免疫反應向Th2極化，促進疾病的發生與發展[23]。在特應性皮炎的發生發展中，ALAD 可能與氧化應激以及與重金屬鉛有重要關系，需要進一步深入研究。血清纖維蛋白原α 鏈（FGA）是血清纖維蛋白原的組成部分，與β、γ 多肽鏈通過二硫鍵形成對稱的二聚體結構。FGA 參與凝血及多種疾病的炎癥機制，包括類風濕關節炎、多發性硬化癥和阿爾茨海默病、淀粉樣變病、非創傷性股骨頭壞死[24]。IGHV3-64D 為免疫球蛋白復合體的一部分，具有抗原結合活性和免疫球蛋白受體結合活性，參與包括免疫反應的激活、對其他生物的防御反應、吞噬作用等。目前，FGA、IGHV3-64D 在特應性皮炎發病中的作用尚未見相關報道，有待深入研究。此外，通過對健康對照組與特應性皮炎組，以及特應性皮炎組經培土清心顆粒治療前后差異蛋白的KEGG通路分析，均顯示涉及NF-κB信號通路。NF-κB信號通路可調控轉錄多種炎性因子表達，作為下游信號通路參與了特應性皮炎的發病機制，其可促進人角質形成細胞和肥大細胞中細胞因子及趨化因子的產生，加劇炎癥反應，與特應性皮炎的嚴重程度密切相關。上述差異蛋白有可能通過NF-κB 信號通路加重了皮膚炎癥，差異蛋白與NF-κB 信號通路之間的關系值得深入研究。

綜上所述，本研究采用DIA-MS 技術篩選出差異表達蛋白ALAD、FGA、IGHV3-64D，可能是培土清心顆粒治療特應性皮炎的作用靶點。該結果為進一步實驗驗證奠定了基礎，后續研究將擴大樣本，進一步闡明上述靶蛋白在特應性皮炎發病機制中的作用，同時可為有效藥物的篩選提供新的思路。