酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬內質網應激IRE1α/ASK1/JNK 通路的影響

施學麗，黃辰杰，范麗麗，馬曉聰，郭超峰（.廣西中醫藥大學壯醫藥學院，廣西南寧 000；.廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧 000；.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧 000；.廣西中醫藥大學學科辦，廣西南寧 000；. 廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西南寧 000）

抑郁癥是最常見的精神障礙之一，預計到2030年抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病[1]。因此，如何有效防治抑郁癥是亟待解決的問題。目前臨床上常用的抗抑郁西藥主要通過提高腦內單胺類神經遞質水平發揮作用，但普遍存在起效緩慢、副作用大、作用靶點單一等問題，因此越來越多的研究者將研究重點投向中醫藥[2]。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可通過觸發多種促凋亡機制，對神經細胞產生有害作用，與抑郁癥的發生密切相關[3-4]。肌醇依賴性激酶1α（inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α）/凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulated kinase 1，ASK1）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路是目前研究較多、較清楚的由ERS 誘導的神經細胞凋亡通路，與抑郁癥的發生密切相關[5-6]。

藥對是歷代醫家的經驗結晶，療效確切，配伍精準，體現了中醫用藥特色優勢，作為復方和單味藥之間的橋梁，對其透徹的研究將有助于提高和推動中醫藥的整體理論和現代化的進程[7]。前期臨床研究[8-9]證實，酸棗仁-合歡花藥對能夠“疏肝解郁、寧心安神”，具有抗抑郁功效。前期動物研究[10]發現，酸棗仁-合歡花藥對能夠減緩ERS，減少細胞凋亡數及細胞凋亡率，改善抑郁癥狀。因此，本實驗以孤養結合慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）方法制備抑郁大鼠模型，探討酸棗仁-合歡花抗抑郁作用機制是否與ERS 凋亡通路IRE1α/ASK1/JNK 有關，以冀為臨床治療抑郁癥的用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，8 周齡，體質量（180±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001，動物質量合格證號：4307271103072775，飼養于廣西中醫藥科學實驗中心動物房，室溫控制在24 ℃～26 ℃，相對濕度保持在55%～60%。動物實驗經廣西中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會批準，批準編號：DW20211206-189。

1.2 藥物及試劑 炒酸棗仁、合歡花均購于廣西仙茱中藥科技有限公司，批號分別為：20210901、20210701，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為正品。鹽酸文拉法辛緩釋片，購自成都康弘藥業集團股份有限公司，批號：210816。TUNEL 細胞凋亡試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司，批號：101322230120；Tri Quick Reagent 總RNA 提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：R1100；反轉錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒，購自新貝生物科技有限公司，批號分別為：R202-02、Q204-1；兔抗大鼠IRE1α、磷酸化（P）-IRE1α、ASK1、PASK1、JNK、P-JNK、B 細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶3（cysteme aspartate specific protease-3，Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及山羊抗兔二抗，購自武漢華聯科生物技術有限公司，批號分別為：3294T、AF7150、PAB31055、AF3477、PAB30101、4668T、bs - 0127R、PAB30041、bs-0081R、PAB36269、SAB43714。

1.3 儀器 BW-OF302 曠場實驗視頻分析系統、BWMWM101 水迷宮，上海軟隆科技公司；高速冷凍離心機iCEN-24R，杭州奧盛儀器有限公司；Tanon 5200 全自動化學發光分析儀，上海天能科技發展有限公司；Tecnai G220 Twin 透射電子顯微鏡，美國Thermo Fisher Scientific 公司；EM UC7 型超薄切片機，德國Leica 公司；Light cycler 480 II 熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司；Mini Protean 3 cell 電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 分組、模型復制及給藥 180 只大鼠適應性喂養1 周后，用曠場實驗[11]篩選出總分在30～120 分之間的大鼠，挑選評分相近的144只大鼠，用隨機數字表法分為正常組、模型組及酸棗仁-合歡花高、中、低劑量組和文拉法辛組，每組24只。

正常組不給予任何刺激，其他5 組孤養，并參照相關方法[12]進行模型復制，包括夾尾3 min、冷水游泳（4 ℃）5 min、食物剝奪24 h、濕籠飼養24 h、禁水24 h、連續過夜光照12 h和電擊腳底（1 mA）2 min等7 種方法，整個過程持續3 周，制造孤養結合CUMS 抑郁大鼠模型。若曠場實驗及水迷宮實驗結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組曠場實驗得分減少、學習記憶能力下降，說明模型復制成功。

用蒸餾水將酸棗仁-合歡花浸膏干粉配成生藥含量1.6、0.8 、0.4 g·mL-1的懸濁液，鹽酸文拉法辛配制成0.000 8 g·mL-1的混懸液。酸棗仁-合歡花高、中、低劑量組按10 mL·kg-1灌胃酸棗仁-合歡花懸濁液（相當于酸棗仁-合歡花生藥量16、8、4 g·kg-1，為成人臨床劑量的16、8、4 倍）；文拉法辛組按10 mL·kg-1灌胃鹽酸文拉法辛混懸液；正常組、模型組按10 mL·kg-1灌胃蒸餾水，從模型復制的第1 天開始，每天1次，連續21 d。

1.5 大鼠行為學評分

1.5.1 曠場實驗 應用BW-OF302 曠場實驗視頻分析系統，在實驗第1 天及第21 天進行。在安靜的環境中，將大鼠放入80 cm×80 cm×60 cm 的黑色敞箱中，箱底被劃分為25 個大小相等正方形格子，將大鼠放到正中央格子內。大鼠身體50%以上進入一個方格內，則計水平活動得1 分；大鼠兩前肢離開箱底一次，則計垂直活動得1 分。記錄大鼠3 min 內的得分情況。

1.5.2 水迷宮實驗 采用Morris 水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力，在實驗第1 天及第21 天進行。該測試包括定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗：Morris 水迷宮均分為4 個象限，將大鼠分別從每個象限面向池壁放入水中，觀察大鼠找到高出水面2 cm 平臺的時間，若120 s內未找到平臺，則引導其至平臺，并停留20 s，訓練3 d；第4 天記錄大鼠爬上平臺所需的時間（即逃避潛伏期），若120 s 內沒有找到平臺即逃避潛伏期記為120 s?？臻g探索實驗：第5天撤掉平臺，由平臺所在對側象限放入大鼠，記錄120 s內大鼠跨越原平臺位置的次數。

1.6 透射電鏡檢測海馬神經細胞超微結構 行為學實驗結束后，隨機從各組選出6 只大鼠，用3%戊巴比妥鈉（1.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，斷頭處死大鼠。剝離海馬組織，經4%戊二醛和1%四氧化鋨固定，梯度酒精脫水，丙酮滲透，環氧樹脂包埋?？鞠?0 ℃聚合48 h，超薄切片機切片，乙酸鈾及枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察并拍照。

1.7 TUNEL 檢測海馬神經細胞凋亡 同“1.6”項下，隨機從各組選出6 只大鼠，取海馬組織，4%多聚甲醛灌注固定后，常規制備石蠟切片。切片經二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，按照試劑盒說明書操作。細胞核呈棕黃色為凋亡細胞。每只大鼠各取切片1 張，利用CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統在CA3區選取4個視野， 分析單個視野下凋亡細胞個數。

1.8 Western Blot 法檢測大鼠海馬IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達 同“1.6”項下，隨機從各組選出6只大鼠，取海馬組織，將海馬組織剪成細小的碎片，按每20 mg 組織加入200 μL 裂解液，離心取上清，BCA 法測蛋白濃度。取20 μg 蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，濕轉至PVDF 膜，4 ℃過夜，分別加入漂洗液稀釋的一抗（IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bcl-2、GAPDH 為1∶1 000，Bax、Caspase-3 為1∶2 000），4 ℃過夜，PBST 洗膜。加HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶20 000），37 ℃孵育，PBST 洗膜，ECL 顯影曝光，應用TANON GIS 軟件對目的條帶進行分析。

1.9 Real-Time PCR 法檢測海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase -3 mRNA 表達 同“1.6”項下，取各組剩余6 只大鼠的海馬組織，研磨勻漿，高速離心，取上層液，使用Trizol 法提取總RNA，進行逆轉錄和擴增，以GAPDH 為內參，用2-△△CT法計算出各樣品中目的基因的相對表達量。逆轉錄反應條件為：25 ℃、300 s；42 ℃、1 800 s；90 ℃、5 s。擴增反應條件為：95 ℃預變性180 s，95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，45 個循環。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及產物長度見表1。

表1 PCR 引物序列及產物長度Table 1 PCR primer sequences and product lengths

1.10 統計學處理方法 運用IBM SPSS Statistics 26.0進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。符合方差齊性時，兩兩比較選用LSD 檢驗；方差不齊時，兩兩比較采用Tambane's T2 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠行為學的影響

2.1.1 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠曠場實驗的影響 見圖1。實驗第1 天，各組大鼠的水平、垂直運動得分的差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗第21 天，與正常組比較，模型組大鼠水平、垂直運動得分均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，酸棗仁-合歡花各劑量組及文拉法辛組大鼠水平、垂直運動得分均升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，酸棗仁-合歡花高、低劑量組大鼠水平、垂直運動得分均降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠曠場水平運動和垂直運動的影響（±s，n=24）Figure 1 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on horizontal and vertical motions of de open field（±s，n=24）

2.1.2 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠水迷宮實驗的影響 見圖2。實驗第1 天，各組大鼠逃避潛伏期、跨越原平臺次數的差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗第21 天，與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期增加、跨越原平臺次數減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，酸棗仁-合歡花各劑量組及文拉法辛組大鼠逃避潛伏期減少、跨越原平臺次數增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，酸棗仁-合歡花高、低劑量組大鼠逃避潛伏期增加、跨越原平臺次數減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠水迷宮逃避潛伏期及跨越原平臺次數的影響（±s，n=24）Figure 2 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the avoidance latency of water maze and the number of crossing original platforms in depression model rats（±s，n=24）

2.2 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬神經細胞超微結構的影響 見圖3。正常組大鼠海馬神經細胞核顯示為圓形或橢圓形，核膜清晰，線粒體外膜光滑、嵴數量較多，粗面內質網排列密集、整齊、結構正常。模型組大鼠海馬神經細胞核不規則，部分核膜模糊，部分線粒體腫脹、外膜不清晰、嵴數量減少，粗面內質網的數量減少，并出現不規則擴張、折疊、斷裂、盤曲。酸棗仁-合歡花高、中、低劑量組及文拉法辛組大鼠海馬神經細胞核形態接近正常、核膜較光滑，線粒體輕度腫脹、外膜較光滑、嵴結構較清晰，粗面內質網結構清晰、未見明顯擴張。

圖3 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬神經細胞超微結構的影響（透射電鏡，×5 000）Figure 3 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the ultrastructure of hippocampal neurocytes in depression model rats（TEM，×5 000）

2.3 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬神經細胞凋亡的影響見圖4、表2。與正常組比較，模型組大鼠海馬神經細胞凋亡數增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，酸棗仁-合歡花各劑量組及文拉法辛組大鼠海馬神經細胞凋亡數減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，酸棗仁-合歡花高、低劑量組大鼠海馬神經細胞凋亡數增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠海馬神經細胞凋亡情況（TUNEL 法，×400）Figure 4 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on apoptosis of hippocampal neurocytes in each group of rats（TUNEL，×400）

表2 各組大鼠海馬神經細胞凋亡情況比較（±s，n=3）Table 2 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on apoptosis of hippocampal neurocytes in depression model rats（±s，n=3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，▲▲P＜0.01

組別正常組模型組酸棗仁-合歡花高劑量組酸棗仁-合歡花中劑量組酸棗仁-合歡花低劑量組文拉法辛組劑量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008細胞凋亡數/個2.67±0.82 10.50±0.55**8.00±0.63△△▲▲5.50±0.84△△8.17±0.98△△▲▲5.83±0.75△△

2.4 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬IRE1α/ASK1/JNK 通路蛋白表達的影響見圖5、表3。 與正常組比較，模型組大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、PASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，酸棗仁-合歡花各劑量組及文拉法辛組大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，酸棗仁-合歡花高、低劑量組大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 各組大鼠海馬IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達條帶圖Figure 5 Protein expression band of IRE1 α， P-IRE1 α，ASK1， P-ASK1，JNK，P-JNK，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of rats in each group

表3 各組大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達比較（±s，n=6）Table 3 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the protein expressions of P-IRE1α/IRE1α， P-ASK1/ASK1， P-JNK/JNK， Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

表3 各組大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達比較（±s，n=6）Table 3 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the protein expressions of P-IRE1α/IRE1α， P-ASK1/ASK1， P-JNK/JNK， Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別正常組模型組酸棗仁-合歡花高劑量組酸棗仁-合歡花中劑量組酸棗仁-合歡花低劑量組文拉法辛組劑量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008 P-IRE1α/IRE1α 0.41±0.04 0.96±0.11**0.67±0.04△△▲0.57±0.08△△0.69±0.08△△▲▲0.58±0.03△△P-ASK1/ASK1 0.41±0.01 0.94±0.05**0.67±0.02△△▲▲0.56±0.06△△0.70±0.02△△▲▲0.59±0.02△△P-JNK/JNK 0.38±0.03 0.93±0.07**0.64±0.05△△▲▲0.56±0.03△△0.70±0.03△△▲▲0.60±0.04△△Bax 0.24±0.01 0.95±0.02**0.45±0.02△△▲▲0.35±0.05△△0.46±0.04△△▲▲0.37±0.03△△Bcl-2 0.73±0.02 0.34±0.02**0.45±0.02△△▲▲0.58±0.02△△0.46±0.01△△▲▲0.59±0.02△△Caspase-3 0.21±0.01 0.38±0.01**0.35±0.01△△▲▲0.27±0.01△△0.34±0.02△△▲▲0.28±0.01△△

2.5 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響 見表4。與正常組比較，模型組大鼠海馬中IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表達水平升高，Bcl-2 mRNA 表達下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，酸棗仁-合歡花各劑量組及文拉法辛組大鼠海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表達降低，Bcl-2 mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，酸棗仁-合歡花高、低劑量組大鼠海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表達升高，Bcl-2 mRNA 表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the mRNA expressions of IRE1α， ASK1， JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

表4 酸棗仁-合歡花對抑郁模型大鼠海馬IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the mRNA expressions of IRE1α， ASK1， JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與酸棗仁-合歡花中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別正常組模型組酸棗仁-合歡花高劑量組酸棗仁-合歡花中劑量組酸棗仁-合歡花低劑量組文拉法辛組劑量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008 IRE1α 1.00±0.01 2.00±0.10**1.78±0.05△△▲▲1.56±0.06△△1.79±0.08△△▲▲1.56±0.07△△ASK1 1.02±0.05 1.88±0.06**1.67±0.07△△▲▲1.46±0.06△△1.68±0.08△△▲▲1.45±0.08△△JNK 1.00±0.06 2.57±0.07**2.07±0.44△△▲1.86±0.07△△2.09±0.13△△▲1.85±0.06△△Bax 1.02±0.08 2.38±0.16**1.70±0.09△△▲▲1.26±0.08△△2.23±0.14△▲▲1.22±0.10△△Bcl-2 1.01±0.08 0.34±0.05**0.54±0.05△△▲▲0.72±0.05△△0.40±0.02△▲▲0.71±0.06△△Caspase-3 1.00±0.05 1.88±0.06**1.52±0.05△△▲▲1.28±0.06△△1.50±0.12△△▲▲1.29±0.09△△

3 討論

抑郁癥屬中醫“郁證”范疇，其發生與心肝關系密切，課題組認為“心肝失調”是抑郁癥致病的核心因素，肝氣郁結、心神不安為抑郁癥的基本病機，“疏肝解郁、寧心安神”為基本治法。 酸棗仁-合歡花藥對為臨床常用的治療抑郁癥的藥對[13-15]，查閱中國知網中國專利發現，截至2023 年10 月，同時含有酸棗仁、合歡花，且可以治療抑郁癥的專利有32 項之多。酸棗仁酸甘收斂心陰，合歡花甘苦能解肝郁；心陰得收則心神得寧，肝郁得疏則情志愉悅。二者合用，“疏肝解郁，寧心安神”的作用集中。前期的研究[10，16-17]發現酸棗仁-合歡花能增強孤養結合CUMS抑郁模型大鼠海馬及皮質ERK/CREB、BDNF/TrkB 信號傳導通路，抑制PERK/ATF4/CHOP 通路，發揮抗抑郁作用。

孤養結合CUMS 抑郁大鼠模型是目前被較為公認的類似于人類抑郁的動物模型，在抗抑郁藥物的選擇與作用機制的研究中使用廣泛[18-19]，能夠很好地模擬抑郁癥的臨床癥狀。曠場實驗是評價動物行為學的經典方法之一，抑郁狀態下，動物的行為活動得分降低。抑郁癥常伴隨著認知功能障礙，其中學習記憶損傷尤為明顯[20]。 水迷宮實驗是評價動物學習、記憶功能最常用、最經典的方法[21]。本研究結果顯示，模型大鼠表現為曠場實驗得分減少、空間學習記憶能力下降，說明孤養結合CUMS抑郁大鼠模型復制成功；而酸棗仁-合歡花高、中、低劑量均能增加曠場實驗得分、改善空間學習記憶能力，表明酸棗仁-合歡花具有抗抑郁的功效。

研究提示抑郁癥的發病機制與ERS反應通路被持續激活有關，ERS成為抑郁癥診斷及治療的新生物學標志物及靶點[22-23]。本實驗發現孤養結合CUMS 抑郁模型大鼠海馬神經細胞凋亡數增加，神經細胞核膜模糊，線粒體腫脹、嵴數量減少，粗面內質網的數量減少、排列不規則，說明孤養結合CUMS刺激使大鼠海馬神經細胞發生ERS，而酸棗仁-合歡花治療后，大鼠海馬神經細胞凋亡數降低、神經細胞受損程度明顯減輕，說明對藥酸棗仁-合歡花能夠減緩ERS。

IRE1α 是內質網的Ⅰ型跨膜蛋白，能通過管腔結構域檢測內質網中錯誤折疊的蛋白質。當ERS 持續存在時，IRE1α可以通過自身的二聚化和磷酸化而激活，P-IRE1α 與腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）形成復合體，引起ASK1 的活化，并促使其下游JNK 的磷酸化激活，P-JNK 一方面激活促凋亡因子Bax，另一方面抑制了抗凋亡因子Bcl-2 等的表達，從而誘導細胞凋亡。另外，P-JNK 還能作用于線粒體，導致細胞色素C的大量釋放，并最終作用于Caspase-3，誘發細胞凋亡。本實驗結果顯示，孤養結合CUMS抑郁模型大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表達水平升高，Bcl-2 蛋白及mRNA 表達水平降低，與前人的研究[24]結果一致。而不同劑量的酸棗仁-合歡花均能明顯降低孤養結合CUMS 抑郁模型大鼠海馬P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表達，升高Bcl-2蛋白及mRNA表達水平。說明酸棗仁-合歡花能夠抑制IRE1α/ASK1/JNK凋亡通路，并且中劑量組效果更為明顯。

綜上所述，酸棗仁-合歡花的抗抑郁作用機制可能與抑制ERS 凋亡通路IRE1α/ASK1/JNK 活性，促進海馬神經細胞的修復、再生，拮抗神經細胞凋亡有關。結合前期的研究成果，說明酸棗仁-合歡花發揮抗抑郁作用可能是通過多靶點、多途徑、多部位協同作用實現的。本研究仍存在不足之處，酸棗仁-合歡花抗抑郁的藥理學研究目前仍停留在整體藥理學水平。下一步，我們將結合血清及腦脊液藥理學，對酸棗仁-合歡花抗抑郁的有效部位及藥動學進一步深入研究，以期為臨床精準用藥提供實驗依據。