基于上皮細胞-間充質轉化的搜風愈喘方調控哮喘大鼠氣道重塑的機制研究

李艷麗，張宇婧，閆永彬（1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科醫院，河南鄭州 450000；2. 河南中醫藥大學兒科醫學院，河南鄭州 450000）

支氣管哮喘（哮喘）是一種包括氣道上皮細胞等多種細胞及細胞組分參與的常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要臨床表現為反復發作的咳嗽、喘息、氣促、呼吸困難，是兒童最常見的慢性呼吸系統疾病[1-2]。其在世界范圍內呈現高發病率，且患病率在近幾十年呈現顯著上升趨勢[3]。約有3.34 億人受到影響并且發達國家該病的患病率明顯高于發展中國家，但由于環境和生活方式的改變，發展中國家哮喘患病率正在迅速上升[4]，其主要影響兒童[5]。我國該病的患病率為4.2%[6]。氣道炎癥反應、氣道重塑和氣道高反應性是哮喘的主要病理特征，而氣道炎癥是其本質，氣道重塑是其關鍵病理特征，與哮喘的反復發作、持續狀態和不良預后有關[7-8]。作為氣道重塑的核心機制，上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）不僅在氣道重塑的發生和發展過程中發揮重要作用[9-10]，而且可誘導氣道上皮敏感性改變而影響嚴重哮喘糖皮質激素的治療效應，也是不同病情嚴重程度的哮喘上皮屏障功能喪失的重要發病機制[11]。因此，氣道EMT 的機制研究和藥物如何干預尤為重要。

目前地塞米松等糖皮質激素仍是哮喘治療的一線用藥，雖有一定療效，但存在治療周期長、有副作用、難以根治等問題，且患兒對激素的依從性較差，導致目前臨床對哮喘的控制并不理想。中醫藥治療哮喘歷史悠久，理論較為完善，治療兒童哮喘效果顯著[12]，能夠明顯改善癥狀、減少復發、減少不良反應[13]。課題組前期致力于小兒呼吸與感染相關方面的研究，基于小兒獨特的生理病理特點，在“五臟有余不足”“久病入絡”等學說的基礎上提出“伏風暗瘀宿痰”的哮喘中醫病機理論[14]，并創立了祛風、化痰、活血法并施的“搜風愈喘方”，臨床療效確切[15]。課題組既往實驗研究已證實本方具有抗過敏、調控細胞外基質及抑制血管重塑作用，并通過抑制轉化生長因子β1（TGF-β1）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達而抑制哮喘大鼠氣道重塑[16]。相關臨床研究[17]表明，哮喘急性期的患兒在本方的干預下，咳嗽、喘息等癥狀明顯改善，療效優于西藥對照組，其安全性良好。

EMT 是指上皮細胞在一定條件下，暫時失去細胞極性，獲得遷移能力，形態發生間充質細胞表型改變的過程[8]，關鍵變化在于上皮細胞緊密連接的Ecadherin 表達的下調，N-cadherin、α-SMA 等間充質標志物表達的上調[18-19]。而TGF-β1 作為上皮間質轉化的關鍵誘導因子之一，在此過程中扮演著重要角色，氣道上皮細胞可在TGF-β1 的作用下發生EMT，進而參與哮喘氣道重塑的發生發展[20]。因此，本研究選取SD 大鼠進行動物學實驗，通過檢測血清中的TGF-β1、白細胞介素（IL）-17含量及肺組織中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的表達，探討搜風愈喘方能否通過調控上皮間質轉化從而抑制氣道重塑。

1 材料

1.1 動物 60 只SD 大鼠，雄性，SPF 級，6 周齡，體質量為（200 ± 20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物質量合格證號：110322221102192468，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0008，動物使用許可證編號：SYXK（豫）2021-0015。大鼠飼養于鄭州大學實驗動物中心，室內溫度24～26 ℃，室內濕度55% ～65%，12 h/12 h 光暗循環，飼喂普通飼料，自由飲食。本研究經鄭州大學倫理委員會批準，批準號：ZZU-LAC20220729[07]。

1.2 藥物及試劑 搜風愈喘方的組方為：炒萊菔子、炒苦杏仁、黨參、焦山楂、地龍、炒白僵蠶、炙枇杷葉、礞石、蜜麻黃、橘絡、蟬蛻、紅花、炙甘草，藥材購自河南張仲景大藥房股份有限公司；10%卵清蛋白（OVA），美國Sigma 公司，批號：A5503；1% 卵清蛋白（OVA），美國Sigma 公司，批號：A5253；氫氧化鋁佐劑，美國Pierce 公司，批號：77161；醋酸地塞米松片，上海麥克林生化科技有限公司，規格：每片0.75 mg，批號：2010072；4%多聚甲醛通用型組織固定液，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：BL539A；PBS 緩沖液，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GA2112011；0.9% NaCl，河南科倫藥業有限公司，批號：C1220724E1；鹽酸氯胺酮注射液，福建古田藥業有限公司，批號：H35020148；IL-17 酶聯免疫吸附測定試劑盒，聯科生物有限公司，批號：A31720113。TGF-β1 酶聯免疫吸附測定試劑盒，武漢伊萊瑞特公司，批號：FME1TGZM7K ；BCA 蛋白定量檢測試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2026；TGF-β1 一抗，北京博奧森生物技術有限公司，批號：BS-0086R；E-cadherin、N-cadherin、α-SMA 一抗和二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為：GB11082、GB11135、GB111364、GB23303。

1.3 儀器 NE-C28P壓縮霧化器，歐姆龍（中國）有限公司； RT-6100 酶標儀， 美國Rayto 公司；alphaEaseFC 灰度分析軟件，美國Alpha Innotech 公司；Adobe PhotoShop 圖像分析軟件，美國Adobe 公司；6100 化學發光儀，上海CLINX 公司；SVE-2 垂直電泳儀、KZ-Ⅱ研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；Leica UC7 型病理切片機，上海徠卡公司；D3024R 臺式高速冷凍離心機，北京DRAGONLAB 公司；TL-988 熒光定量PCR 儀，西安天隆公司；HT7700透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司。

2 方法

2.1 搜風愈喘方藥液制備 搜風愈喘方中藥飲片以純水浸泡30 min，加熱至沸騰后以文火煎煮30 min，倒出藥液并過濾；殘渣復煎，倒出藥液，將2次藥液混合，置于70 ℃恒溫水浴，藥液濃縮至1.26、0.63、0.315 g·mL-13種濃度，4 ℃恒溫冰箱保存。

2.2 分組及模型復制 取60 只SD 大鼠普通飼料飼喂1 周，將其隨機均分為6 組，分別為正常對照組、模型對照組、地塞米松組及搜風愈喘方高、中、低劑量組。參考相關文獻研究[21]，復制哮喘大鼠模型。除正常組外，其余各組均采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發建立哮喘大鼠模型。具體方案如下：實驗第l 天和第7 天，每只大鼠給予10% 卵清蛋白1 mL、氫氧化鋁100 mg 五點注射致敏。致敏開始兩周后，將大鼠置于密閉透明容器內，給予1%卵清蛋白（卵清蛋白溶于生理鹽水）霧化吸入激發哮喘。觀察并記錄大鼠呼吸及全身情況。開始連續3 d，后隔日霧化1 次，每次20 min，共21 d。以出現呼吸加快、點頭呼吸、打噴嚏、精神萎靡不振、口周發紺及腹肌痙攣為激發成功[22]。

2.3 給藥方法 各組大鼠每次霧化吸入激發前0.5 h給予相應藥液進行灌胃。根據成人與大鼠的體質量換算公式得出大鼠用藥量：dB=dA×6.25（dA、dB 分別代表成人、大鼠每日每千克體質量用藥劑量）[23]。搜風愈喘方高、中、低劑量組分別按照1.26、0.63、0.315 g·mL-13 種濃度，每鼠按0.02 mL·g-1劑量每日灌胃給藥1 次；地塞米松組給予0.125 mg·kg-1，等容灌胃，每日1次；正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日給藥1次，連續21 d。期間觀察并記錄各組大鼠的一般情況。

2.4 標本采集 末次給藥24 h后，腹腔注射50 mg·kg-1氯胺酮麻醉實驗大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置1 h；4 ℃條件下，以離心半徑為13 cm、3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，-80 ℃冰箱冷藏，以備檢測血清指標?？焖俳馄蚀笫?、摘取合適大小的肺臟組織，PBS 緩沖液沖洗干凈、置于-80 ℃冰箱凍存，以備檢測mRNA 及蛋白質的表達；另取部分新鮮肺組織，以備HE染色和透射電鏡檢查。

2.5 指標檢測

2.5.1 大鼠一般情況 觀察并記錄各組大鼠霧化激發及藥物干預前后各階段的體質量、飲食、情緒、活動強度、精神狀態、呼吸頻率、毛發色澤、口唇黏膜顏色變化及腹壁是否有凹陷等表現。

2.5.2 血清檢測 ELISA 法測定血清TGF-β1、IL-17的含量，按試劑盒說明書操作。

2.5.3 病理學觀察 取未灌洗過的左上葉肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，酒精脫水石蠟包埋切片，厚度為5 μm。行HE 染色，置于顯微鏡下放大200 倍，光鏡下觀察肺組織病理變化，并根據相關文獻研究[24]對肺組織炎癥浸潤程度進行評分。

2.5.4 肺組織透射電鏡檢查 取合適大小的新鮮肺組織，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h，用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液進行漂洗3 次，之后用1%鋨酸室溫固定2 h。再次漂洗后，將組織依次放入不同濃度的酒精中脫水，每次15 min，100%丙酮2 次，每次15 min。然后用丙酮和812 包埋劑按不同比例對樣品進行滲透，插入包埋板后于37 ℃烤箱過夜，60 ℃烤箱聚合48 h。將其用超薄切片機60～80 nm超薄切片，進行鈾鉛雙染色，透射電鏡觀察肺組織上皮細胞、平滑肌細胞的超微結構。

2.5.5 RT-PCR 法檢測肺組織mRAN 表達 取合適大小的肺臟組織，PBS緩沖液沖洗干凈，按照試劑盒說明書提取肺組織總RNA。然后使用逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，將其配置為相應的反應液，參照說明書進行擴增，反應程序為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40個擴增循環。根據2-ΔΔCt公式計算TGF-β1、α-SMA、N-cadherin和E-cadherin mRNA 的相對表達量。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增長度Table 1 Primer sequences and amplification lengths

2.5.6 Western Blot法檢測肺組織蛋白表達 取適量大鼠右肺組織，加入蛋白裂解液使之完全裂解，靜置、離心后提取上清液。參照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測蛋白濃度，然后按比例加入5×還原型蛋白上樣緩沖液，充分混勻，100 ℃煮沸10 min，備用。按步驟完成上樣、電泳、轉膜、封閉抗體、孵育一抗、孵育二抗、顯影、條帶分析，比較不同組間肺組織的TGF-β1、α-SMA、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表達水平。

2.6 統計學處理方法 采用SPSS 26.0 軟件進行分析，實驗數據均以均值±標準差（±s）表示。對數據進行正態分布和方差齊性檢驗，符合正態分布的各組相關數據滿足方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況 正常對照組大鼠精神狀態良好，情緒穩定，呼吸頻率、飲食、活動正常，毛色光澤，體質量增長。模型對照組大鼠呼吸急促，煩躁不安，易激惹，口唇發紺，皮毛枯槁，體質量增長不明顯或有減輕。各治療組大鼠精神狀態、呼吸、飲食、活動等方面均較模型對照組明顯改善。

3.2 各組大鼠肺組織病理情況 HE 染色和炎癥評分結果見圖1、圖2。正常對照組大鼠支氣管、肺組織結構完整，肺泡結構清晰，未見增厚及明顯的炎癥細胞浸潤；與正常對照組比較，模型對照組大鼠氣道壁及肺泡壁明顯增厚，視野內可見大量炎癥細胞浸潤，炎癥評分明顯升高（P＜0.01）；各用藥組與模型對照組比較，肺組織炎癥細胞浸潤減輕，支氣管壁及肺泡壁增厚程度減輕，地塞米松組和搜風愈喘方高劑量組炎癥評分明顯降低（P＜0.05）。

圖1 搜風愈喘方各劑量對哮喘大鼠模型肺組織炎癥程度的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on the degree of lung tissue inflammation in asthmatic rat model of each dose group（HE staining，×200）

圖2 搜風愈喘方各劑量對哮喘大鼠模型肺組織炎癥評分的影響（±s，n=10）Figure 2 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on pulmonary tissue inflammation score in asthmatic rat model of eachdosegroup（±s，n=10）

3.3 各組大鼠肺組織超微結構情況 見圖3。與正常對照組比較，模型對照組大鼠上皮細胞水腫程度嚴重，胞內基質局部溶解、變淡，細胞器腫脹明顯；各用藥組與模型對照組比較，肺組織中上皮細胞水腫程度明顯減輕，細胞膜完整，胞內基質均勻，細胞器大多輕微腫脹。

圖3 搜風愈喘方對哮喘大鼠模型肺組織上皮細胞超微結構的影響（透射電鏡，×2 500）Figure 3 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on ultrastructure of lung epithelial cells in asthmatic rat model of each dose group（Transmission electron microscope，×2 500）

3.4 各組大鼠血清中TGF-β1、IL-17 的含量 見表2。ELISA 結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組血清中TGF-β1、IL-17 含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，地塞米松組和搜風愈喘方高、中、低劑量組大鼠血清TGF-β1、IL-17 含量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；搜風愈喘方各劑量組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中TGF-β1、IL-17 含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TGF-β1 and IL-17 in serum of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠血清中TGF-β1、IL-17 含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TGF-β1 and IL-17 in serum of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，**P＜0. 01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型對照組地塞米松組搜風愈喘方高劑量組搜風愈喘方中劑量組搜風愈喘方低劑量組TGF-β1/（pg·mL-1）58.10±3.49 112.34±12.67**67.07±9.92##68.97±9.77##72.82±17.80##84.60±12.96#IL-17/（pg·mL-1）13.67±2.56 23.88±1.85**16.09±2.48##16.69±1.33##18.59±1.72##19.92±1.92#

3.5 各組大鼠肺組織中 TGF-β1、α-SMA、Ncadherin 和E-cadherin 的mRNA 表達 見表3。與正常對照組比較，模型對照組TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin mRNA 表達明顯上調（P＜0.01），Ecadherin mRNA 表達顯著下調（P＜0.01）；與模型對照組比較，地塞米松組和搜風愈喘方各劑量組TGFβ1、α-SMA 和N-cadherin mRNA 表達顯著下調（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin mRNA 表達顯著上調（P＜0.05，P＜0.01）；搜風愈喘方各劑量組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的mRNA 表達水平（±s，n=10）Table 3 mRNA expression levels of TGF-β1，α-SMA，Ncadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的mRNA 表達水平（±s，n=10）Table 3 mRNA expression levels of TGF-β1，α-SMA，Ncadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型對照組地塞米松組搜風愈喘方高劑量組搜風愈喘方中劑量組搜風愈喘方低劑量組TGF-β1 1.00±0.00 4.28±0.82**1.71±0.44##1.94±0.65##2.61±1.22#2.94±0.56#α-SMA 1.00±0.00 2.71±0.93**0.65±0.49##0.81±0.36##1.08±0.30##1.50±0.33#E-cadherin 1.00±0.00 0.32±0.18**0.77±0.15##0.75±0.17##0.70±0.04##0.59±0.08#N-cadherin 1.00±0.00 4.02±0.39**1.25±0.12##1.55±0.12##2.07±0.28##2.93±0.56##

3.6 各組大鼠肺組織中的TGF-β1、α-SMA、Ncadherin、E-cadherin 蛋白表達比較 見圖4。與正常對照組比較，模型對照組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表達顯著上調（P＜0.01），Ecadherin 表達顯著下調（P＜0.01）；與模型對照組比較，地塞米松組和搜風愈喘方各劑量組TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表達明顯下調（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 表達明顯上調（P＜0.01）；搜風愈喘方各劑量組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的蛋白表達水平（±s，n=10）Figure 4 Protein expression levels of TGF-β1，α-SMA，N-cadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

4 討論

氣道重塑能導致持續性氣道阻塞、氣道高反應性和肺功能下降，是支氣管哮喘發生發展進程中的重要環節，也是哮喘纏綿難愈的重要因素[25]。氣道重塑的發生主要與氣道上皮反復損傷和異常修復有關。氣道上皮細胞是抵御外部病原體的第一道屏障，是最具活性的分泌組織細胞之一，在上皮細胞間充質轉化和氣道重塑中發揮關鍵作用[26]。氣道上皮損傷后，釋放細胞因子、TGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等物質，可以促進上皮細胞自我修復，增強細胞遷移能力[27]，通過間質轉化產生膠原沉積和上皮下纖維化過程，參與氣道重塑。對氣道壁波形蛋白的定量研究發現間質細胞有30%來源于上皮細胞的轉化，表明EMT 對于氣道重塑的重要性[19]。而EMT 的關鍵變化，具體表現為連接蛋白、細胞間緊密連接的喪失，尤其是E-cadherin表達的下調，導致上皮通透性增加，N-cadherin、α-SMA 表達的上調[28]。TGF-β1 通過誘導成纖維細胞的增殖和化學吸引在氣道重塑中起核心作用，被認為是誘導EMT 的“主開關”，是氣道重塑的促進劑[29-30]。袁星星等[8]發現平喘顆粒能通過抑制哮喘模型小鼠TGF-β1 的表達，抑制EMT 的發生，進而減輕氣道重塑。于洋等[31]通過對小鼠哮喘模型的研究證實哮喘模型小鼠中存在EMT 和氣道重塑，且TGF-β1過度表達，抑制EMT可減輕氣道重塑。

在本研究中，我們觀察到OVA 誘導的大鼠哮喘模型較正常對照組在精神、飲食等方面表現較差，氣道壁及肺泡壁明顯增厚，炎癥細胞浸潤明顯，外周血中TGF-β1、IL-17 明顯升高；給予搜風愈喘方各劑量干預后，哮喘大鼠一般情況較模型組均有改善，氣道壁及肺泡壁增厚減輕，炎癥細胞浸潤緩解，外周血中TGF-β1、IL-17 明顯下降，肺組織中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表達水平下調，E-cadherin 表達水平上調，以地塞米松和搜風愈喘方高劑量作用明顯。糖皮質激素能通過抑制Ⅱ型輔助性T 細胞（T helper cell 2，Th2）募集并下調Th2 因子的產生，發揮顯著的抗炎、抗水腫、免疫抑制作用，臨床以其作用顯著被認為是治療支氣管哮喘的一線藥物，但部分使用激素的患者會出現激素抵抗現象，或者不良反應，導致疾病控制不佳[32]。中醫藥以其療效確切，安全性高，在治療哮喘方面發揮著積極作用。課題組基于小兒獨特的生理病理特點，在“五臟有余不足”“久病入絡”等學說的基礎上提出“伏風暗瘀宿痰”的哮喘中醫病機理論，并創立搜風愈喘方。方中用蟲類藥物，如炒白僵蠶、蟬蛻、地龍，深入肺脈以搜“伏風”，研究表明以上蟲類藥物組合可通過調節T-bet、GATA-3 的表達，抑制Th1 型細胞因子向Th2漂移，從而調節哮喘免疫失衡，減輕哮喘的氣道炎癥，療效顯著[23]。氣行則血行，氣虛則運血無力，故用黨參、炙甘草健脾益氣，以助血行；炒萊菔子、焦山楂以消食滯痰瘀；紅花活血化瘀。研究表明此“消暗瘀”的藥物組合可抑制PI3K-Akt通路的激活，降低IL-6、VEGF-A的表達，減輕氣道炎癥，延緩氣道重塑[33]。并以蜜麻黃、炒苦杏仁、橘絡、炙枇杷葉、礞石降氣化痰以祛“宿痰”，此祛宿痰藥物的配伍可通過山柰酚、異鼠李素、槲皮素等核心成分發揮抗炎、調節免疫等作用，從而延緩哮喘的發展。搜風愈喘方兼具搜伏風、消暗瘀、祛宿痰功效，臨床效果更加顯著[34]。

既往實驗[16]已證實搜風愈喘方可降低TGF-β1 表達，抑制氣道重塑。TGF-β1 是上皮間質轉化最有力的誘導劑，抑制TGF-β1 的表達可抑制上皮間質轉化。本次實驗研究中搜風愈喘方各組血清中TGF-β1、IL-17 含量明顯降低，肺組織中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 基因表達明顯下調，E-cadherin 基因表達明顯上調，表明搜風愈喘方可通過降低TGF-β1 水平，抑制上皮間質轉化，從而減輕氣道重塑。

綜上，搜風愈喘方可通過降低TGF-β1 水平，從而改善肺組織EMT，達到防治哮喘氣道重塑的目的。本研究結果進一步證實了哮喘“伏風暗瘀宿痰”病機假說的合理性，為防治哮喘提供了線索。TGF-β1是上皮間質轉化的關鍵誘導因子之一，可通過多種信號通路參與調節。搜風愈喘方調控上皮間質轉化從而抑制氣道重塑的作用具體是通過哪種信號通路實現的尚需深入研究。