白術內酯Ⅰ調節PI3K/Akt/mTOR 信號通路對肺脾氣虛反復呼吸道感染模型大鼠肺損傷的影響

王曉利，李瑋，朱珊，史興嬋，陳煒［河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）兒科，河南鄭州 450053］

反復呼吸道感染（RRTI）是指1年內頻繁發生并超過正常范圍的上呼吸道和下呼吸道感染，其是兒童最常見的疾病之一[1]。兒童反復呼吸道感染發病率增加主要與年齡、免疫系統狀況、過敏以及抗生素過度使用等因素有關[2]。目前，對于反復呼吸道感染的治療方法主要包括免疫調節劑，抗生素以及其他抗感染療法治療，雖然這些干預措施可以在短期內緩解RRTI 癥狀，但這些干預措施不能預防疾病復發，且通常需長期使用[3-4]。因此，需要開發更安全有效的RRTI治療方法。

白術內酯Ⅰ是中藥蒼術的主要活性成分，其具有多種藥理特性，包括抗炎和器官保護作用等[5]。已有研究[6]報道，白術內酯Ⅰ可改善大鼠急性肺損傷。但關于白術內酯Ⅰ對肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷的影響鮮有報道。相關研究[7]顯示，抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路可抑制炎癥反應和氧化應激損傷，進而保護PM2.5 誘導的大鼠肺損傷。但白術內酯Ⅰ能否通過調控PI3K/Akt/mTOR 信號通路影響肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷尚不可知。因此，本研究擬探究白術內酯Ⅰ對肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷的影響以及其作用機制，以期為開發新的治療肺脾氣虛RRTI 的藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 84只SPF級雄性SD 大鼠，4周齡，體質量為105～110 g，購自上海泰楚生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2023-0001，動物質量合格證號：1105292111008356。大鼠飼養于溫度為（23±1）℃、濕度為（55±5）%、12 h 交替照明的環境中。所有動物實驗操作均獲得河南省中醫院動物倫理委員會的批準，批準號：HNSZYY202200105。

1.2 藥物及試劑 白術內酯Ⅰ，批號：73069-13-3，購于成都格利普生物科技有限公司，純度大于98%，臨用前用乙醇生理鹽水溶液（乙醇∶生理鹽水為3∶1）配制；阿莫西林克拉維酸鉀片，批號：20220306，購于南京長澳制藥有限公司，臨用前用生理鹽水溶液配制；PI3K 激活劑重組大鼠胰島素樣生長因子1（IGF-1），批號：20220809，購于北京百奧萊博科技有限公司，臨用前用稀醋酸溶液配制；戊巴比妥鈉，批號：20221229，佛山市化工實驗廠生產；大鼠白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒，批號分 別 為 ： 20220307、 20220415、 20220609、20221003，購于上海仁捷生物科技有限公司；兔源一抗p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，批號分別為：ab191606、ab38449、ab218525、ab302958、ab8805、ab134903、ab8245、ab6721，均購于英國Abcam公司。

1.3 主要儀器 FlexiVent 型動物肺功能儀，北京廣源達科技發展有限公司；TC3K 型電子天平，深圳市新朗普電子科技有限公司；CX53 型光學顯微鏡，日本Olympus公司；ST-360型酶標儀，上?？迫A實驗系統有限公司；165-8001 型蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 分組、模型復制及給藥 按照隨機數字表法將84 只大鼠隨機分為對照組、模型組、白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組、IGF-1組、白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1 組，每組12 只。除對照組外，其他組大鼠均通過疲勞結合飲食失節的方式誘導脾氣虛證[8]，具體過程為：模型復制第1 天將大鼠置于溫水池中（水深度為36 cm、水溫為30 ℃），強迫大鼠游泳直至其口鼻首次浸入水中，每天進行該操作1次，共持續34 d。該操作過程中大鼠可自由飲水，單日每只大鼠僅喂食20 g 白菜，雙日大鼠按照15 mL · kg-1的劑量灌胃豬油脂同時喂養充足的鼠糧。通過刨花加煙葉煙熏法誘導肺氣虛證[8]，具體過程為：模型復制第13天時將大鼠置于含有15 g刨花、15 g煙葉的煙熏箱中煙熏30 min，每天進行該操作一次，持續22 d。若大鼠出現呼吸急促、精神倦怠、反應遲鈍、咳嗽、飲食量減少、便溏等癥狀則表明肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠模型構建成功。

模型復制成功后，進行給藥處理，白術內酯Ⅰ低、高劑量組大鼠分別需腹腔注射3.33、13.32 mg·kg-1白術內酯Ⅰ[9]，且均需灌胃等量的生理鹽水；陽性藥物組大鼠需灌胃85 mg·kg-1阿莫西林克拉維酸鉀，且還需腹腔注射等量的生理鹽水[10]；IGF-1 組大鼠需腹腔注射1.33 mg·kg-1IGF-1，且還需灌胃等量的生理鹽水[11]；白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1 組大鼠需腹腔注射13.32 mg·kg-1白術內酯Ⅰ和1.33 mg·kg-1IGF-1，且還需灌胃等量的生理鹽水；對照組、模型組大鼠均需腹腔注射等量的生理鹽水且灌胃等體積的生理鹽水。給藥每天1次，持續6周。

1.5 肺功能指標的檢測 選取全部大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉大鼠，并將大鼠固定于手術臺上，利用動物肺功能儀檢測大鼠肺功能指標呼氣峰流速（PEF）、1 秒用力呼氣容積（FEV1）、用力肺活量（FVC）的變化。

1.6 標本收集 肺功能指標檢測結束后，斷頭法處死大鼠，收集大鼠的左肺與右肺組織，左肺組織用于大鼠肺濕干質量比值變化的檢測；右肺組織分為兩部分（每部分包含各組6只大鼠的肺組織），一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE 染色，另一部分凍存于-80 ℃用于ELISA和Western Blot實驗。

1.7 大鼠肺濕干質量比值變化的檢測 取各組大鼠左肺組織，擦除表面水分后稱量并記錄其濕質量，再將左肺組織置于60 ℃烤箱中72 h，再稱量并記錄其干質量，最后計算肺濕干質量比值。

1.8 HE 染色檢測各組大鼠肺組織病理變化 將肺組織固定在4%多聚甲醛溶液中24 h，使用不同酒精濃度（70%、80%、90%、95%、100%）梯度脫水，用二甲苯透化組織兩次，每次10 min，用石蠟包埋并切成4 μm厚的切片。將組織切片用二甲苯脫蠟，經HE染色后，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，然后用中性香脂密封。肺組織的形態學觀察在普通光學顯微鏡下進行。

1.9 ELISA 法檢測大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性 嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA水平及SOD活性。

1.10 Western Blot 法檢測大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達 使用放射免疫沉淀測定裂解緩沖液提取肺組織勻漿蛋白質，并根據二辛可寧酸試劑盒使用說明書測定總蛋白質濃度。通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質，再將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜中。用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，并與一抗p-PI3K（1∶4 000）、p-Akt（1∶5 000）、p-mTOR（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶3 000）、mTOR（1∶4 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃孵育過夜。然后將膜與二抗（1∶3 000）在室溫下孵育1 h。ECL 試劑用于可視化膜上的免疫印跡，并使用ImageJ軟件測量蛋白條帶強度。

1.11 統計學處理方法 使用SPSS 25.0 統計軟件對數據進行分析。符合正態分布且方差齊的數據以均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析用于分析多組之間的比較，進一步兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白術內酯Ⅰ對各組大鼠肺功能的影響 結果見圖1。與對照組比較，模型組大鼠PEF、FEV1、FVC降低（P＜0.01）；與模型組比較，白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠PEF、FEV1、FVC 升高（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ低劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠PEF、FEV1、FVC 升高（P＜0.01）；與模型組比較，IGF-1組大鼠PEF、FEV1、FVC 降低（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ高劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1 組大鼠PEF、FEV1、FVC降低（P＜0.01）。

圖1 白術內酯Ⅰ對大鼠肺功能PEF、FEV1、FVC 變化的影響（±s，n=12）Figure 1 Effects of atractylenolideⅠon the changes of PEF，FEV1 and FVC in rats（±s，n=12）

2.2 白術內酯Ⅰ對各組大鼠肺水腫的影響 結果見圖2。與對照組比較，模型組大鼠肺濕干質量比值升高（P＜0.01）；與模型組比較，白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺濕干質量比值降低（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ低劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺濕干質量比值降低（P＜0.01）；與模型組比較，IGF-1 組大鼠肺濕干質量比值升高（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ高劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1 組大鼠肺濕干質量比值升高（P＜0.01）。

圖2 白術內酯Ⅰ對大鼠肺濕干質量比值變化的影響（±s，n=12）Figure 2 Effect of atractylenolideⅠon the changes of lung wet/dry mass ratio in rats（±s，n=12）

2.3 白術內酯Ⅰ對各組大鼠肺組織病理變化的影響結果見圖3。對照組大鼠肺組織結構正常，模型組大鼠肺組織肺泡間隔變大，肺間質水腫且存在大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織病理損傷減輕；與白術內酯Ⅰ低劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織病理損傷減輕；與模型組比較，IGF-1 組大鼠肺組織病理損傷嚴重；與白術內酯Ⅰ高劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1組大鼠肺組織病理損傷加劇。

圖3 白術內酯Ⅰ對大鼠肺組織病理變化的影響（HE 染色，×200）Figure 3 Effect of atractylenolideⅠon pathological changes of lung tissues in rats（HE staining，×200）

2.4 白術內酯Ⅰ對各組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性的影響 結果見圖4。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA水平升高，SOD 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ低劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，IGF-1 組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD 活性降低（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ高劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1 組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD活性降低（P＜0.01）。

圖4 白術內酯Ⅰ對大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性變化的影響（±s，n=6）Figure 4 Effects of atractylenolide Ⅰon the levels of IL-6，TNF-α，MDA and SOD activity in lung tissues of rats（±s，n=6）

2.5 白術內酯Ⅰ對各組大鼠肺組織中PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白表達的影響 結果見圖5、圖6。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，白術內酯Ⅰ低劑量組、白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達降低（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ低劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量組、陽性藥物組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，IGF-1 組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達升高（P＜0.01）；與白術內酯Ⅰ高劑量組比較，白術內酯Ⅰ高劑量+IGF-1組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 白術內酯Ⅰ對大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達變化的影響（±s，n=6）Figure 6 Effects of atractylenolideⅠon the protein expressions of p-PI3K，p-Akt and p-mTOR in lung tissues of rats（±s，n=6）

3 討論

兒童反復呼吸道感染是一種常見的呼吸道疾病，病理學和病因機制復雜[4]。臨床上認為，該病的發病與免疫功能障礙、維生素缺乏、營養不良、微生物感染和護理不當有關[12]。目前反復呼吸道感染通常采用對癥治療，但治療效果有待進一步提高[13]。因此，探討該病的具體發病機制和新的治療方法具有重要的意義。

本研究首先采用疲勞結合飲食失節聯合刨花加煙葉煙熏的方法構建肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠PEF、FEV1、FVC 降低，肺濕干質量比值升高，肺組織病理損傷嚴重，表明肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺功能異常，且存在肺水腫及肺組織病理損傷。IL-6、TNF-α 是常見的促炎性細胞因子，其在反復上呼吸道感染肺氣虛證患者血清中的水平高于正常水平[14]。氧化應激被定義為活性氧（ROS）生成與細胞抗氧化能力之間的失衡，SOD的主要功能是清除ROS，并通過維持細胞的氧化還原平衡來防止氧化應激，而MDA是氧化應激的重要生物標志物，被廣泛用作氧化損傷的指標[15]；已有報道[16]顯示，肺脾氣虛反復呼吸道感染患兒血清中SOD 活性降低，MDA 水平升高。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD 活性降低，表明肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺組織存在炎癥反應及氧化應激。因此，抑制炎癥反應及氧化應激可能是改善肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷的有效途徑之一。

白術內酯Ⅰ是蒼術中的主要生物活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[17]。據報道，白術內酯Ⅰ可抑制缺血/再灌注損傷大鼠氧化應激[18]；白術內酯Ⅰ可抑制煙曲霉角膜炎小鼠炎癥反應[19]。以上研究證實了白術內酯Ⅰ在多種疾病中發揮著抗炎、抗氧化作用。本研究結果與其是一致的。本研究顯示，白術內酯Ⅰ可抑制肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠炎癥反應及氧化應激，且白術內酯Ⅰ劑量越高，抑制作用越明顯。此外，阿莫西林克拉維酸鉀是臨床上常用于治療小兒反復呼吸道感染的藥物[20]，本研究設置該藥物為陽性藥物。結果顯示，高劑量白術內酯Ⅰ與阿莫西林克拉維酸鉀對肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠炎癥反應及氧化應激的抑制作用差異無統計學意義，提示白術內酯Ⅰ可能為治療肺脾氣虛反復呼吸道感染的潛在有效藥物之一。

PI3K/Akt/mTOR 通路是炎癥和氧化應激進展的最常見因素之一，PI3K/Akt/mTOR 通路及其相關分子被視為肺損傷的防治靶點[21]。如抑制PI3K/Akt/mTOR 途徑可改善博萊霉素誘導的肺損傷小鼠炎癥反應及氧化應激[22]。本研究顯示，IGF-1 組大鼠肺組織炎癥反應及氧化應激水平高于模型組，且IGF-1 為PI3K 激活劑，表明PI3K/Akt/mTOR 通路確實參與了肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷過程。此外，本研究還發現，白術內酯Ⅰ可抑制肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達，且白術內酯Ⅰ劑量越高，抑制作用越明顯，提示白術內酯Ⅰ可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷。為了驗證該推測，本研究在高劑量白術內酯Ⅰ作用的基礎上再加上PI3K 激活劑IGF-1 來干預肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠，結果顯示，IGF-1減弱了高劑量白術內酯Ⅰ對肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷的改善作用。此證實了猜想的正確性，即白術內酯Ⅰ可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷。

綜上所述，白術內酯Ⅰ可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷。白術內酯Ⅰ改善肺脾氣虛反復呼吸道感染大鼠肺損傷的機制較為復雜，具體通過PI3K/Akt/mTOR 通路下游的哪些蛋白來發揮作用有待后續實驗深入探究。