木犀草素抑制丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶及其抗艱難梭菌作用研究

肖麗君，趙文靜，齊曉怡，呂沐瀚，梁思成（.西南醫科大學附屬醫院消化內科，四川瀘州 646000；. 西南醫科大學附屬醫院皮膚科，四川瀘州 646000）

艱難梭菌（Clostridiumdifficile，CD）是一種革蘭陽性、產毒厭氧芽孢桿菌，可引起抗菌藥物相關性腹瀉及假膜性腸炎（Pseudomembmous colitis，PMC），統稱為艱難梭菌相關性腹瀉（Clostridium difficile associated diarrhea，CDAD），嚴重時可伴有巨結腸和/或爆發性感染等并發癥[1]。近年來，由于艱難梭菌毒力的改變和流行菌株的出現，一線抗生素治療艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的失敗率高達38%，其發病率和死亡率逐年上升[2]。傳統抗生素的使用破壞了腸道微生物群，阻止了共生微生物群在腸道內的重新繁殖，使艱難梭菌再次增殖，最終導致艱難梭菌感染復發。艱難梭菌感染通常是復發惡性循環的開始，高達35%的艱難梭菌感染病例在初次診斷后會復發。據估計，艱難梭菌感染首次復發后，高達60%的患者可能再次復發[3]，給患者和醫療系統帶來沉重負擔。

糞菌移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）是一種有效的治療方法，它可以通過改變腸道微生物組來解決復發性/難治性艱難梭菌感染等問題。然而，約20%的艱難梭菌感染患者在接受初始糞菌移植后仍會出現復發[4]。本課題組前期研究表明，基于艱難梭菌的關鍵代謝酶PFOR 酶對糞菌移植供體進行篩選，可以提高糞菌移植治療艱難梭菌感染的臨床療效（專利申請公布號：CN 114480562 A，公布日期：2022-05-13）。PFOR 酶在艱難梭菌的丙酮酸代謝中發揮著重要的作用，它只存在于一些厭氧病原微生物中，而在哺乳動物體內和一些厭氧革蘭陽性、非孢子形成細菌以及嚴格的需氧菌中都不表達[5-7]。因此，PFOR 酶可能是糞菌移植治療艱難梭菌感染過程中的一項關鍵生物標記物。

最近的研究表明，FMT聯合飲食調節是一種有效的治療策略，蔬菜和水果的攝入被認為發揮了重要作用[8]。黃酮類化合物是植物中含量最多的一類多酚，它是以C6-C3-C6 骨架為特征的植物次級代謝物，廣泛分布于漿果、歐芹、羽衣甘藍等蔬菜水果中[9]。類黃酮不僅可以作為腸道菌群的營養物質，促進腸道菌群的生長和繁殖；還可以改善腸道環境，從而促進良性菌群的形成，增加腸道微生物的多樣性和穩定性[10]。除此之外，類黃酮還表現出潛在的天然抗菌活性，類黃酮已被證明是低毒性且對耐藥菌具有高活性的天然抗菌劑。已知的類黃酮分子已超過8 000 種，其中具有抗菌活性的結構主要包括黃酮、黃烷醇、黃烷酮等[11]。因此，含有黃酮類化合物的食品或藥食同源植物有利于調節腸道微生物組的平衡，可以作為糞菌移植治療艱難梭菌感染的一種輔助方法，降低艱難梭菌復發的風險。針對這一點，我們選取了一些具有代表結構的黃酮、黃烷醇、黃烷酮化合物（圖1），旨在尋找具有強PFOR 酶抑制活性的天然類黃酮化合物，并考察其對艱難梭菌的抗菌作用。這些研究結果將為糞菌移植聯合飲食治療提供理論基礎和新思路。

圖1 三種類黃酮化合物的結構Figure 1 The structures of three subtype of flavonoids

1 材料與方法

1.1 菌株 艱難梭菌ATCC BAA 1382 和ATCC BBA 1870來自美國微生物菌株保存中心。

1.2 藥物及試劑 兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、橙皮苷、新橙皮苷，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號分別為：E-011-120416、 B-020-120723、 E-023-120316、B-022-120719、 C-006-120321、X-010-101214；黃芩素、漢黃芩素、木犀草素，成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為：A0018、A0502、MUST-19090414；丙酮酸鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F2103284；輔酶A，上海吉至生化科技有限公司，批號：C270337DA；1，1’-二芐基-4，4’-二吡啶二氯化物（Benzyl Viologen，BV），上海邁瑞爾化學技術有限公司，批號：F69907056；六水氯化鎂，成都市科隆化學品有限公司，批號：2021020101；磷酸二氫鉀，天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20180301101；磷酸氫二鉀，上海泰坦科技股份有限公司，批號：P1612692；氨芐青霉素、硝唑尼特和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，上海麥克林生化科技股份有限公司，批號分別為C12916820、C12161817；LB 肉湯培養基和LB 瓊脂培養基，青島海博生物技術有限公司，批號分別為HB0128 和HB0129-2；強化梭菌增殖培養基RCM，百盈利創生物科技（北京）有限公司，批號：20210854；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司，批號：1215T025；厭氧盒和厭氧產氣袋，日本三菱瓦斯化學股份有限公司，批號分別為2272LH-2和2272LH-1；甲硝唑和萬古霉素，上海麥克林生化科技股份有限公司，批號分別為C11185584和C15030877。

1.3 儀器 Milli-Q IQ 7000 型純水儀，默克化工技術（上海）有限公司；Eppendorf msc-100 恒溫震蕩性恒溫金屬浴，德國eppendorf公司；上海齊欣GHP-9080隔水式恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；ZAI-350-II 厭氧培養箱，上海喆圖科學儀器有限公司；1300 系列II 級A2 型生物安全柜，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；立式GR 高溫滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司。

1.4 PFOR 酶的異位表達及活性測定 PFOR 粗酶的提取及活性測定方法與前述研究[5]一致，即在厭氧條件，25 ℃下，用100 mmol·L-1磷酸鉀（pH7.4）、10 mmol·L-1丙酮酸鈉、5 mmol·L-1BV、0.18 mmol·L-1、CoA和1 mmol·L-1MgCl2測定PFOR。在存在或不存在抑制劑（濃度為40 μmol·L-1的硝唑尼特）的情況下，通過添加酶開始反應，并在546 nm 處監測氧化還原活性BV染料的還原。PFOR的抑制以百分比表示。

1.5 艱難梭菌的生長曲線、生長抑制及最小抑菌濃度（MIC）測定 實驗選取ATCC BBA 1382、ATCC BBA 1870 艱難梭菌菌株。-80 ℃甘油凍存的菌株復蘇后，吸取適量菌液接種至液體培養基后，放置于37 ℃培養箱厭氧培養24～48 h。復蘇后的細菌傳代兩次后，吸取適量菌液在新的液體培養基中，放入厭氧箱進行培養。每隔2 h 吸取少量菌液，測定600 nm 處的吸光度（OD600）值，以此檢測艱難梭菌的生長，并判斷其對數生長期。根據CLSI M11 A7標準，采用瓊脂稀釋法測定化合物的MIC，將不同濃度的化合物與RCM 熔融固體培養基混勻，使濃度為0.062 5～256 μg·mL-1不等。待其凝固后，挑取適量單菌落懸浮于生理鹽水，將菌液濁度調節至OD600＝0.2，此時菌液濃度約為1×108CFU·mL-1。將此2 μL 菌液直接點種在化合物固體稀釋瓊脂板中，使瓊脂板上的接種量約為105GFU/點。同時設置空白組，將準備好的所有六孔板置于37 ℃厭氧培養48 h 后，通過肉眼觀察，完全或顯著抑制菌體生長的最低藥物濃度為MIC。

1.6 不同藥物濃度時間-抑菌作用曲線 根據測定出來的MIC 值，選取1/2 MIC、1 MIC、2 MIC 濃度藥物與兩株艱難梭菌共同孵育，分別在0、4、8、12、24、48 h測定菌液的600 nm處吸光度，繪制濃度-時間抑菌曲線。

1.7 分子對接模擬 通過AutoDockTools 4.2 軟件進行分子對接，探索木犀草素與非洲脫硫弧菌PFOR 酶（蛋白質數據庫[PDB]1B0P）之間的相互作用。使用AlloSite 服務器和AlloSitePro 方法分析PFOR 中木犀草素的優選結合位點。創建網格盒并準備PDBQT 文件和配體后，使用蛋白質和配體信息以及配置文件中的網格盒屬性（60×60×60 xyz 點，網格間距0.375?）使用AutoDockTools 進行對接。使用PyMOL 2.5 和LigPlot 2.2軟件對對接結果進行可視化和分析。

1.8 統計學處理方法 使用Graphpad prism 9.0 軟件對數據進行統計分析并繪圖，計量資料結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 硝唑尼特對PFOR 的抑制作用 有研究[12]報道，陽性抑制劑硝唑尼特（NTZ）在40 μmol·L-1的濃度下，對PFOR的抑制率約為40%。提取PFOR酶[5]后，考馬斯亮藍法測定所提取粗酶液的蛋白濃度，約為3.22 mg·mL-1。為確定最佳反應時間和濃度，以硝唑尼特對PFOR 的抑制率作為參照，設置不同的反應時間和濃度。如圖2-A 所示，在厭氧條件下，酶濃度為64 μg·mL-1時，反應約8 h 后，40 μmol·L-1的硝唑尼特對所提取的PFOR 的抑制率約為40%，由此確定反應時間和濃度。同時，設置不同的硝唑尼特濃度，按照上述反應體系，測定硝唑尼特對PFOR 的半數抑制濃度（IC50）約為23 μmol·L-1，見圖2-B，與既往報道[13]的24 μmol·L-1基本接近。結果表明PFOR 酶的異位表達及提取成功。

圖2 硝唑尼特對PFOR 的抑制作用（±s，n=3）Figure 2 The inhibition of nitazoxanide on PFOR（±s，n=3）

2.2 黃酮類化合物對PFOR 酶抑制作用初篩 分別選取黃酮、黃烷醇、黃烷酮等幾種類黃酮化合物，參照陽性抑制劑硝唑尼特，選取濃度40 μmol·L-1與PFOR共同孵育，在反應前測定546 nm處吸光度作為本底值。8 h后，再次測量546 nm 處吸光度，以不加藥物組作為空白對照，計算PFOR 酶的抑制率。以陽性抑制劑抑制作用作為參照，在所選化合物中，木犀草素對PFOR 抑制作用最強。在硝唑尼特的抑制率為40%時，木犀草素對PFOR的抑制率為33%（圖3），因此選擇木犀草素進行接下來的研究。

圖3 類黃酮化合物對PFOR 的抑制率Figure 3 Inhibition rate of flavonoid compounds on PFOR

2.3 木犀草素對艱難梭菌的生長抑制作用 分別挑取艱難梭菌ATCC BBA 1382、ATCC BBA 1870 單菌落于空白RCM 液體培養基中，設置0、2、4、8、10、12、16、20、24 h 待測管，在相應的時間點取出待測管，測定菌液的在600 nm 處吸光度值，根據吸光度-時間的變化繪制艱難梭菌的生長曲線。結果如圖4-A 所示，當OD600=0.2（4 h）時，兩株艱難梭菌生長進入對數期。進一步探究木犀草素對艱難梭菌是否存在生長抑制作用。當艱難梭菌生長到對數生長期時（OD600=0.2，4 h），將木犀草素與兩株艱難梭菌在液體培養基中共培養，分別在培養0 h 和24 h 時檢測600 nm 處吸光度值，以硝唑尼特作為對照，觀察艱難梭菌的生長情況。如圖4-B、C 所示，空白組（沒有藥物處理）24 h 的菌液吸光度明顯增加（P＜0.01）。與空白組比，在使用硝唑尼特24 h 后，艱難梭菌的生長受到明顯抑制（P＜0.01）；與此一致，使用木犀草素后艱難梭菌的生長也明顯受限（P＜0.05），但兩藥之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 木犀草素對艱難梭菌的生長抑制作用（±s，n=3）Figure 4 The growth inhibition of luteolin on Clostridium difficile（±s，n=3）

2.4 木犀草素對艱難梭菌生長抑制作用的測定 由前述實驗可知，木犀草素對艱難梭菌生長存在抑制作用。因此，測定其對兩株不同艱難梭菌的最小抑菌濃度。將RCM 固體培養基與梯度稀釋的木犀草素混勻后倒入平板，充分晾干后，將艱難梭菌點種在瓊脂表面，厭氧條件下培養48 h，讀取MIC。其數據結果如表1所示，結果表明木犀草素在32 μg·mL-1的濃度下能有效抑制艱難梭菌ATCC BBA 1382 和ATCC BBA 1870的生長。另外，實驗還測定了PFOR 陽性抑制劑硝唑尼特和兩種CDI常用藥物甲硝唑及萬古霉素的MIC以作為對照，結果顯示，硝唑尼特、甲硝唑、萬古霉素3種藥物的MIC分別為0.125、0.125、0.25 μg·mL-1。

表1 木犀草素、硝唑尼特、甲硝唑和萬古霉素的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of luteolin， nitazoxanide，metronidazole and vancomycin

根據已得到的結果，將不同濃度的木犀草素與兩株艱難梭菌在液體培養基中共培養，使木犀草素的終濃度為0（空白組）、1/2 MIC（16 μg·mL-1）、1 MIC（32 μg·mL-1）、2 MIC（64 μg·mL-1），最后繪制濃度-時間抑菌曲線。如圖5所示，與空白組比，木犀草素共培養8 h 起，木犀草素各組中兩種艱難梭菌的生長均被明顯抑制（P＜0.01）；隨著木犀草素濃度的增加，對兩株細菌的抑制作用呈增強趨勢，其中木犀草素2 MIC 組與1/2 MIC 組比，各時間點艱難梭菌的生長均被明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 木犀草素對艱難梭菌的濃度-時間依賴性抑制曲線Figure 5 The concentration-time dependence inhibition curves of luteolin on Clostridium difficile

2.5 分子對接模擬與分析 由于木犀草素在前述實驗中表現出良好的PFOR 抑制作用及對艱難梭菌的生長抑制，因此將木犀草素與PFOR 酶進行分子模擬對接。對接模擬有助于研究PFOR 與木犀草素之間相互作用的機制。由于確定木犀草素的變構位點（結合位點）是前提，因此使用AlloSitePro預測PFOR晶體結構中的變構位置。由于在厭氧菌中PFOR 的關鍵氨基酸、核心結構以及催化機制都是高度保守的，因此選擇來自非洲脫硫弧菌的PFOR 晶體結構用于進一步研究[12]。本實驗以AlloSitePro 用于預測非洲脫硫弧菌（1B0P）PFOR 晶體結構中的變構位置。結果表明，PFOR 的變構位點由Phe114， Ala848， Pro633，Asp456，Ile497，Ile646，Lys458，Arg675，Lys368，Lys459 等氨基酸殘基組成，且變構位點位于酶活性之外的部位，木犀草素在上述變構位點的結合中競爭良好（圖6）。在進一步分析中發現，木犀草素可與PFOR 多個氨基酸殘基形成多條氫鍵，木犀草素B 環3’和4’上的羥基與Asp428，Val431，Thr430 形成氫鍵，A 環上5 號和7 號位C 上的羥基與Asp456，Lys458，Lys459 形成氫鍵，同時C 環含氧吡喃環4 號位上的O 原子也可與Asp456 形成氫鍵，其最低結合能為-7.01 kcal·mol-1（圖7）。

圖6 來自非洲脫硫弧菌（1B0P）的PFOR 三維晶體結構的表面圖Figure 6 Surface representation of the three-dimensional crystal structure of PFOR derived from Desulfovibrio africanus（1B0P）

圖7 木犀草素與PFOR 異構位點相互作用的三維（A）和二維（B）結果Figure 7 3D（A）and 2D（B）result of interactions of luteolin with the allosteric site of PFOR

3 討論

飲食是影響腸道微生物群的主要決定因素之一，與多種疾病的風險和病程相關，飲食療法已應用于多種疾病。研究[14]發現，植物性食物通過為供體微生物群的植入創造有利的生態位和其自身的抗炎作用，可提高糞菌移植的成功率。一項開放標簽的隨機對照臨床試驗[14]表明，糞菌移植聯合抗炎飲食的補充，可有效誘導輕中度UC 患者的臨床緩解。另外，一項2 期臨床試驗發現膳食纖維補充作為糞菌移植的輔助手段可以明顯提高微生物的多樣性和豐富度，改善肥胖患者的胰島素抵抗[15]。除含抗炎物質和膳食纖維外，幾乎所有的植物性食物，如蔬菜、水果等都含有大量的黃酮類化合物。既往研究表明黃酮類化合物具有抗氧化作用，將其作為膳食抗氧化劑可有效預防心血管疾病、糖尿病、癌癥和阿爾茨海默氏癥等認知疾病的發生發展，而對其對腸道菌影響的研究較少[16-17]。本研究發現，食物中高含量的類黃酮化合物如木犀草素可抑制PFOR 酶，阻礙艱難梭菌能量代謝從而對厭氧艱難梭菌具有生長抑制作用。

PFOR 是艱難梭菌厭氧代謝過程中催化丙酮酸氧化脫羧生成CO2的關鍵酶，乙酰輔酶A（acetyl-CoA）在丙酮酸異化過程中起關鍵作用，維持細菌的能量穩態[12，18]，此外，PFOR 將Wood-Ljungdahl 途徑與生成生物合成中間體的不完全還原三羧酸循環聯系起來[19]。PFOR 被發現只存在于一些嚴格的厭氧病原體中，而腸道內一些常駐的有益微生物中不含PFOR，因此一些對PFOR 有抑制作用的化合物展示出良好的抑制艱難梭菌的作用的同時，對腸道正常微生物群的組成沒有影響，有利于腸道菌群的重建，減少艱難梭菌感染的復發[5，7]。

在各類黃酮化合物中，黃酮由于在C 環中存在不飽和雙鍵，延長了AB 環之間的共軛體系，對PFOR的抑制作用較強；同時，在所有被檢測的黃酮化合物中，木犀草素的抑制作用最高，可能是由于木犀草素的B 環上3’，4’上羥基形成鄰二羥基，使其抑制活性提高。因此，在黃酮類化合物對PFOR 酶抑制作用中，不飽和C 環和B 環上鄰位多酚結構的形成發揮重要的作用。與此一致，分子對接發現，木犀草素A 和B 環上的羥基都與PFOR 的氨基酸殘基形成氫鍵。使用BLASTP 網站［Protein BLAST：search protein databases using a protein query（nih.gov）］將其他PFOR酶變構位點中的氨基酸序列進行對比，發現在PFOR酶中與木犀草素相互作用的氨基酸Asp456、Lys458和Lys459都是高度保守的。

作為可食用植物中最常見的類黃酮之一，木犀草素廣泛分布于胡蘿卜、辣椒、芹菜、橄欖油、茶以及谷物等中。據報道[20]，在深色蔬菜和水果中含有豐富的木犀草素等黃酮化合物，在杜松子、百里香中的木犀草素含量約為0.5 g·kg-1，在菊苣、生芹菜等蔬菜中的含量高達3 g·kg-1，在小米等谷物中的含量約為0.3 g·kg-1，在食用和烹飪過程中都能很好地被吸收和利用。一般來說，健康飲食每天約含有2～125 mg木犀草素，攝入富含木犀草素的提取物或分離的木犀草素單體具有多種促進健康和藥理作用，如抗氧化、抗炎、保肝、抗癌和神經保護等特性[21]。在傳統醫學中，含有木犀草素的植物也被用于治療高血壓、炎癥性疾病和癌癥等疾病，也是銀黃顆粒、清熱治痢丸和克痛酊等的有效成分。近年來，木犀草素在各類護膚品中也得到廣泛應用，是醫藥、營養產品和化妝品中不可缺少的成分[22]。迄今為止，木犀草素已作為一種保健食品進行商業開發[19]。木犀草素或富含木犀草素的產品的補充不僅能夠幫助清除體內自由基，保護細胞免受損傷，有助于腸道健康；本研究還表明，木犀草素可發揮抑制艱難梭菌、維護腸道穩態的作用?；谶@些益處，將其作為糞菌移植的輔助治療，可以有效改善患者的癥狀，提高糞菌移植治療艱難梭菌感染的臨床療效。同時，由于其在蔬果中分布廣、含量高，每日只需食用一個蘋果、飲用一杯茶或攝入100 g 的西藍花，即可有效增加木犀草素的攝入量。因此，在糞菌移植治療艱難梭菌感染等疾病期間，通過飲食補充富含木犀草素的蔬菜、水果等植物是一種方便、安全的輔助治療方式。

綜上所述，本實驗顯示木犀草素對艱難梭菌的PFOR 酶具有較好的抑制作用，從而干擾其能量代謝、抑制其生長，為艱難梭菌的治療提供了新思路。本研究證明木犀草素是PFOR 酶的變構抑制劑，通過結合在酶活性中心以外的部位調控底物與酶活性位點的結合，這不僅拓展了PFOR 抑制劑的種類，還豐富了對天然化合物木犀草素的研究，證明PFOR 是抗艱難梭菌治療中的重要靶點，為糞菌移植聯合木犀草素或含木犀草素的藥食同源的飲食治療艱難梭菌感染提供了理論依據。但是本實驗尚有不足，木犀草素對艱難梭菌的抑制活性及結構的關系，以及其體內的抑菌活性，尚需更進一步的研究。