銅死亡相關miRNAs 在乳腺癌中的預后價值及與免疫微環境的關系

王藝馨，符德元

（1.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225000；2.蘇北人民醫院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚州 225000）

乳腺癌（breast cancer，BC）仍是目前全球女性死亡的主要原因。隨著乳腺癌篩查和新治療策略的普及，患者5 年生存率已高達90%，然而其發病率及死亡率仍呈增長趨勢[1，2]。并且由于乳腺癌的高度異質性，具有相同亞型和TNM 分期也可出現截然不同的預后[3]。因而，急需尋找有潛力為乳腺癌患者早期發現、診斷、治療以及預測預后的新型生物標志物。銅（Cu）是生物體所必需的微量金屬元素，而金屬離子過多或過少都會導致細胞死亡[4]。Tsvetkov P等[5]在研究攜帶銅離子的細胞死亡過程中發現了一種新的細胞死亡模式，涉及胞內銅離子，并受其調節，稱為銅死亡（cuproptosis）。銅死亡是通過銅與三羧酸循環的脂?；煞种苯咏Y合發生的，引起脂?；鞍踪|聚集和隨后的鐵硫簇蛋白丟失，最終導致蛋白質毒性應激致細胞死亡。MicroRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA 分子，通過降解mRNA 或抑制mRNA 翻譯成蛋白質來調控廣泛的生物過程[6]。另外，研究發現miRNAs 可通過調節缺氧、鐵死亡等途徑參與癌癥的進展、轉移和免疫治療反應[7，8]。然而目前缺乏對乳腺癌中miRNAs 在銅死亡過程中的功能作用的研究，以及在預測乳腺癌患者預后中的作用。本研究構建了銅死亡相關miRNAs 的預后模型，以評估其與乳腺癌患者預后關系，旨在為乳腺癌的早期診斷以及治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 數據的獲取與處理 從TCGA-GDC 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載獲得乳腺癌患者完整的miRNA 數據和RNA-seq 數據以及臨床信息數據，并通過Perl 軟件進行數據整理。TCGA 數據庫向公眾免費開放，因此不需要額外的倫理證明。

1.2 銅死亡相關基因與miRNA 的篩選 通過R 軟件limma 包對銅死亡相關基因與miRNA 進行Pearson相關性評估。若｜r2|＞0.3；P＜0.001，則被認為顯著相關。edgeR 包用于比較篩選腫瘤樣本和正常樣本之間的差異的mRNA 和銅死亡相關的差異的miRNA，過濾標準為FDR＜0.05 和|log2FC|＞1。

1.3 預后基因篩選及模型構建 收集患者臨床資料，通過R 軟件survival 包對銅死亡相關差異表達基因行單因素Cox 分析得到預后相關基因（P＜0.05），再行多因素Cox 分析。最終確定11 個用于模型構建的對BC 預后有價值的銅死亡相關miRNAs（cuproptosis-related MicroRNAs，CRMs）。根據表達值及相應系數計算風險評分。公式為：Risk score=coef（miRNA1）×expr（miRNA1）+（coefmiRNA2）×expr（miRNA2）+…+coef（miRNAn）×expr（miRNAn）。

1.4 預后風險模型評估及臨床價值分析 根據上述公式計算樣本風險值，以中位值為界將患者分為高風險組和低風險組并進行生存差異分析，繪制K-M生存曲線，1、3、5 年的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，以及風險打分等評估該模型預后預測效能。利用單因素和多因素Cox分析評價風險評分能否作為預后因子。

1.5 靶基因預測及潛在功能分析 使用TargetScan[9]、miRDB[10]和miRTarBase[11]進行miRNA 靶基因預測。為了探索CRMs 是否可能參與BC 的進展，使用Perl 語言預測miRNA 的靶基因，將同時存在于兩個及以上數據庫中的基因定義為miRNA 的靶基因。將這些靶基因與差異表達基因取交集，采用KEGG 與GO 富集分析來揭示這些交集基因的潛在機制功能，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

1.6 免疫微環境浸潤相關分析 CIBERSORT 算法評估每個樣本中22 種免疫細胞在腫瘤微環境（Tumor microenvironment，TME）中的比例，P＜0.05 過濾樣本。利用ssGSEA 算法對高低風險組每個樣本進行免疫細胞、免疫功能和免疫檢查點的差異分析。

1.7 統計學方法 統計分析以及圖片可視化均由R軟件（4.1.2 版）進行。統計顯著性定義為P＜0.05，且所有P值均為雙尾。

2 結果

2.1 銅死亡相關基因與miRNAs 的篩選 通過R 軟件limma 包對19 個銅死亡基因與乳腺癌miRNA（腫瘤樣本1091 例，正常樣本103 例）進行篩選，共得4242 個CRMs。隨后基于edgeR 包篩選出121 個銅死亡相關的差異表達miRNAs，同樣通過edgeR包對乳腺癌mRNA（腫瘤樣本1100 例，正常樣本112 例）進行分析得到5882 個差異表達的mRNA。過濾標準為FDR＜0.05 和|log2FC|＞1。

2.2 預后基因的篩選及模型的構建 經單因素以及多因素Cox 分析（P＜0.05），最終得到11 個有預后價值的CRMs 并以森林圖形式展示，見圖1。風險評分公 式：Risk score=（0.003935704×hsa-mir-592）+（0.021151117×hsa-mir-4501）+（0.13583739×hsamir -7974）+（0.291802054 ×hsa -mir -549a）+（0.061157431×hsa-mir-4675）+（-0.224946382×hsamir -4658）+（-0.062466584 ×hsa -mir -618）+（0.068830528×hsa-mir-1293）+（0.167058581×hsamir -466）+（0.01933156 ×hsa -mir -4533）+（0.019609619×hsa-mir-3923）。

圖1 個銅死亡相關miRNAs 的多因素Cox 分析森林

2.3 預后風險模型預測效能評估 對高、低風險組進行生存差異分析，根據K-M 生存曲線、風險評分圖、生存狀態圖和風險熱圖的結果可知隨著風險評分增加，患者死亡率逐漸升高，高風險組患者OS 明顯低于低風險組，兩組存在顯著生存差異（P＜0.001），風險評分對BC 患者預后有顯著影響，見圖2A～圖2D。并 且1、3、5 年生存結果AUC值分別為0.723、0.688、0.686，見圖2E，表明該模型具有良好的預測生存能力。對臨床特征與風險評分進行單因素和多因素Cox 分析顯示年齡與風險評分是BC 患者的獨立預后因子，見圖2F、圖2G。最后將風險評分納入構建生存列線圖，校準曲線顯示預測概率與實際概率基本一致，見圖2H、圖2I。

圖2 乳腺癌銅死亡相關miRNAs 預后模型的構建

2.4 功能分析 將預測的4625 個靶基因與5882 個差異表達mRNA 取交集獲得1264 個交集基因，對乳腺癌潛在功能進行分析。KEGG 富集分析顯示，在癌癥中蛋白聚糖、Wnt 信號通路、癌癥中MicroRNAs、病毒致癌等多個癌癥相關通路富集，見圖3A。GO 富集分析，BP 提示基因在細胞生長、細胞形態發生調節、細胞周期負調控、Wnt 信號通路等富集；CC提示基因在粘著斑、細胞基質連接等過程富集，見圖3B；MF 提示基因調控特異性RNA 聚合酶IIDNA 結合轉錄因子結合、DNA 結合轉錄因子結合，見圖3C，表明大多數目標靶基因都參與了癌癥相關通路，揭示CRMs 可能在BC 進展中發揮重要作用。

圖3 乳腺癌相關靶基因的功能富集分析

2.5 免疫微環境浸潤相關分析 進一步探索與抗腫瘤免疫之間的關系，見圖4A、圖4B，兩組免疫細胞浸潤存在差異，在低風險組中腫瘤浸潤性CD8+T 細胞、幼稚B 細胞、漿細胞、靜息肥大細胞比例高于高風險組，而高風險組中M2 巨噬細胞、M0 巨噬細胞比例高于低風險組。另外，在免疫細胞評分中B 細胞、CD8+T 細胞、肥大細胞、NK 細胞、pDCs、Tfh、Th2 細胞、TIL 在低風險組中較高，見圖4C。在免疫功能評分中趨化因子受體、免疫檢查點、溶細胞活性、副炎癥、T 細胞共刺激以及Ⅰ型干擾素反應、Ⅱ型干擾素反應在高低風險組之間存在差異，見圖4D。并進一步探討了高、低風險組免疫檢查點分子表達差異，共21 個差異表達的免疫檢查點，常見的如PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CD40、CD40LG和CD27 在低風險組中表達水平高于高風險組，見圖4E，這表明低風險組乳腺癌患者可能是免疫治療的候選者。

圖4 乳腺癌銅死亡相關miRNAs 免疫相關分析

3 討論

銅穩態失衡會影響腫瘤細胞的生長并誘導其死亡[12]。當胞內銅離子異常升高時，離子載體將其轉運到線粒體，直接與三羧酸循環的脂?；煞纸Y合致脂?；鞍追e累和鐵硫簇蛋白丟失，導致蛋白毒性應激致細胞死亡[5，13]。乳腺癌和卵巢癌組織中銅死亡關鍵基因FDX1 與?；鞍妆磉_高度相關，因而有希望利用靶向治療具有銅死亡這種代謝特征的腫瘤。

研究發現[14]，銅死亡相關LncRNA 在預測乳腺癌預后和腫瘤免疫浸潤等方面具有良好表現。本研究發現的11 個CRMs 中，大部分miRNAs 已有報道可作為腫瘤抑制因子或癌基因，其表達異常與乳腺癌等腫瘤的進展密切相關，影響患者生存預后。如hsa-miR-549a 可預測膠質細胞瘤患者的預后[15]。而hsa-miR-446、hsa-miR-618 作為重要的腫瘤抑制因子，在抑制腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲并誘導細胞凋亡方面發揮作用[16，17]。研究發現[18]，hsa-miR-592 可靶向TGF-β 抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，但其在BC 組織和細胞系中表達顯著低于正常組織，與晚期臨床分期、遠處轉移和淋巴結轉移有關。此外，hsa-miR-3923 可作為預測乳腺癌淋巴轉移的標志物[19]。Takagawa Y 等[20]在小鼠模型中發現hsamiR-1293 能抑制腫瘤細胞生長，并揭示其與DNA損傷劑或放射療法的聯合使用可能對癌癥治療有效。hsa-miR-4501 可能參與結膜黑色素瘤的轉移擴散[21]。因此，用于模型構建的miRNAs 參與調控腫瘤的生長、侵襲與轉移等。通過對KEGG 分析發現主要富集在癌癥中的蛋白聚糖、PI3K-AkT 信號通路等通路。蛋白聚糖是構成乳腺微環境主要信號傳導和結構成分的功能性蛋白質，在腫瘤進展和轉移中發揮重要作用[22]。Guo J 等[23]研究發現，銅激活PI3K-AKT 信號通路促進乳腺腫瘤發生。使用TTM等銅螯合劑可有效抑制AKT 激酶活性，對抗過度活躍的AKT 驅動的腫瘤，減弱致癌功能。因此，用于構建模型的CRMs 參與調控腫瘤相關信號通路，為模型的臨床應用提供了生物學的證據。

隨著免疫檢查點阻斷（ICB）療法的深入研究，抗PD-1/PD-L1 在乳腺癌治療中顯示出良好的臨床效果。ICB 的療效與TME 密切相關，在具有較少浸潤性細胞毒性T 細胞和較低PD-L1 表達的免疫“冷”腫瘤中較差[24]。而乳腺癌大多表現為免疫“冷”腫瘤[25]。若將免疫“冷”腫瘤轉化為免疫“熱”腫瘤可能會增強乳腺癌對ICB 治療的反應。在本研究中，高風險組浸潤的腫瘤殺傷免疫細胞CD8+T 細胞較少，而促進腫瘤增殖和轉移的免疫細胞M2 巨噬細胞增加；并且高風險組在CD8+T 細胞、NK 細胞、pDCs、B 細胞、肥大細胞、Th2 細胞、濾泡輔助T 細胞等具有抗腫瘤免疫效應的免疫細胞評分低于低風險組，與既往研究一致[26-28]。此外，低風險組患者中免疫檢查點PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CD40、CD40LG 和CD27 表達水平較高。因而推測相較于BC 高風險組患者而言，低風險組患者表現出更強的抗腫瘤免疫效應，傾向于免疫“熱”，更可能受益于免疫檢查點抑制劑。這些發現表明CRMs 與TME 相關，可用于靶向免疫治療。近來研究發現銅可調節癌細胞中PD-L1 表達發揮抗腫瘤免疫作用。Voli F 等[29]研究發現，銅螯合劑TEPA 通過下調神經母細胞瘤腫瘤中的PD-L1 來增強免疫細胞的腫瘤浸潤并提高小鼠存活率。此外，研究還發現miRNA 可以調節免疫檢查點，用于免疫治療。如hsa-miR-4759 可抑制PD-L1 表達并增加腫瘤組織中CD8+T 細胞浸潤，促進BC 抗腫瘤免疫[30]?？傊?，據以往研究及本研究可推測CRMs 在免疫浸潤方面發揮重要作用，可影響乳腺癌免疫狀態，進而影響腫瘤的進展。為探索潛在的腫瘤靶向療法提供新思路。

綜上所述，CRMs 可能與乳腺癌發展有關，并定義了一種新型預后模型，為乳腺癌預后預測及免疫學領域特征提供了見解。然而，本研究還存在一些不足。首先，本研究分析是對公共數據庫數據的二次分析，數據來源單一，且存在選擇偏倚，影響結果準確性；其次，本研究對乳腺癌CRMs 的作用機制及與腫瘤免疫之間的潛在機制還需進一步實驗驗證。