Rap1 GTP酶激活蛋白對結腸癌細胞增殖、侵襲和遷移作用的影響

靳 英,付小霞,段瑞敏,郝力瑤,李 峰

結腸癌發病率位居全球癌癥的第3位,也是癌癥相關死亡的第二大原因,2020年全球約190萬新發病例,死亡約93.5萬例[1]。近年,結腸癌的治療雖取得較大進展,但晚期診斷和治療失敗,導致結腸癌患者的預后仍較差。因此,尋找新的癌基因對探求結腸癌的病理、生理機制,提供新的腫瘤預警和治療方法具有重要意義。

Rap1 GAP是Rap1的GTP酶激活蛋白,可使與Rap1結合的GTP水解為GDP,從而促進蛋白失活。Rap1 GAP家族作為腫瘤抑癌基因被逐漸認識。Rap1是Ras家族的成員之一,屬于小分子G蛋白,可影響細胞的增殖、黏附和血管生成等生理過程。Rap1存在兩種構象,與GDP結合后使其失活,與GTP結合后可發揮其生物學效應。Rap1活性失調與腫瘤的發展密切相關,故調控Rap1活性的Rap1 GAP也參與腫瘤的惡性進展[2-3]。已有研究表明,與良性病變相比,Rap1 GAP在多種惡性腫瘤中表達降低,提示其可能是腫瘤細胞惡性轉化中的重要環節[4]。本文旨在探討Rap1 GAP在結腸癌中的表達及對結腸癌細胞惡性生物學行為的影響,為進一步探究結腸癌的發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2019年1月～2021年12月山西醫科大學附屬忻州醫院存檔的125例結腸癌組織和配對的癌旁正常組織標本(距腫瘤邊緣>5 cm)。其中高+中分化109例,低分化16例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期21例,Ⅲ+Ⅳ期104例;男性66例,女59例,年齡39～85歲,平均(66.4±10.2)歲。所有患者術前均未接受新輔助治療,行結腸癌根治術或姑息性腫塊切除術,術后病理檢查均證實為腺癌。

1.1.2細胞系 人正常結腸上皮細胞系HCoEPiC和人結腸癌細胞系LOVO、HCT116、SW480,均購自武漢普諾賽公司。

1.1.3主要試劑 Rap1 GAP(19174-1-AP)抗體購自美國Proteintech Group公司;慢病毒由上海吉凱公司構建。RIPA蛋白裂解液購自北京索萊寶公司;DMEM、Ham’s F-12K、McCoy’s 5A和Leibovitz’s L-15培養基購自武漢普諾賽公司,Matrigel膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋,5 μm厚切片,HE染色,鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法,病變蠟塊連續4 μm厚切白膠片,兔抗人Rap1 GAP單克隆抗體(稀釋比1 ∶1 000,SAB公司),二抗和免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行,用PBS代替一抗作為陰性對照。Rap1 GAP表達定位于胞質和(或)胞膜,腫瘤細胞胞質和(或)胞膜出現棕黃色或褐色顆粒為陽性。(1)根據細胞著色程度計分:無陽性著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分比計分:陽性細胞數≤10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。將上述兩項評分結果相加作為最終結果:0～3分為(-);4～5分為(+);6～7分為(),其中(-)為缺失表達。

1.2.2細胞培養 人正常結腸上皮細胞系HCoEPiC用90%高糖DMEM培養基培養,人結腸癌細胞LOVO用Ham’s F-12K培養基培養,HCT116用McCoy’s 5A培養基培養,SW480用Leibovitz’s L-15培養基培養,以上培養基均添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素。

1.2.3Western blot法 細胞于細胞裂解液和蛋白酶抑制劑混合物中裂解30 min,將獲得的蛋白上清進行定量后樣品使用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離,然后轉移至PVDF膜。PVDF膜經5%脫脂牛奶封閉,加入相應一抗Rap1 GAP(稀釋比1 ∶5 000)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)孵育。隨后與辣根過氧化物標記山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶10 000)避光孵育,并通過化學發光儀顯影后分析條帶。

1.2.4慢病毒轉染和分組 sh-Rap1 GAP慢病毒和LV-Rap1 GAP慢病毒及其對照慢病毒(sh-NON和LV-NON)由上海吉凱基因構建。按照吉凱公司提供的慢病毒轉染手冊進行轉染實驗,轉染72 h后,以5 μg/mL嘌呤霉素篩選轉染成功的結腸癌LOVO、HCT116、SW480細胞,作用時長為5～7天。將篩選存活細胞,使用2.5 μg/mL嘌呤霉素繼續培養。

1.2.5MTT法檢測細胞增殖 將細胞按每孔3×103個的密度接種于96孔板,培養1～3天,采用MTT法檢測細胞增殖水平,酶標儀檢測波長為490 nm處的吸光度值。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 Transwell侵襲實驗:上室加入65 μL Matrigel,置于培養箱中放置1.5 h,隨后向上室加入200 μL無血清細胞懸液(包含5×104個細胞),下室加入600 μL完全培養基。Transwell遷移實驗:按照上述方法將3×105個細胞置于1 mL不含血清的培養基內,吹打混勻,吸取200 μL的無血清細胞懸液接種于Transwell上室內,下室為600 μL完全培養基(含有血清)。24 h后取出24孔板,使用4%多聚甲醛固定細胞30 min,PBS沖洗3～5次,每次15 min,使用1%結晶紫室溫染色15 min,用PBS清洗,倒置顯微鏡下觀察上室底面細胞數。

2 結果

2.1 Rap1 GAP缺失表達與結腸癌臨床病理特征的關系125例結腸癌標本中,Rap1 GAP缺失表達83例,缺失表達率為66.4%,癌旁對照組織Rap1 GAP缺失表達9例,缺失表達率為7.2%,兩組間差異有統計學意義(P<0.001)。結腸癌中,Rap1 GAP缺失表達與腫瘤分化程度(P=0.011)、是否伴黏液腺癌(P=0.028)有關,而與患者性別、年齡、腫瘤發生部位、臨床分期和淋巴結轉移均無關(表1)。

表1 Rap1 GAP缺失表達與結腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2 不同結腸癌細胞系中Rap1 GAP的表達Western blot法檢測人正常結腸上皮細胞HCoEPiC和人結腸癌細胞系LOVO、HCT116、SW480中Rap1 GAP的表達,結果顯示,與人正常結腸上皮細胞HCoEPiC(0.189±0.081)相比,Rap1 GAP在LOVO(0.238±0.008)細胞中表達最高,在HCT116(0.064±0.002)、SW480(0.152±0.026)細胞中的表達較低,差異有統計學意義(F=159.6,P<0.05,圖1)。

圖1 Western blot法檢測結腸癌細胞系中Rap1 GAP的表達:與HCoEPiC相比,*P<0.05

2.3 下調Rap1 GAP表達對LOVO細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響選取LOVO細胞轉染Rap1 GAP低表達慢病毒,Western blot法檢測結果顯示,LOVO細胞中sh-Rap1 GAP-1組(0.733±0.071)、sh-Rap1 GAP-2組(0.559±0.136)和sh-Rap1 GAP-3組(0.606±0.037)的Rap1 GAP蛋白表達水平比LOVO組(1.880±0.129)明顯降低(F=49.57,P<0.05,圖2A),sh-NON組Rap1 GAP表達與LOVO組相比,差異無統計學意義(圖2A)。選用sh-Rap1 GAP-2、sh-Rap1 GAP-3和sh-NON組進行細胞功能檢測。MTT增殖實驗結果顯示:培養72 h時,與sh-NON組(1.260±0.109)相比,sh-Rap1 GAP-2組(1.569±0.059)和sh-Rap1 GAP-3組(1.548±0.087)細胞增殖能力顯著提高(F=28.36,P<0.05,圖2B)。Transwell侵襲實驗結果顯示:sh-Rap1 GAP-2、sh-Rap1 GAP-3組細胞侵襲能力明顯高于sh-NON組(P<0.05,圖2C)。Transwell遷移實驗與侵襲實驗結果一致(P<0.05)。

圖2 下調Rap1 GAP表達對LOVO細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響:A. Western blot法檢測Rap1 GAP蛋白表達水平;B.MTT實驗檢測下調Rap1 GAP后各組細胞的增殖水平;C.Transwell實驗檢測各組細胞侵襲和遷移能力;與sh-NON組比較,*P<0.05

2.4 上調Rap1 GAP表達對HCT116和SW480細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響選取HCT116和SW480細胞轉染Rap1 GAP過表達慢病毒,Western blot結果顯示,HCT116細胞轉染過表達慢病毒后,與LV-NON組(0.485±0.097)相比,LV-Rap1 GAP組(1.395±0.137)Rap1 GAP蛋白表達相對較高,差異有統計學意義(P<0.05,圖3A)。MTT實驗結果顯示,培養72 h時,與LV-NON組(0.652±0.047)相比,LV-Rap1 GAP組(1.212±0.038)細胞增殖能力顯著降低(P<0.05,圖3B);Transwell實驗結果顯示,與LV-NON組相比,LV-Rap1 GAP組細胞侵襲和遷移能力顯著降低(P<0.05,圖3C)。

圖3 上調Rap1 GAP表達對HCT116、SW480細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響:A.Western blot法檢測Rap1 GAP蛋白表達水平,與LV-NON組相比,*P<0.05;B.MTT實驗檢測上調Rap1 GAP后各組細胞的增殖水平,與LV-NON組相比,*P<0.05;C.Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲和遷移能力

SW480細胞的轉染結果,增殖、侵襲和遷移能力與HCT116細胞一致。

3 討論

Rap1屬于GTP酶蛋白,可通過與其他蛋白相互作用,調節腫瘤細胞的遷移、侵襲、轉移等病理、生理過程,Rap1信號通路的激活與惡性腫瘤的侵襲性表型相關,活化形式的Rap1受到GTP酶激活蛋白的負調控[5]。Rap1 GAP是針對Rap1具有GTP酶活性的蛋白,研究發現Rap1 GAP在卵巢癌[6]、子宮頸癌[7]、乳腺癌[8]、胃癌[9]、子宮內膜癌[10]等多種腫瘤中缺失表達,且Rap1 GAP缺失表達與胃癌、子宮內膜癌等腫瘤的不良預后有關,提示其可能作為腫瘤抑制因子發揮作用。本組采用人結腸癌細胞系檢測Rap1 GAP表達,與人正常結腸上皮細胞系HCoEPiC相比,Rap1 GAP在人結腸癌細胞系HCT116和SW480中的表達被抑制,而在LOVO細胞中Rap1 GAP表達較高,其表達水平與人正常結腸上皮細胞HCoEPiC相近。Rap1 GAP在結腸癌細胞系中的表達變異可能與結腸癌不同亞型的分子異質性和臨床病理特征有關,表明即使是同一癌種,不同來源的腫瘤細胞系Rap1 GAP的表達情況也不盡相同;提示腫瘤的發生、發展是多因素、多信號通路調控的復雜過程,Rap1 GAP在腫瘤發展中的作用有待進一步分析。

惡性腫瘤發展過程中最關鍵的步驟是腫瘤細胞獲得遷移和轉移能力。Xu等[11]發現,miR-3121-3p誘導的甲狀腺乳頭狀癌的細胞遷移和侵襲能力可以被升高的Rap1 GAP消除。同樣,在胃癌中Rap1 GAP也是miR-3121-3p的靶基因之一[12]。Dong等[13]通過細胞劃痕實驗證實Rap1 GAP過表達會損害TPC-1和Hth83細胞以及濾泡性甲狀腺癌細胞FTC-133的遷移。胃癌相關體外研究結果顯示,過表達Rap1 GAP可促進E-cadherin的表達,抑制MMP-2的表達,抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力[14]。本實驗通過構建高表達Rap1 GAP的結腸癌細胞系發現,在培養24、48和72 h后,高表達Rap1 GAP的結腸癌細胞系SW480和HCT116的增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低。這表明Rap1 GAP在結腸癌細胞系中的穩定表達可抑制癌細胞的活力,提示Rap1 GAP表達是結腸癌細胞增殖能力的決定因素之一。

雖然在多種類型的腫瘤中均觀察到Rap1 GAP的缺失表達[15],但本實驗結果顯示,結腸癌細胞LOVO中Rap1 GAP表達與人正常結腸上皮細胞HCoEPiC相近,為進一步驗證Rap1 GAP在人結腸癌細胞中的作用,本實驗沉默LOVO細胞中Rap1 GAP的表達,發現抑制Rap1 GAP表達后,LOVO細胞的增殖能力在短期內(48 h)與對照組相比差異無統計學意義,72 h后其增殖能力顯著增加,提示抑制Rap1 GAP表達促進結腸癌細胞的增殖。在上皮性腫瘤中,細胞與細胞接觸減弱和細胞與基質黏附性改變是腫瘤擴散的重要促成因素,細胞與細胞黏附的喪失使腫瘤細胞從原發腫瘤部位分離,細胞與基質黏附的改變為腫瘤細胞侵襲周圍基質提供機會,最終導致腫瘤侵襲[16]。Tsygankova等[17]觀察到Rap1 GAP表達缺失細胞表現出顯著的細胞形態變化,細胞與細胞間更加分散,減弱了細胞間的黏附,且沉默Rap1 GAP可增強腫瘤細胞對膠原蛋白的黏附,而膠原蛋白是腫瘤基質的重要成分,這些可促進腫瘤細胞的增殖和遷移。在甲狀腺乳頭狀癌的研究中同樣觀察到,敲除Rap1 GAP可促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的遷移和侵襲[18]。本組Transwell實驗發現Rap1 GAP缺失表達的LOVO細胞具有較強的侵襲及遷移能力。Shah等[19]在乳腺癌的研究中亦發現,Rap1 GAP在乳腺導管原位癌中高表達,在浸潤性導管癌中表達下調,Rap1 GAP表達降低導致細胞黏附性降低、細胞骨架重塑。上述研究結果提示Rap1 GAP在不同腫瘤中的具體作用或存在差異,需進一步分析。本組人結腸癌組織中Rap1 GAP缺失表達率明顯高于癌旁正常組織,低分化結腸癌中Rap1 GAP缺失表達率高于高+中分化者,提示Rap1 GAP表達狀態與結腸癌分化程度相關。Gao等[20]報道,結直腸癌中Rap1 GAP表達降低與侵襲深度、淋巴結轉移和分期晚等預后不良因素顯著相關,與本實驗結果相似。另外,本實驗還發現伴黏液腺癌者Rap1 GAP缺失表達率高于不伴黏液腺癌者,表明Rap1 GAP表達狀態與結腸癌組織學分型相關。

綜上,Rap1 GAP表達是腫瘤細胞增殖活性的決定因素,上調Rap1 GAP表達可抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力等惡性生物學行為,沉默Rap1 GAP能促進結腸癌細胞的遷移。Rap1 GAP缺失表達與結腸癌分化程度及伴有黏液腺癌有相關性,提示Rap1 GAP可能作為腫瘤抑制因子在調控惡性腫瘤的進展中發揮重要作用。