下調PPAPDC1A的表達對結直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移的影響

郜培瓊,千新來,賀國洋,原志慶

結直腸癌是全球常見的癌癥之一[1],其發病率位居女性惡性腫瘤的第2位,位居男性惡性腫瘤的第3位[2]。轉移是多數結直腸癌患者預后不良的主要原因,在初次診斷時約25%患者已發生遠隔臟器的轉移[3]。磷脂酸磷酸酶2域1A(PPAPDC1A)是一種由271個氨基酸組成的整體膜磷酸酶,屬于新型的磷脂酸磷酸酶(PAP)。PAP促進磷脂酸向二酰甘油的轉化,二酰甘油是細胞信號傳導中重要的有機磷酸鹽,在脂質代謝和癌癥發展中發揮重要作用[4]。PAP酶包括PAP1(Mg2+依賴型)和PAP2(Mg2+非依賴型)。PPAPDC1A是PAP2亞型的成員之一。研究發現,PPAPDC1A在肺癌組織中過表達,并促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的發生[5]。最新研究表明,PPAPDC1A基因在乳腺癌組織中表達上調,乳腺癌細胞分泌的外泌體通過miR-892b/PPAPDC1A途徑將SNHG16轉移到受體細胞,從而促進乳腺癌的侵襲、遷移及上皮-間充質轉化[6-8]。然而,目前PPAPDC1A與結直腸癌發生、發展的關系尚不清楚。本課題組先前研究發現PPAPDC1A在6種結直腸癌細胞株中差異表達,本研究篩選SW480、SW620、RKO和LOVO細胞為研究對象,進一步探討PPAPDC1A在結直腸癌發生、發展中的作用,旨在探尋結直腸癌新的腫瘤標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本和細胞培養 收集2015～2017年新鄉醫學院第三附屬醫院病理科存檔的60例結直腸癌手術切除標本。所有患者均不伴有其他腫瘤,且均未接受任何抗癌治療。本實驗經新鄉醫學院第三附屬醫院倫理委員會批準,并征得患者知情同意。病理診斷、分類和分期依據WHO(2019)結直腸癌分類中的診斷指南進行。

人結直腸癌細胞株SW480、SW620、RKO和LOVO均購自美國ATCC公司,并保存于分子病理實驗室;293T細胞株由新鄉醫學院法醫系熊熙文博士惠贈。這些細胞株均使用DMEM(購自美國Gibco公司)培養基,置于5%CO237 ℃恒溫箱中常規培養,培養基包括10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素。

1.1.2主要試劑 PPAPDC1A多克隆抗體購自美國Abcam公司;DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司;TRIzol試劑盒購自日本Takara公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 先將切片在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中熱屏蔽,隨后滴加適量的封閉液,在室溫下處理切片10 min;然后用含5%正常山羊血清的PBS緩沖液阻斷20 min;再滴加適量一抗(稀釋比為1 ∶50),并完全覆蓋組織,玻片在4 ℃下孵育過夜。將切片與二抗在37 ℃下孵育15 min后,采用免疫組化SP法染色滴加DAB顯色劑觀察抗原-抗體結合情況,并酌情終止,用標準蘇木精染色切片。由病理醫師對HE切片進行半定量評估染色強度。

1.2.2PPAPDC1A過表達和干擾細胞系的建立 為建立PPAPDC1A過表達細胞株,按照制造商提供的操作方法,將PPAPDC1A的整體長度克隆到逆轉錄病毒pLVX-puro中,使用Lipofectamine 2000將pLVX-PPAPDC1A與包裝質粒共同轉染到293T細胞株中。轉染48 h后,用0.45 μm濾膜孔徑的濾器過濾細胞培養上清液。將結直腸癌待轉染細胞系與含有polybrene(5 μg/mL)的病毒上清液孵育48 h。用1 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性細胞。穩定干擾病毒Lentiviral Vector-PPAPDC1A-RNAi和陰性對照病毒Hu6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin由上海吉凱公司制備。待感染細胞感染48 h后,嘌呤霉素篩選陽性細胞,擴大培養后使用qRT-PCR和Western blot法進行鑒定。

1.2.3qRT-PCR檢測 收集適量處于對數生長期細胞,采用TRIzol法提取總RNA,用核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度,逆轉錄試劑盒合成cDNA。qRT-PCR反應體系為20 μL,包括SYBR Premix染料10 μL,ROX Reference染料0.4 μL,雙蒸水0.8 μL,上游引物2 μL,下游引物6 μL,cDNA模板0.8 μL。反應條件:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5s、60 ℃ 30 s,合計40個循環。以2-△△Ct表示實驗組與對照組中目的基因和內參基因的表達,實驗重復3次。PPAPDC1引物序列:上游5′-TAATAGTGGGAAGACCTCGC-3′;下游5′-GGTCACCTGTGCAATGCATT-3′;GAPDH引物序列:上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′;下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.4CCK-8實驗 將每孔1×103個細胞接種于96孔板中進行預培養,分別在培養的1～7天內,用每孔10 μL的CCK-8試劑孵育1 h。用酶標儀測定450 nm波長處的吸光值。

1.2.5平板克隆形成實驗 在含2 mL 37 ℃預培養液的6孔板中每孔接種50個細胞。培養箱中培養3周后,棄去培養基,經10%中性福爾馬林固定15 min,去除固定液,結晶紫染色30 min,流水沖洗后空氣干燥,顯微鏡下計算菌落數量。

1.2.6細胞劃痕實驗 在6孔板中培養細胞,待細胞長至70%左右時,用1 μL滅菌后槍頭水平、垂直“十字”劃線。清洗表面懸浮細胞,更換無血清DMEM培養液,放入37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。在劃痕后0、24、48 h觀察同一位置細胞向劃痕區域的遷移情況。

1.2.7Transwell實驗 在包被有基質膠的上、下小室內分別加入300 μL無血清培養基,37 ℃孵箱中孵育2 h。隨后在下室加入500 μL完全培養基,將200 μL密度為每毫升1×104個細胞的細胞懸液加入上室中。常規培養12～48 h后,刮去上室未遷移的細胞,遷移的細胞在小室的底部,經10%中性福爾馬林固定,結晶紫染色20 min。顯微鏡下計數侵襲的細胞數量。

1.2.8裸鼠皮下成瘤和裸鼠尾靜脈注射實驗 將4～6周大的BALB/c無胸腺裸鼠皮下注射5×106個細胞(每組8只),在注射后的7、14、28天測量腫瘤大小,腫瘤體積(V)的測定方法如下:V=[長+(寬)2]/2。4周后頸椎脫臼法處死裸鼠,取出腫瘤組織。將4×106個細胞通過尾靜脈注射的方法注入4～6周齡的裸鼠體內(每組10只),SPF級環境下飼養2個月后將裸鼠處死,取出整個肺部組織進行固定,并在顯微鏡下計數HE染色后病理切片中腫瘤轉移灶的數量。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中PPAPDC1A的表達免疫組化結果顯示,PPAPDC1A表達主要定位于細胞膜和部分細胞質。60例中PPAPDC1A高表達44例(73.3%,表1),低表達16例(26.7%)。與癌旁正常組織相比,PPAPDC1A蛋白在結直腸癌組織中的表達強度明顯升高。相關性分析結果顯示,PPAPDC1A表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移均無關;與腫瘤分化程度相關,腫瘤分化程度越低,PPAPDC1A蛋白表達強度則越強(P=0.011,表1)。

表1 PPAPDC1A表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.2 結直腸癌細胞中PPAPDC1A的轉染效率qRT-PCR和Western blot結果顯示,在SW480和RKO細胞中轉染PPAPDC1A過表達質粒后,結直腸癌細胞中PPAPDC1A蛋白(SW480、RKO組:0.42、0.21;SW480-Vector、RKO-Vector組:0.39、0.18;SW480-PPAPDC1A、RKO-PPAPDC1A組:1.29、0.46)和mRNA(SW480、RKO組:0.08、1.00;SW480-Vector、RKO-Vector組:0.01、0.91;SW480-PPAPDC1A、RKO-PPAPDC1A組:645.20、173.60)的表達水平明顯升高(P<0.05)。轉染干擾片段后,結直腸癌細胞中PPAPDC1A蛋白(SW620、LOVO組:0.65、0.58;SW620-NC、LOVO-NC組:0.85、0.57;SW620-shPPAPDC1A、LOVO-shPPAPDC1A組:0.35、0.35)和mRNA(SW620、LOVO組:1.84、2.24;SW620-NC、LOVO-NC組:2.57、2.42;SW620-shPPAPDC1A、LOVO-shPPAPDC1A組:0.22、0.18)的水平均降低(P<0.05)。以上結果表明,已成功構建穩定過表達和穩定干擾細胞株(圖1)。

圖1 qRT-PCR和Western blot法檢測PPAPDC1A在SW480(A)和RKO(B)細胞中的穩定過表達效率,以及在SW620(C)和LOVO(D)細胞中的干擾效率;與Vector/NC組相比,*P<0.05

2.3 PPAPDC1A對結直腸癌細胞體外增殖能力的影響CCK-8實驗結果表明,與SW480(0.27±0.04)/RKO(0.16±0.01)組和SW480-Vector(0.26±0)/RKO-Vector(0.09±0)組相比,SW480-PPAPDC1A(0.38±0.03)/RKO-PPAPDC1A(0.25±0.01)組細胞株培養96 h后,OD值明顯上升(P<0.05,圖2A)。與SW620(0.25±0)/LOVO(0.27±0.05)組和SW620-NC(0.23±0)/LOVO-NC(0.23±0.02)組相比,SW620-shPPAPDC1A(0.14±0.02)/LOVO-shPPAPDC1A(0.16±0.05)組細胞株培養96 h后,OD值明顯下降(P<0.05,圖2A)。平板克隆形成實驗顯示,與SW480-Vector(47.00±2.64)/RKO-Vector(65.00±1.73)組相比,SW480-PPAPDC1A(174.33±5.03)/RKO-PPAPDC1A(245.00±7.00)組細胞克隆形成數明顯增多(P<0.05,圖2B);與SW620-NC(66.00±1.00)/LOVO-NC(23.00±1.00)組相比,SW620-shPPAPDC1A(28.33±1.52)/LOVO-shPPAPDC1A(8.67±0.57)組細胞克隆形成數明顯減少(P<0.05,圖2B)。

圖2 CCK-8實驗(A)及平板克隆實驗(B)檢測PPAPDC1A穩定過表達和干擾對結直腸癌細胞增殖能力的影響

2.4 PPAPDC1A對結直腸癌細胞體內增殖能力的影響裸鼠皮下成瘤實驗顯示,與Vector組(2.11±0.76)相比,RKO-PPAPDC1A組(4.16±0.91)裸鼠體內形成腫瘤的體積更大(P<0.05,圖3A);與NC組(1.11±0.21)相比,LOVO-shPPAPDC1A組(0.56±0.21)的裸鼠腫瘤體積明顯較小(P<0.05,圖3B)。免疫組化結果顯示,Ki67增殖指數在過表達組升高(Vector組:54%,RKO-PPAPDC1A組:91%,P<0.05,圖4A),而在干擾組降低(NC組:74%,LOVO-shPPAPDC1A組:26%,P<0.05,圖4B)。上述結果表明,PPAPDC1A下調可以有效減弱結直腸癌細胞的增殖能力。

圖3 裸鼠皮下成瘤實驗中穩定過表達(A)和干擾(B)PPAPDC1A對腫瘤生長的影響

圖4 HE染色和免疫組化染色顯示裸鼠皮下腫瘤組織中

2.5 PPAPDC1A對結直腸癌細胞體外遷移、侵襲能力的影響劃痕愈合實驗顯示,與對照組相比,過表達組顯著增強了RKO和SW480細胞的遷移能力(SW480-Vector、RKO-Vector組:65.90%、72.55%;SW480-PPAPDC1A、RKO-PPAPDC1A組:79.99%、98.16%)(P<0.05,圖5A),穩定干擾組的LOVO和SW620細胞遷移能力減弱((SW620-NC、LOVO-NC組:16.27%、42.36%,SW620-shPPAPDC1A、LOVO-shPPAPDC1A組:7.90%、16.96%)(P<0.05,圖5B)。Transwell實驗結果表明,與對照組相比,PPAPDC1A過表達的細胞株穿透人工基膜的數量明顯增加(SW480-Vector、RKO-Vector組:90.66±3.05、14.00±0;SW480-PPAPDC1A、RKO-PPAPDC1A組:218.33±7.09、96.33±1.52),侵襲能力明顯的增強(P<0.05,圖5C);而穩定干擾組則相反,PPAPDC1A干擾組的細胞株侵襲數量大大減少(SW620-NC、LOVO-NC組:65.67±0.57、66.33±2.51,SW620-shPPAPDC1A、LOVO-shPPAPDC1A組:13.33±0.57、18.33±0.51)(P<0.05,圖5D)。

圖5 劃痕實驗檢測PPAPDC1A穩定過表達(A)和干擾(B)對結直腸癌細胞遷移能力的影響;Transwell實驗檢測PPAPDC1A穩定過表達(C)和干擾(D)對結直腸癌細胞侵襲能力的影響

2.6 PPAPDC1A對結直腸癌細胞體外肺轉移能力的影響裸鼠尾靜脈注射實驗結果顯示,RKO-Vector、RKO-PPAPDC1A、LOVO-NC和LOVO-shPPAPDC1A裸鼠的肺部轉移灶數目分別為1.1±1.85、5.1±3.84、4.6±2.17、1.2±1.03。與對照組相比,PPAPDC1A過表達組的肺部轉移灶數量明顯增加(P<0.05,圖6A);而干擾組轉移灶數目則顯著減少(P<0.01,圖6B)。結果表明,下調PPAPDC1A的表達可以抑制高轉移結直腸癌細胞株的肺轉移能力。

圖6 尾靜脈注射實驗檢測PPAPDC1A穩定過表達(A)和干擾(B)對結直腸癌細胞體內肺轉移能力的影響

3 討論

PAP對磷脂酸鹽進行去磷酸化,形成二酰甘油和無機磷酸鹽[9]。PAP酶有兩種形式,PAP1(Mg2+依賴型)和PAP2(Mg2+非依賴型)[10],這些酶主要參與細胞脂質信號傳導,特別是在酵母和哺乳動物細胞中[11]。PAP2蛋白由酵母中的LPP1和DPP1基因編碼。與酵母DPP1蛋白相比,DPPL1和DPPL2蛋白均表現出廣泛的底物特異性。研究表明,磷酸酶可作為細胞信號傳導的激活劑,并可能在致癌過程中發揮重要作用[12]。最新研究結果顯示,PPAPDC1A介導細胞內Ca2+升高,通過促進細胞周期的進展,誘導肺癌增殖和腫瘤的發生,PPAPDC1A高表達與肺癌患者的晚期臨床病理特征呈正相關,并與肺癌患者的低生存率密切相關。PPAPDC1A除了促進腫瘤進展外,還有助于上皮-間充質轉化[13]。此外,PPAPDC1A被認為是促進卵巢癌患者腸道轉移的關鍵基因之一[14],但其在結直腸癌發生中的功能尚未得到闡述。因此,本研究分析了PPAPDC1A在結直腸癌中的表達情況。

磷酸酶PPAPDC1B和PTP1B,被認為是癌癥、糖尿病和肥胖癥的治療靶點[15]。PPAPDC1B在胰腺癌、肺癌和乳腺癌中表達升高[16]。磷酸酶PTP1B在結直腸癌細胞株和組織中表達升高,其在結直腸癌細胞株中表達沉默可降低細胞的侵襲、遷移和增殖能力[17]。脂質磷酸酶3(LPP3;PPAP2B)是磷酸酶家族的一員。PPAP2B作為一種去磷酸化的跨膜蛋白,通過增加β-catenin的穩定性和CYCLIN-D1的合成來促進腫瘤的生長[18-19],并在人類結直腸癌SW480細胞株中表達升高。如上所述,磷酸酶在癌癥發病機制中起至關重要的作用。研究發現,PVT1-PPAPDC1A融合基因存在于胃癌細胞系中,同時TACC2-PPAPDC1A融合基因在彌漫性胃癌患者中表達升高,可能是由于TACC2啟動子驅動,導致PPAPDC1A的過表達,并促進了胃癌患者的轉移和復發,并且多種與PPAPDC1A相關的融合基因均與胃癌患者的預后存在密切的關系[20]。本實驗隨后建立了PPAPDC1A穩定過表達和干擾細胞系,通過CCK-8、平板克隆形成、裸鼠皮下成瘤、Transwell、細胞劃痕和裸鼠尾靜脈注射等實驗,檢測了實驗組和對照組對結直腸癌細胞株的影響。

綜上所述,PPAPDC1A在結直腸癌組織及細胞株中表達上調,在高轉移潛能細胞株中表達尤為明顯。下調PPAPDC1A的表達,可以明顯抑制結直腸癌細胞在體內和體外的增殖、侵襲、遷移和轉移能力,提示該基因可能與結直腸癌轉移及預后不良密切相關,并可以作為結直腸癌患者治療的相關靶點。PPAPDC1A在結直腸癌進展中的分子機制仍需進一步分析。