三七白及粉對大鼠腦出血致應激性潰瘍的治療作用及其機制研究※

安 凱 郭沛然 孫玉鳳

(1.河北省石家莊市人民醫院康復醫學二科,河北 石家莊 050030;2.河北醫科大學中西醫結合學院,河北 石家莊 050011;3.河北醫科大學第二醫院消化內科,河北 石家莊 050061)

應激性潰瘍(stress ulcer,SU)是指機體在應激狀態下發生的急性胃腸道黏膜糜爛、潰瘍等病變,嚴重者可并發消化道出血甚至穿孔,可使原有疾病的程度加重及惡化,增加病死率[1]。預防SU是救治危重癥患者不可忽視的環節[2]。SU是腦出血的主要并發癥之一,據相關文獻記載,顱腦出血后SU發生率高達16%～47%[3]。研究證實,三七、白及可直接作用于消化道出血部位,加速血液凝固,收斂出血部位的創面,消除炎癥、水腫,加快出血傷口愈合[4]。本實驗研究通過觀察三七白及粉對腦出血致SU大鼠的治療作用,并探討其可能作用機制,為臨床應用提供根據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只,體質量(200±5)g,8～10周齡,來源于河北醫科大學動物中心。動物生產許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。飼養環境溫度控制在20～25 ℃,相對濕度40%～65%,光照時間12 h/d,循環通風換氣。

1.2 藥物及試劑 三七白及粉混懸液的制備:將三七(廣東一方制藥有限公司,批號:ZZS0020)、白及(廣東一方制藥有限公司,批號:ZZB0110)顆粒劑按照1∶1比例調勻。根據臨床70 kg體質量人的用藥量換算給藥用量,根據動物體表面積比率折算等效藥量,溶入0.9%氯化鈉注射液制備相應濃度混懸液,并折算出給藥劑量(2.5 g/kg),給藥容積為1 mL/100 g。試劑:前列腺素E2(PGE2)試劑盒(上海研謹生物科技有限公司,批號:20170621);丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20161103);一氧化氮(NO)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20170528);超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20170715)。

1.3 儀器 雙目光學顯微鏡(日本Olympus公司),大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司),TGL-16G-A型低溫高速離心機(上海手術器械廠),DK-600A型電熱恒溫水箱(上海一恒科技有限公司),MDF-382E型超低溫冰箱(日本三洋公司),HM-200電子天平(日本三洋公司),WH-43電熱恒溫干燥箱(天津泰斯特儀器公司),YXQG02型電熱式蒸氣消毒器(山東新華醫療器械廠),UV755B型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及動物模型制備 將大鼠隨機分為3組:對照組、模型組、三七白及粉組。適應性飼養1周后,模型組、三七白及粉組采用自體血定位注射法建立大鼠基底節腦出血致SU模型。以10%水合氯醛將模型組、三七白及粉組大鼠進行腹腔麻醉。待麻醉成功后,將大鼠俯臥位固定,頭頂部脫毛處理,放置于大鼠腦立體定位儀下。用碘酒消毒頭頂脫毛部,以酒精脫碘后。將頭頂部鋪孔巾以暴露術野,沿頂正中線右側0.5 cm眼耳連線間將皮膚切開1 cm,將顱骨皮下筋膜鈍性分離。定位(前囟前0.2 mm,正中旁開3.0 mm)后以顱鉆打孔,直徑為1 mm。于大鼠尾靜脈處抽取自體血200 μL,抽取后立即從顱頂鉆孔處垂直進針約6 mm,于右腦基底節區處用微量泵泵入自體血(5 μL/min)。注射完畢后留針10 min后緩慢出針5 min?？p合皮膚切口,于切口處涂抹碘酒消毒后將大鼠置籠內觀察。在大鼠腦出血模型制備6 h后,使用Longa評分法[7]進行評分:0分,無任何明顯體征;1分,對側肢體不能完全伸展;2分,對側肢體癱瘓,向對側轉圈,有追尾現象;3分,行走時向對側傾倒;4分,有意識障礙。2分以上者認為造模成功。死亡和造模不成功者排除。

1.4.2 灌胃給藥 在造模完成后第3天開始灌胃給藥,三七白及粉組予2.5 g/kg的三七白及粉混懸液灌胃,給藥容積為1 mL/100 g。對照組和模型組分別給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,每日1次,連續灌胃14天。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 血液指標 在末次給藥2 h后,經大鼠下腔靜脈取血4 mL。其中取1 mL,注入加有0.5 mL消炎痛-EDTA-Nat液的抗凝試管內,以3000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃保存備用,檢測PGE2。另取血3 mL置于不抗凝試管中,以2500 r/min離心15 min,取上清液,測NO、SOD及MDA。方法按試劑盒說明書操作

1.5.2 組織形態觀察 ①取腦組織:經下腔靜脈取血后,處死大鼠,完整取出大鼠腦組織。②胃組織形態觀察:胃注入1%甲醛溶液8 mL并結扎幽門、賁門后提取整個胃組織,浸入1%甲醛溶液中10 min,用手術剪沿胃大彎切開整胃,隨后展開鋪平,經0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后,沿潰瘍周圍切掉胃壁(保留潰瘍邊緣3 mm周圍組織),觀察大體形態和胃潰瘍條數。將長軸的中點沿潰瘍中心縱向切取一分為二備用。

1.5.3 病理學觀察 用中性甲醛固定所取的腦及胃潰瘍組織24 h,脫水后進行石蠟包埋、切片并蘇木素-伊紅(HE)染色。HE染色方法:用甲苯-無水酒精脫去石蠟,然后經過無水酒精、70%酒精、50%酒精依次過渡到水。后經蘇木精液染色5 min,后以蒸餾水流水清洗掉蘇木精液,然后1%鹽酸乙醇溶液分色。后以淡氨水沖洗,再用蒸餾水溫和清洗。1%伊紅染液染色5～10 min比照染色,提取切片,用蒸餾水清洗脫去浮色。后經酒精等級脫水,直接用碳酸二甲苯透明,將中性樹膠封片,后鏡檢。

1.5.4 潰瘍指數測定 按Guth[8]標準計算,潰瘍指數=每組動物胃黏膜潰瘍長度×寬度的和/每組動物數。評分標準:斑點糜爛記1分;糜爛長度<1 mm記2分;≥1 mm,<2 mm記3分;≥2 mm,<3 mm記4分,依次類推。寬度>2 mm,分值×2。

2 結果

2.1 各組大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比較 與對照組比較,模型組大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均降低(P<0.05),MDA升高(P<0.05);與模型組比較,三七白及粉組大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均升高(P<0.05),MDA降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比較

2.2 腦組織病理觀察 大鼠腦組織病理觀察:基底節區細胞排列不規則,細胞核形態不規則,部分出現核皺縮現象,血腫及周圍神經元減少,膠質細胞、毛細血管增生明顯。見圖1。

圖1 大鼠腦組織病理學圖片(HE染色,×100)

2.3 各組大鼠胃組織形態觀察 對照組大鼠胃黏膜表面光滑,色淡紅,并覆蓋有大量黏液,黏膜表面及漿膜面完整,未見水腫、充血等病理變化。模型組可見大量散在點、線狀出血或糜爛,并伴有炎性滲出。三七白及粉組大部分可以找到潰瘍灶,但面積較小,部分可見充血點及炎性滲出物。見圖2。

圖2 各組大鼠胃組織形態

2.4 各組大鼠胃組織病理觀察 對照組胃黏膜組織形態正常,結構完整;模型組胃黏膜鏡下可見胃黏膜上皮細胞壞死、脫落,腺體結構破壞,黏膜間質明顯充血、水腫和出血;三七白及粉組胃黏膜表面未見糜爛,間質充血、水腫程度較模型組明顯減輕。見圖3。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織病理學圖片(HE染色,×40)

2.4 各組大鼠潰瘍指數比較 三七白及粉組大鼠潰瘍指數低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠潰瘍指數比較

3 討論

SU是腦出血最常見的并發癥之一。其發生、發展、轉歸及預后是一個非常復雜的病理生理過程。有研究推測可能腦出血量越大,腦水腫越嚴重,病變范圍越廣,越容易發生SU,消化道黏膜血流量減少,缺血缺氧致急性糜爛、潰瘍、出血[5]。

中醫學無SU的病名,但是與中風、吐血、便血等相對應。中醫學認為,腦出血所致SU以“顱腦損傷,心神失養,脾胃升降失調,氣滯血瘀,郁而化熱,迫血妄行而致出血”為病因病機。本研究通過制備腦出血致SU模型,并制作腦組織病理切片,發現腦組織形態顯著改變。此外,胃潰瘍指數顯著增加,經過對胃組織HE染色后,結果也證實了這一發現,從而進一步確認了模型制備成功。本研究旨在通過對腦出血致SU大鼠進行治療干預,以探索有效的治療方法。

在《本草求真》《瀕湖集簡方》《本草新篇》等古籍均有口服三七、白及粉劑治療急性消化道出血性疾病的記載。白及消腫生肌,收斂止血;三七散瘀止血,改善循環。兩藥聯用,一散一收,在止血的同時,可以改善創傷臨近組織的微循環,促進愈合[6]。有學者研究結果表明,三七白及粉類方劑與西藥聯合治療消化性潰瘍的效果明顯優于單獨使用西藥治療[7]。本研究采用三七白及粉干預腦出血致SU大鼠,結果顯示,與模型組比較,三七白及粉組能夠明顯降低黏膜潰瘍的發生,且潰瘍指數明顯降低(P<0.05)。這說明三七白及粉對腦出血致SU的胃黏膜有治療作用。

消化道出血是腦出血的常見并發癥之一,因腦血管意外所引起的SU,在臨床表現、治療方法及預后方面有著不同于其他SU的特點。本實驗主要探討三七白及粉促進腦出血致SU愈合的可能的作用機制。SU的發病機制涉及血液微循環不足,隨后導致組織低氧血癥和氧化應激,以及氧自由基的積累。氧自由基會破壞細胞蛋白質(包括DNA 和脂質)的化學結構,并以多種方式誘導細胞死亡。機體通過酶促和非酶促防御機制來防御氧自由基。非酶防御機制通過組織病理學檢查評估,酶防御機制通過生化檢查評估。NO是血管內皮釋放的炎性介質,抗氧化作用顯著,可保護胃黏膜[8]。MDA是機體內不飽和脂肪酸在脂質過氧化作用下形成的最終產物,可使細胞變性、壞死[9]。PGE2和 SOD 是對抗氧化應激介導的胃炎的代表性黏液保護因子。特別是PGE2通過多種機制在維持胃黏膜完整性中發揮重要作用[10-11]。有藥物如扎魯司特能通過PGE2和抗炎途徑對吲哚美辛誘導的大鼠胃潰瘍起到胃保護作用[12]。魯斯可皂苷元通過升高PGE2水平對乙酸引起的胃潰瘍發揮有效的治療作用[13]。本次研究中,三七白及粉組治療后血清MDA水平低于模型組,SOD和NO水平高于模型組,提示三七白及粉能夠有效清除氧自由基,提高多種抗氧化因子活性。類似的研究中,三七皂苷處理晚期糖基化終末產物(AGE)誘導的人臍靜脈內皮細胞后,MDA的活性降低,SOD活性增加[14]。三七皂苷 R1增加了氧糖剝奪/復氧后周細胞SOD表達[15]。大量文獻報道,PGE2與潰瘍病的發生關系密切[16-17]。本實驗研究結果表現,與對照組相比較,模型組大鼠PGE2含量明顯降低,說明腦出血致SU模型的形成可能與PGE2含量降低有關。三七白及粉組PGE2含量高于模型組,提示升高PGE2含量是三七白及粉治療腦出血致SU的一個途徑。三七白及粉通過上調PGE2、SOD和NO來減少MDA的量。提示PGE2減少在SU發病中有重要意義。而三七白及粉治療潰瘍的機制可能與升高PGE2有關。

綜上所述,三七白及粉作為活血化瘀、生肌止痛之良方,對腦出血致SU具有良好的治療作用,而且作用靶點是多方面的。三七白及粉通過顯著提升血清NO含量,以提高胃黏膜血流量,增加黏膜抵抗能力。提高PGE2含量促進胃黏膜血流和胃黏液分泌,以增加胃黏膜表面活性物質,對胃黏膜起到保護作用。提高血清SOD活性,以改善應激狀態下胃黏膜的血流量,阻止有害游離基的形成,保護胃黏膜,同時降低脂質過氧化產物MDA水平,促進潰瘍愈合。