藏紅花素緩解野百合堿誘導動脈型肺動脈高壓大鼠右心室損傷的機制研究*

盛艷玲， 宮小薇， 李志娟， 張 旋， 田 濤， 袁雅冬

（1華北石油管理局總醫院呼吸與危重癥醫學科，河北 任丘 062552；2河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學科，河北 石家莊 050000）

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一種惡性進行性心肺疾病，以肺動脈遠端閉塞為特征，引起肺血管阻力增加，并最終導致右心衰竭［1］。肺血管重塑，包括肺動脈狹窄和血管壁增厚，是PAH的病理基礎［2］，其中，炎癥被認為在PAH的發生發展中起著重要作用，更是肺血管重塑的關鍵因素［3］。研究表明，炎癥細胞包括巨噬細胞、肥大細胞和樹突狀細胞等的浸潤是PAH發病機制中的重要觸發和驅動因素［4］。目前急需有效的治療方法來逆轉肺血管重塑和改變疾病進程，因為現有的靶向藥物僅僅針對肺血管內皮功能障礙，無法實現這一目標［5］。應用中藥治療疾病在我國歷史悠久，并且相比西藥安全性高，作用溫和持久，具有較大的開發價值和潛力。藏紅花是我國傳統的中藥材，一直以來用于治療各種疾病，包括哮喘、肝病、月經紊亂、疼痛和腫瘤等。藏紅花中的黏蛋白能快速激活核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）和蛋白激酶C，進而活化巨噬細胞，因而具有免疫調節的功能。藏紅花素（crocin），又稱為西紅花苷，是藏紅花的主要生物活性成分，也是自然界唯一存在的水溶性類胡蘿卜素。藏紅花素具有抗癌、抗凋亡、抗炎和抗氧化等作用［6-7］。研究表明，藏紅花素通過抑制炎性因子caspase1和白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）表達保護視網膜缺血再灌注損傷小鼠的鼠視網膜神經節細胞［8］。Li等［9］也發現藏紅花素能通過誘導M2巨噬細胞極化而減輕冠狀動脈粥樣硬化。目前關于藏紅花素對PAH的影響的研究報導極少，本研究旨在分析藏紅花素能否通過調節炎癥從而緩解野百合堿（monocrotaline， MCT）誘導的PAH大鼠右心室損傷。

材料和方法

1 實驗材料

藏紅花素（25 g；分子式：C44H64O24；分子量：976.97；批號：SSLBJ-MB）購自東京化學工業有限公司；MCT（20 mg；批號：AGPG-89251）購自上海廣銳生物科技有限公司；西地那非（sildenafil；50 mg；批號：1160012）購自廣州白云山醫藥集團有限公司；IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司；NF-κB P65抗體（80979-1-RR）和CCL2抗體（66272-1-Ig）購 自Proteintech；p-NF-κB P65抗 體（3033S）購自CST；p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）抗 體（bs-0637R）、p-p38 MARK抗體（bs-5476R）、CCR2抗體（ab273050）和CD68抗 體（ab201340）購 自Bioss。VECG-2303B動物心電圖機購自廣州市三銳電子科技有限公司；FA1004型電子天平購自上海精科天平；動物天平TCS.200購自中國武漢；PowerLab生理記錄儀購自澳大利亞AD儀器公司；石蠟包埋機及恒溫冷凍切片機購自Leica；PCR儀購自Bio-Rad；-80 ℃超低溫冰箱、電泳儀及多功能讀板機購自Thermo Fisher；凍臺購自武漢俊杰電子有限公司；恒溫搖床購自蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；脫色搖床及勻漿儀購自賽維爾生物；光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標檢測儀購自Rayto；蛋白濃度定量儀及移液槍購自Eppendorf；光源購自Zeiss。

2 實驗動物分組

40只SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20） g，購自北京華富康動物公司（實驗動物使用許可證號為IRM-DWLL-2020075），并遵循美國國家學術研究委員會實驗動物飼養管理和使用指南。大鼠在帶有飼料的塑料籠中飼養，定期添加和更換飲用水和墊料。適應性喂養1周后，大鼠隨機分為normal組、PAH組、crocin組和sildenafil組，每組10只。PAH組、crocin組和sildenafil組大鼠單次皮下注射MCT（50 mg/kg），以建立PAH模型；normal組大鼠皮下注射等體積生理鹽水。自MCT注射之日起，crocin組大鼠給予藏紅花素（200 mg/kg）［10］，sildenafil組大鼠給予sildenafil（30 mg/kg），PAH組和normal組大鼠給予等體積生理鹽水，每日1次灌胃，持續4周。

3 主要實驗方法

3.1 血流動力學及指數的測定 4周后，所有大鼠稱量體重，予3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，仰臥位固定于蛙板上，剪去大鼠右側頸部體毛，75%醫用乙醇消毒，做右頸部外上至內下斜行切口至鎖骨上部，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露右側頸外靜脈，游離約1 cm，棉線結扎靜脈遠心端后，提起頸外靜脈，朝心室方向剪開一個2～3 mm“V”形切口，插入微導管，并通過壓力傳感器連接至Powerlab生理記錄儀，導管送至右心室，測定心率，在生理記錄儀顯示屏上可以見到振幅較大的心室波，通過顯示的波形曲線和壓力值測量右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure， RVSP），導管繼續往里前進，通過壓力波形變化來判斷導管所處位置，待導管行至肺動脈后記錄大鼠平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure， mPAP）。測壓結束后放血處死大鼠，取出大鼠心臟并稱重，去除脂肪、血管及心房、心耳組織，沿室間隔分離右心室游離壁，剩余的部分即為左心室及室間隔組織。隨后，吸干水分，天平秤量右心室和左心室+室間隔的重量，計算右心室質量指數［right ventricular mass index， RVMI；RVMI=右心室重量（mg）/體重（g）］和右心室肥大指數（right ventricular hypertrophy index， RVHI；RVHI=右心室重量/左心室及室間隔重量），以反映右心室肥大程度。

3.2 右心室組織學檢查 將大鼠右心室組織浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h，脫水后二甲苯透明化，石蠟包埋固定，切成5 mm切片。切片用masson三色染色，光學顯微鏡觀察右心室染色標本，檢測右心室膠原纖維及心肌細胞形態學的變化。

3.3 ELISA測量炎癥細胞因子 取右心室組織0.1 g，置于0.9%生理鹽水中超聲研磨。之后以3 000 r/min離心15 min獲得肺組織和右心室組織勻漿。ELISA試劑盒測定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白含量，具體程序參照試劑盒說明書操作。

3.4 RT-qPCR測量炎癥細胞因子 使用RNA提取試劑盒從100 mg大鼠右心室組織中制備和純化總RNA，以紫外分光光度計測定總RNA的濃度與純度，將提取的總RNA分裝每管2 μL，于-80 ℃冰箱保存。取2 μL總RNA配成gDNA去除反應體系混合液，另外配制反轉錄反應體系混合液，將反轉錄反應體系混合液加到gDNA去除反應體系混合液中充分混勻，42 ℃孵育15 min，之后95 ℃孵育3 min，得到cDNA。配制反應體系20 μL，行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，66 ℃延伸32 s，40個循環。內參照選用β-actin。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平。擴增引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.5 Western blot檢測p38 MAPK、p-p38 MAPK、NFκB P65、p-NF-κB P65和CCL2水平 取大鼠右心室100 mg放入勻漿器中提取組織蛋白，配制BCA工作液，加熱使蛋白變性，用酶標儀在562 nm波長下測定吸光值，根據標準品曲線，計算蛋白濃度及上樣量。制備凝膠，在30 mA恒流下進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后在電壓100 V、電流200 mA下以濕轉法電轉移動至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜上，時間為2 h。室溫下將膜密封在Tris-buffered saline/0.1% Tween 20/5%脫脂奶粉（TBST/B）中1 h，然后將膜與Ⅰ抗溶液（抗體稀釋比例：p38 MAPK為1∶500，p-p38 MAPK為1∶500，NFκB P65為1∶1 000，p-NF-κB P65為1：1 000，CCL2為1∶1 000，GAPDH為1∶1 000）在4 ℃下輕輕搖動孵育過夜，用TBST/B洗膜3次后立即轉移到Ⅱ抗［HRPGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）］溶液中，室溫孵育1 h，將膜再次洗滌3次，并用Luminata crescendo Western HRP底物顯色。使用Molecular Imager ChemiDoc XRS系統凝膠成像分析儀獲取圖像，用ImageJ圖像軟件分析各條帶的灰度值，比較各組間差異。

3.6 免疫熒光分析 右心室組織切片與波形蛋白抗體（1∶200）、CCR2抗體（1∶200）和CD68抗體（1∶200）在4 ℃下培養過夜，添加Ⅱ抗［CoraLite594 標記的純山羊抗小鼠IgG（H+L）］，37 ℃孵育 2 h。細胞核用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）復染。在熒光顯微鏡下觀察組織的病理變化。使用Image-Pro Plus 6.0對免疫熒光染色進行量化。

4 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進行統計分析，實驗中所有變量數據均進行正態性檢驗，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，通過單因素方差分析來檢查各組之間的統計差異，P＜0.05表明差異具有統計學意義。曲線擬合使用GraphPad Prism 5進行。

結 果

1 藏紅花素對大鼠一般情況的影響

在適應性飼養階段，各組大鼠精神狀態良好，毛色光亮，進食好，活躍，反應靈敏，無異常。在實驗過程中，normal組大鼠一般情況較前無明顯變化；PAH組大鼠逐漸出現精神萎靡、行動遲緩、食量減少、反應遲鈍、體毛晦暗和呼吸急促等癥狀，最后以靜臥為主；crocin組和sildenafil組大鼠一般情況介于對照組和PAH組大鼠之間。

2 藏紅花素對大鼠體重及心率的影響

實驗開始前，各組間大鼠體重比較差異無統計學意義（P＞0.05）。4周后，各組間大鼠體重及心率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 藏紅花素對大鼠體重和心率的影響Table 2.Effects of crocin on rat body weight and heart rate

3 藏紅花素對大鼠血流動力學的影響

與normal組相比，PAH組大鼠RVSP及mPAP顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組和sildenafil組大鼠RVSP顯著下降（P＜0.01）；crocin組和sildenafil組大鼠mPAP顯著下降（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Effects of crocin on rat hemodynamics.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05， ●●P＜0.01 vs PAH group.圖1 藏紅花素對大鼠血流動力學的影響

4 藏紅花素對大鼠右心指數的影響

與normal組相比，PAH組大鼠RVHI及RVMI顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組和sildenafil組大鼠RVHI及RVMI顯著下降（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Effects of crocin on rat right ventricular indexes.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs Normal group；●●P＜0.01 vs PAH group.圖2 藏紅花素對大鼠右心指數的影響

5 藏紅花素對大鼠右心室組織病理學的影響

Masson染色顯示右心室膠原纖維藍染。Normal組大鼠心肌細胞呈紅色，緊密排列，細胞核呈褐色，心肌細胞間隙窄而清晰可見，基質中有少量藍色膠原纖維，分布稀疏，染色淺；PAH組大鼠心肌間隙明顯增寬，心肌纖維大小不等，排列混亂，部分斷裂，心肌細胞水腫，部分細胞核溶解消失，間質內可見較多藍色膠原纖維，與心肌間質呈現出紊亂的漩渦狀或柵欄狀排列；crocin組和sildenafil組大鼠的心肌細胞排列緊密，輕度水腫，膠原纖維輕度增生，見圖3。

Figure 3.Masson staining of rat right ventricles.Scale bar=20 μm.圖3 大鼠右心室masson染色

6 藏紅花素對大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

ELISA檢測結果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與PAH組相比，藏紅花素及西地那非干預降低了以上3種炎癥細胞因子的蛋白水平，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4A。RT-qPCR顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil組IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA顯著降低（P＜0.01），見圖4B。

Figure 4.Effect of crocin on protein levels （A） and relative mRNA expression levels （B） of IL-1β， IL-6 and TNF-α in rat right ventricles.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs Normal group；●P＜0.05， ●●P＜0.01 vs PAH group.圖4 藏紅花素對大鼠右心室IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA表達水平的影響

7 藏紅花素對大鼠右心室p38 MAPK/NF-κB通路的影響

Western blot實驗結果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室細胞中p-p38 MAPK表達顯著上調，p-p38 MAPK與p38 MAPK比值顯著升高（P＜0.05），p-NF-κB P65表達顯著上調，p-NF-κB P65與NF-κB P65比值顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組、sildenafil組大鼠右心室細胞中p-p38 MAPK表達顯著下調，p-p38 MAPK與p38 MAPK比值顯著降低（P＜0.05），p-NF-κB P65表達顯著下調，p-NFκB P65與NF-κB P65比值顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Effects of crocin on the p38 MAPK/NF-κB pathway in rat right ventricle lung tissues.Relative protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.☆P＜0.05， ☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05 vs PAH group.圖5 藏紅花素對大鼠右心室p38 MAPK/NF-κB通路的影響

8 藏紅花素對大鼠右心室CCL2/CCR2通路及巨噬細胞的影響

8.1 藏紅花素對大鼠右心室CCL2的影響 Western blot實驗結果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室中CCL2蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil大鼠CCL2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖6。

Figure 6.Effect of crocin on CCL2 in rat right ventricles.Relative protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05 vs PAH group.圖6 藏紅花素對大鼠右心室CCL2的影響

8.2 藏紅花素對大鼠右心室CCR2及巨噬細胞的影響 將大鼠右心室切片進行CCR2和CD68免疫熒光共染。結果顯示，normal、PAH、crocin和sildenafil組大鼠右心室CCR2+反應區（紅色熒光所示）均與CD68+反應區（綠色熒光所示）相重疊。與normal組相比，PAH組中CCR2+/CD68+熒光表達明顯增多；與PAH組相比，crocin及sildenafil組CCR2+/CD68+熒光表達明顯減少。見圖7。

Figure 7.Immunofluorescence staining of rat right ventricles.Scale bar=50 μm.White arrows indicate CD68+/CCR2+ positive areas.圖7 大鼠右心室免疫熒光染色

對免疫熒光染色進行量化分析發現，與normal組相比，PAH組大鼠右心室中CCR2+/CD68+反應強度顯著增加（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil組CCR2+/CD68+反應強度顯著下降（P＜0.01），見圖8。

Figure 8.Effects of crocin on the intensity of CCR2+/CD68+ reaction in rat right ventricles.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●●P＜0.01 vs PAH group.圖8 藏紅花素對大鼠右心室CCR2+/CD68+反應強度的影響

討 論

在本研究中我們使用了由MCT誘導的嚙齒類PAH動物模型，結果顯示PAH組mPAP異常升高，表明PAH模型的建立是成功的。先前的研究證實，在大鼠單次注射野百合堿后 21 d內誘發的惡病質，可導致嚴重的體重減輕［11］，本研究未發現PAH組大鼠與其它組別相比有明顯的體重下降，其原因可能與PAH大鼠在中后期行動減少并且出現胸腔積液有關，導致體重無明顯差異。西地那非是治療PAH的有效藥物，在許多研究PAH的文章中用做陽性對照藥物。在本研究中，我們也將西地那非用做陽性對照藥物，結果表明，藏紅花素可顯著緩解MCT誘導PAH大鼠的右心室損傷，其作用與本實驗劑量下西地那非的作用相當。

右心室功能是PAH患者臨床預后和生存的主要決定因素，隨著PAH的進展，肺血管阻力不斷增加，右心室出現肥大擴張及纖維化［12］，最終導致右心衰竭，是PAH患者死亡的主要原因［13］。因此，積極尋找PAH 患者右心重塑的發病機制并進行早期干預，對患者的預后非常關鍵。

心力衰竭與炎癥密切相關。Hanna等［14］報道炎性細胞因子調節所有心肌細胞的表型和功能，抑制心肌細胞的收縮功能，誘導巨噬細胞的炎癥激活，刺激微血管炎癥和功能障礙，促進成纖維細胞的基質降解表型。在許多心肌疾病中，成纖維細胞活化是由炎癥反應觸發導致的［15］。本研究也在PAH大鼠的右心室觀察到膠原纖維沉積，而藏紅花素干預對大鼠右心室的膠原沉積有明顯的改善作用。

NF-κB是炎癥反應的關鍵轉錄激活因子，研究顯示NF-κB的激活與PASMCs的增殖有關［16］。P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）是MAPK家族中調控炎癥反應最重要的成員，當無炎癥時p38 MAPK呈低表達，在受到炎性因子刺激后p38 MAPK磷酸化水平升高，可以調節多種炎性因子的表達［17］，被認為是天然藥物抗炎作用的潛在靶點。研究表明p38 MAPK與肺動脈內皮細胞凋亡［18］和PASMCs增殖［19］密切相關。有報道抑制p38 MAPK的磷酸化，能抑制炎癥反應，降低PAH［20］。NF-κB是p38 MAPK的下游信號分子之一，p38 MAPK信號通路與NF-κB可以通過交互作用共同影響炎癥的發生發展［21］。當機體發生炎癥反應時，炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-a等激活p38 MAPK信號轉導通路，磷酸化的p38 MAPK通過特異性底物激活NF-κB通路，使胞質內NF-κB 部分磷酸化，進而啟動炎癥因子的翻譯轉錄，釋放大量的炎癥因子比如IL-1β、 IL-6和TNF-α等［22］，導致炎癥因子的“瀑布效應”。而抑制 p38 MAPK可抑制NF-κB的活性進而降低TNF-α、IL-1β及IL-6 等細胞因子的產生，減輕肺部病理損傷［23］。在巨噬細胞中下調NF-κB和MAPK信號通路，可下調IL-1β、 IL-6、TNF-α和CCL2的表達，進而降低巨噬細胞炎癥反應［24］；而對p38 MAPK 的抑制可介導對NF-κB通路的抑制作用［25］。以往的研究就已經發現，中藥成分可以通過抑制MAPK和NF-kB信號通路而發揮抗炎作用［26］。本研究結果也顯示，PAH模型大鼠肺組織以及右心室中p-p38 MAPK和p-NF-κB 蛋白表達水平較正常大鼠顯著升高，p38 MAPK及NF-κB P65 磷酸化水平反映其活化狀態，提示其共同參與了MCT誘導的PAH的炎癥調控過程。經藏紅花素干預后p38 MAPK 及NF-κB P65 磷酸化水平與模型組比較呈明顯降低，同時NF-κB下游因子的表達水平也被顯著下調，提示藏紅花素的抗炎作用與抑制p38 MAPK /NF-κB信號通路有關。這表明NF-κB與p38 MAPK可能是PAH中潛在的作用靶點。

巨噬細胞在機體炎癥反應中發揮著巨大的作用。吸引巨噬細胞的趨化因子很多，其中以CCL2 最為重要，它通過與巨噬細胞表面受體CCR2結合發揮作用， 是單核/巨噬細胞細胞募集和激活的最具生物活性的趨化因子［27］，可將巨噬細胞吸引至炎癥部位?；罨木奘杉毎尫虐↖L-1 、IL-6、IL-8以及TNFa 等多種細胞因子，參與炎癥反應的調節［28］。CD68是巨噬細胞標志物［29］，為了驗證CCR2主要在巨噬細胞表面表達，我們將右心室組織進行CCR2 和CD68免疫熒光共染。結果顯示：各組CD68+巨噬細胞表達區域均與CCR2+表達區域明顯重合。結果還表明，PAH組大鼠右心室中巨噬細胞浸潤較正常組明顯增加，而藏紅花素及西地那非干預組右心室中巨噬細胞浸潤較PAH組明顯減輕，說明巨噬細胞誘導的炎癥反應在PAH右心室損傷中也發揮了作用。Al-Qazazi等［30］也在PAH模型和患者失代償的右心室中發現巨噬細胞的激活，從而認為右心室炎癥也是PAH右心室衰竭的原因，而不僅僅是由右心室負荷升高引起的，這為PAH提出了一種新的治療模式。經過刺激的巨噬細胞，可以活化NF-κB，進而促進炎性細胞因子的表達和分泌。Zimmer等［31］還發現血管平滑肌細胞中的 CCL2水平受到NF-κB的調節，這說明巨噬細胞與NF-κB相互影響、相互促進，使炎癥反應級聯放大。本研究也顯示CCL2/CCR2 通路和巨噬細胞分布的變化趨勢與p38 MAPK/NF-κB的變化相同。因此，抑制CCL2 的過度表達，減少巨噬細胞的聚集，從而抑制NF-κB等炎癥因子的釋放，使失控的炎癥反應得以控制，將有望成為治療PAH的新思路。

本研究也存在一些局限性：首先，抗炎已成為治療PAH的理念之一，但目前的研究僅限于動物模型，尚未應用于PAH患者，本研究也是如此。再者，巨噬細胞的激活狀態對疾病的具體作用以及NF-κB通路與CCL2 相互促進的具體機制尚不完全清楚，有待于進一步的研究。