Uhrf1基因重組腺病毒載體構建及其在小鼠心肌細胞DNA損傷修復中的作用研究*

江 南， 王馳寅， 聶 宇， 王 玨，2△

（1溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江 溫州 325000；2溫州醫科大學附屬第一醫院心臟外科，浙江 溫州 325000；3中國醫學科學院，北京協和醫學院國家心血管病中心，阜外醫院心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037）

泛素樣同源域和環指結構域1（ubiquitin-like with plant homeodomain and RING finger domains 1，Uhrf1），也稱為NP95或ICBP90，是一種多結構域蛋白，包含泛素樣結構域（ubiquitin-like domain， UBL）、串聯鐸域（tandem tudor domain， TTD）、植物同源結構域（plant homeodomain， PHD）、SET和RING相關結構域（SET and RING-associated domain， SRA）以及真正有趣的新基因結構域（really interesting new gene domain， RING）。這些結構域經過連接區進行翻譯后修飾，調控UHRF1不同的空間構象狀態，影響其穩定性和功能［1］。研究表明，Uhrf1基因在DNA甲基化、DNA損傷修復和細胞增殖中扮演著關鍵角色［2-4］。Muto等［5］的研究指出，UHRF1的缺失可提高細胞對DNA損傷劑的敏感性，最初被發現參與DNA損傷修復的染色質標志是磷酸化組蛋白H2A變異體（γ histone H2A，γH2AX）［6］，而Tian等［2］觀察到，缺乏UHRF1功能的細胞會積累DNA損傷標志物γH2AX。然而，當前研究對Uhrf1基因在心肌細胞中發揮何種作用知之甚少，因心肌細胞質粒轉染效率極低，嚴重制約了相關研究的進展。因此，本研究旨在構建并鑒定小鼠Uhrf1基因重組過表達腺病毒載體，為進一步利用腺病毒基因遞送系統在心肌細胞中實現Uhrf1基因過表達，探索Uhrf1基因在心肌細胞DNA損傷中的作用提供實驗依據。

材料和方法

1 動物

SPF級ICR小鼠，1日齡，0.8～1.2 g，共25只，購自北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0004。

2 主要實驗試劑

限制性內切酶AsisI及MluI、質粒載體pADMCMV-C-FH、T4 DNA連接酶、感受態細胞DH5α和PrimeScript RT Master Mix （RR036A）購自TaKaRa；DMEM培養液及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco；青霉素/鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）及RIPA裂 解 液（P0013B）購于上海碧云天生物技術有限公司；4%～12% Bis-Tris預制膠、蛋白質電泳緩沖液、蛋白質轉膜緩沖液、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜、驢抗鼠488 Ⅱ抗（A-21202）、驢抗兔594 Ⅱ（A-21207）、山羊抗鼠HRP Ⅱ抗（31430）及山羊抗兔HRP Ⅱ抗（31460）購自Invitrogen；DMSO購自北京索萊寶科技有限公司；腺病毒感染性滴度快速測定試劑盒LABKIT?AD-010（24Tests）購自深圳萊伯克生物科技有限公司；新生小鼠心臟解離試劑盒（130-098-373）購自MiltenyiBiotec；UHRF1抗體（sc-373750）購自Santa Cruz；Phospho-H2AX（γH2AX）抗體（9718S）、H2AX抗體（2595S）、Bax抗體（5023S）、Bcl-2抗體（4223S）及α-Tubulin抗體（2144S）購自Cell Signaling Technology；重 組 Anti-cardiac troponin T（CT3）（ab209813）購自Abcam；含DAPI的封片劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

3 主要方法

3.1 含有鼠源Uhrf1基因序列片段的合成 從原代小鼠心肌細胞中提取總RNA，總RNA反轉錄后得到cDNA。根據NCBI GenBank中小鼠Uhrf1基因編碼序列（NM_001111078.1）設計含有酶切位點的引物，上游引物序列為5’-GCGATCGATGTGGATCCAGGTTCGAAC-3’，下 游 引 物 序 列 為5’-GACGCGTTCACCGGCCGCTGCCATAGC-3’。進行PCR擴增后得到Uhrf1基因片段，經AsisI/MluI雙酶切后回收，酶切體系為：基因片段20 μL（約2 μg），10×緩沖液5 μL，ddH2O 24 μL，AsisI 0.5 μL，MluI 0.5 μL，總體系50 μL。37 ℃反應3 h。

3.2 質粒載體pADM-CMV-C-FH酶切 用AsisI和MluI雙酶切質粒載體pADM-CMV-C-FH，將合成的Uhrf1基因片段連接至酶切后的質粒載體pADMCMV-C-FH中。酶切體系為質粒DNA 20 μL（約2 μg），10×緩沖液 5 μL，ddH2O 24 μL，AsisI 0.5 μL，MluI 0.5 μL，總體系50 μL。37 ℃反應3 h。

3.3 目的基因片段和質粒載體pADM-CMV-C-FH的連接鑒定 取上述酶切回收后的Uhrf1基因片段及質粒載體進行連接反應，連接體系如下：DNA片段6 μL，pADM-CMV-C-FH 1 μL，T4 DNA連接酶2 μL，DNA連接酶緩沖液1 μL。16 ℃轉化到感受態細胞DH5α，挑取單克隆菌落過夜培養后提取質粒，利用AsisI和MluI雙酶切鑒定，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證片段長度。

3.4 基因測序 重組質粒由山東維真生物科技有限公司進行測序驗證序列信息。

3.5 重組腺病毒pADM-CMV-C-FH-UHRF1包裝、擴增及純化 將重組腺病毒轉染至HEK293T細胞中，放置于CO2細胞培養箱中培養。觀察大部分細胞出現細胞病變效應后，收集細胞，采用1 000 × g離心7 min后，留細胞沉淀和約5 mL上清液，充分溶解。將細胞懸液于干冰與37 ℃恒溫器反復凍融4次，12 000 ×g離心2 min。收集病毒上清液，放置于-80 ℃冰箱中保存。重復上述步驟，可以達到病毒擴增的目的。使用碘克沙醇密度梯度離心法對病毒進行純化，得到高滴度的病毒濃縮液。

3.6 ADM-Uhrf1腺病毒滴度測定 根據腺病毒感染性滴度快速測定試劑盒說明，分為9個梯度稀釋病毒樣品后感染細胞，37 ℃培養48 h。甲醇固定10 min后洗滌，先后加入Ⅰ抗稀釋液和Ⅱ抗稀釋液37 ℃孵育1 h。加入配制的3，3′-二氨基聯苯胺（3，3'-diamino-benzidine，DAB）工作液顯色30 min，用顯微鏡對陽性細胞進行計數。數出倒數兩孔的陽性細胞數，根據腺病毒滴度計算公式：病毒滴度（pfu/mL）=（倒數第二孔陽性細胞+倒數第一孔陽性細胞×10）×1 000/2/倒數第二孔病毒量（μL），計算ADMUhrf1腺病毒滴度。

3.7 分離原代心肌細胞并加入重組腺病毒轉染配制心肌細胞解離酶，每個C管包含62.5 μL酶P，12.5 μL酶A，100 μL酶D，2 300 μL緩沖液X和25 μL緩沖液Y。在超凈臺中使用眼科剪正中切口刺入小鼠胸口，擠出并用鑷子摘下心臟，放入PBS中剪去心耳，將心臟放入C管后放置gentleMACS消化1 h，加入含10 %FBS的培養液終止消化，300 × g離心5 min后棄去上清，加入2 mL紅細胞裂解液裂解2 min，加入PBS清洗，再次300 ×g離心5 min后棄去上清，加入10 mL培養液吹打重懸細胞，利用差速貼壁法收集心肌細胞種板。待種板20 h后，使用不加FBS的DMEM培養液饑餓4 h，加入Uhrf1過表達腺病毒（MOI=50），培養20 h。

3.8 心肌細胞免疫熒光染色 加入4%多聚甲醛固定心肌細胞15 min后PBS洗3次，每次5 min。將適量Triton-X 100加入到5%驢血清封閉液中制成0.3%～0.5%封閉通透液，室溫孵育1 h后洗滌。4 ℃過夜孵育UHRF1抗體及CT3抗體，次日復溫30 min后再次洗滌。避光室溫孵育相應種屬Ⅱ抗1 h，洗滌后加入含DAPI的封片劑于共聚焦顯微鏡拍攝。

3.9 H2O2細誘導胞氧化損傷模型制備 將其余加入Uhrf1過表達腺病毒組的細胞隨機均分為兩組，其中一組更換含有200 μmol/L H2O2的DMEM培養液，另一組更換普通DMEM培養液。對照病毒組進行相同處理，培養2 h后收樣。

3.10 提取原代心肌細胞蛋白 饑餓4 h后將其余細胞更換為含有200 μmol/L H2O2的DMEM培養液培養2 h后收樣。加入RIPA裂解液，刮下貼壁細胞充分裂解，收集細胞及裂解液至EP管，20 000 ×g離心15 min，取上清液BCA法測濃度，調整至一致濃度后上樣行Western blot，孵育UHRF1抗體、γH2AX抗體、H2AX抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體及α-Tubulin抗體驗證腺病毒過表達水平并研究DNA損傷程度。

4 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.5軟件分析數據。所有數據用均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）進行統計學分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 重組質粒pADM-CMV-C-FH的驗證

質粒pADM-CMV-C-FH圖譜及酶切位點見圖1。經酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示兩條帶，一條為2 kb左右，一條為4 kb 左右，證明重組質粒獲得長約2 349 bp的插入片段（即目的基因Uhrf1），見圖2。

Figure 1.Plasmid pADM-CMV-C-FH map and restriction enzyme cleavage sites.圖1 質粒pADM-CMV-C-FH圖譜及酶切位點

Figure 2.The electrophoretic analysis of DNA fragments after enzymatic digestion on an agarose gel.圖2 酶切產物DNA片段瓊脂糖凝膠電泳檢測分析

2 重組腺病毒ADM-Uhrf1感染細胞觀察及病毒滴度測定

根據兩組陽性細胞梯度圖（圖3），最終計算得出ADM-Uhrf1病毒滴度為1.8×1013pfu/L。

Figure 3.DAB staining of gradient dilution viral sample.A：DAB-positive cells at a viral dilution of 10-6 μL；B：DAB-positive cells at a viral dilution of 10-7 μL.圖3 梯度稀釋病毒樣品的DAB染色

3 UHRF1在心肌細胞中的免疫熒光染色表達水平

免疫熒光染色檢測UHRF1在心肌細胞中表達情況顯示，與ad-Ctrl組相比，ad-Uhrf1組UHRF1表達水平顯著增加，且其表達主要位于心肌細胞核內，見圖4。

Figure 4.Representative immunofluorescence images of cardiomyocytes from the ad-Ctrl group and the ad-Uhrf1 group were presented， showing various channels and merged images.Monochromatic channel images depicted Uhrf1， cardiac troponin T （cTnT） and DAPI.The merged images combined the information from all three channels.圖4 新生小鼠原代心肌細胞免疫熒光染色各通道代表圖

4 過表達Uhrf1減輕心肌細胞DNA損傷而不影響細胞凋亡

Western blot分析結果顯示，無論H2O2處理與否，與ad-Ctrl組相比，ad-Uhrf1組的UHRF1蛋白表達水平均呈現顯著上調（P＜0.05）。H2AX和DNA損傷的標志物γH2AX（Ser139）的蛋白表達水平在不經H2O2處理的情況下未觀察到顯著差異，而在H2O2處理情況下，ad-Uhrf1組的γH2AX蛋白表達水平相比ad-Ctrl組顯著下調（P＜0.01）。此外，在各組中均未檢測到Bax和Bcl-2等細胞凋亡蛋白表達水平的改變，見圖5。

Figure 5.Impact of Uhrf1 overexpression on H2O2-induced oxidative injury in cardiomyocytes.The protein expression levels of Uhrf1，γH2AX， H2AX， Bax， Bcl-2 and α-tubulin upon hydrogen peroxide treatment and Uhrf1 overexpression were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs ad-Ctrl group.圖5 過表達Uhrf1對心肌細胞H2O2氧化損傷模型的影響

討 論

作為全身血液循環系統的核心器官，心臟在代謝過程中以及發生缺血再灌注損傷后會產生大量的活性氧，包括但不限于H2O2和自由基，這些活性氧物質過量積聚可能引發心肌細胞膜脂質的過氧化、DNA的損傷以及蛋白質的氧化，直接影響心肌細胞的功能和整體心臟健康。近年來，Uhrf1作為維持DNA甲基化的基本表觀遺傳學調節因子一直受到廣泛關注［7］，除了在復制過程中起到維持DNA甲基化的重要作用外，Uhrf1在DNA損傷修復方面同樣扮演著關鍵的協同角色。鑒于腺病毒過表達的直接特性［8］，本實驗成功構建了攜帶Uhrf1基因的重組腺病毒載體的實驗模型，并確認了其滴度［9］，在實現體外心肌細胞Uhrf1特異性過表達的前提下進一步研究了其對H2O2誘導的DNA損傷的影響。

實驗結果表明，與對照組相比，心肌細胞過表達Uhrf1組的γH2AX蛋白表達水平顯著降低，而H2AX蛋白的總表達水平并未發生變化，這表明過表達Uhrf1能夠減輕H2O2引發的心肌細胞DNA氧化損傷。這一結果與先前的研究結果一致，即SRA和RING結構域在與受損DNA結合以及募集DNA修復相互作用因子方面發揮作用，使得DNA修復機制能夠迅速檢查、修復和替換受損DNA上的錯誤遺傳信息，從而保障DNA在遺傳過程中的準確性［10-11］。

此外，有研究報道H2O2能夠誘導細胞凋亡［12］，我們檢測了細胞凋亡通路相關蛋白Bax及Bcl-2的表達水平，但過表達Uhrf1并未改變其表達水平，這表明UHRF1可能不通過抗凋亡通路促進心肌細胞應對DNA損傷的反應能力［13］。綜合考慮到Uhrf1在細胞增殖［14］、DNA甲基化［7］及調控AMPK能量代謝方面的作用［15-16］，這提示UHRF1可能通過DNA甲基化或其他結構域的功能來抵抗心肌細胞受到的DNA損傷，抑或是心肌細胞本身可能通過某種機制來對抗細胞凋亡，以應對日常產生的大量活性氧的損傷。然而，需要進一步的實驗研究來探索Uhrf1基因在抵抗心肌細胞死亡中的確切作用機制。

總之，本研究通過利用腺病毒載體構建技術建立了體外心肌細胞H2O2氧化損傷模型，為深入了解與氧化損傷相關的心血管疾病提供了實驗基礎。