PDHA1促進三陰性乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移*

李佳琪， 孫 勇， 李 樂， 李 媛， 范 駿， 孔之華， 毛曉韻， 戴 勇△

（1暨南大學基礎醫學與公共衛生學院醫學生物化學與分子生物學系，廣東 廣州 510632；2廣東省中西醫結合醫院，廣東 佛山 528200；3中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，遼寧 沈陽 110001）

據2022年病例統計，乳腺癌是全球女性中最常見的癌癥，占比31%。而乳腺癌的高發病率成為引起全世界婦女殘疾、死亡的主要誘因［1］。雌激素受體（estrogen receptor， ER）、孕激素受體（progesterone receptor， PR）和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）是乳腺癌診斷的重要生物表型標志物，因此通過乳腺癌組織病理學診斷、激素受體和生長因子受體的表達水平可將乳腺癌繼續劃分為三個亞型：（1）表達激素受體乳腺癌：ER+或PR+；（2）HER2+乳腺癌；（3）三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC），ER-、PR-和HER2-［2-7］。診斷中含有ER、PR和HER2陽性的乳腺癌亞型因為有明確的靶標，已經開發出具有針對性的治療方案［8-11］，而TNBC由于缺乏明確的驅動基因，目前還沒有效果良好的靶向治療方案。因此，迫切需要確定TNBC中潛在的可藥物靶點以進行有效治療。近年來，代謝重編程已成為癌細胞的標志，糖代謝重編程包括有氧糖酵解和氧化磷酸化的改變是癌細胞顯示出的獨特代謝表型以促進細胞進展和轉移。通過探索糖代謝重編程相關重要基因和蛋白的表達與功能的變化將有助于揭示TNBC發生發展的特點，為尋找新可藥物靶點提供理論依據。

位于線粒體中的丙酮酸脫氫酶復合物（pyruvate dehydrogenase complex， PDHC）是橋接糖酵解和氧化磷酸化的關鍵因子［12］，負責將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，后者進入三羧酸循環和氧化磷酸化，與乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶一起，共同調節丙酮酸是轉變為乳酸還是乙酰輔酶A，從而決定細胞代謝模式是依賴糖酵解還是依賴三羧酸循環。丙酮酸脫氫酶E1亞基α1（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）是PDHC中的關鍵酶，直接催化丙酮酸轉化乙酰輔酶A，其酶活性受丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase， PDK）和丙酮酸脫氫酶磷酸酶（pyruvate dehydrogenase phosphatase 1， PDP1）共同調控。PDK在S293等位點磷酸化PDHA1，抑制其酶活性；PDP1則通過解除PDHA1磷酸化狀態，激活PDHA1活性。之前的研究表明，多種酪氨酸激酶與乙酰輔酶A乙?；D移酶能夠通過酪氨酸磷酸化、乙?；确g后修飾調控PDHC構成以及PDHA1、PDK和PDP1活性等方式促成腫瘤細胞代謝從線粒體三羧酸循環氧化磷酸化通路向有氧糖酵解通路的轉變［13-19］。但是，PDHA1蛋白水平的變化對乳腺癌特別是對TNBC增殖、轉移和預后的影響目前尚不完全清楚。本研究通過生物信息學分析、體外細胞實驗、患者樣本免疫組化染色等方法解析了PDHA1表達在乳腺癌特別是TNBC中發生、發展和轉移中的作用及其病理生理意義，為進一步探索將調控PDHA1作為治療TNBC的新靶點奠定理論基礎。

材料和方法

1 組織樣本

本研究課題中所涉及的臨床樣本組織來自中國醫科大學附屬第一醫院，對應患者信息見表1。所有樣本檢測經過暨南大學醫學倫理委員會審查并嚴格按照醫學倫理規范和要求進行。

表1 臨床組織樣本患者基本信息Table 1.Basic information of the patients and clinical tissue samples

2 主要試劑

高糖型DMEM培養液購于Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購于廣州康凱信生物科技有限公司；胰蛋白酶（含酚紅和EDTA）和雙抗（青霉素和鏈霉素）和嘌呤霉素均購于凱基生物科技有限公司；兔抗人PDHA1抗體（sc-377092）購于Santa Cruz；兔抗人E-cadherin抗體（3195s）、兔抗人N-cadherin抗體（13116S）和兔抗人vimentin抗體（5741S）購于Cell Signaling Technology；鼠抗人β-actin抗體（26F7）購于華安生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購于BioSharp；Tween-20購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

3 實驗方法

3.1 生物信息學分析 UALCAN數據庫用于分析PDHA1在正常乳腺組織與不同分子分型的乳腺癌組織中的表達。調用TCGA-BRCA數據集中BRCA表達譜分析PDHA1在乳腺癌T、N、M各分級階段和不同亞型中的表達差異；利用KM-plotter數據庫分析PDHA1表達水平與生存預后的相關性［20-21］?；赑DHA1的表達量，采用R軟件的DESeq2程序包分別對高、低表達PDHA1乳腺癌患者的RNA測序數據進行差異分析，對差異基因進行基因本體（Gene Ontology， GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。String數據庫為PHDA1蛋白及其相互作用蛋白提供可視化。

3.2 免疫組化檢測 將組織切片置入60 ℃烤箱溶蠟，隨后將切片依次放入四盒100% xylene、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、30%乙醇中各5 min，使用甲醇-雙氧水混合物浸泡將內源性過氧化物酶失活后，放入微波爐在煮沸的1× citrate buffer中煮沸10 min。然后將組織切片移出冷卻至室溫，對組織切片滴上normal horse serum（2.5%）和親和素的混合液進行室溫封閉，接著加入相應Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，室溫孵育Ⅱ抗，然后加入DAB顯色液和蘇木精染核，最后放入60 ℃烘箱烤干封片，進行拍照記錄。

3.3 Western blot實驗 將細胞從培養箱拿出，棄去培養液進行PBS潤洗，再加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解，將細胞碎片刮下來，移至1.5 mL EP管中，提取細胞總蛋白。吸取部分細胞裂解液用于BCA蛋白定量實驗，調齊后等量上樣，剩余細胞裂解液加入5× SDS-PAGE樣品loading buffer，充分混勻，樣品煮沸變性，直接進行免疫印跡法分析。將蛋白樣品進行SDS-PAGE、轉膜，5% BSA室溫下封閉膜1 h，加入相應Ⅰ抗（PDHA1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin抗體，1∶1 000稀釋；β-actin抗體，1∶10 000稀釋）4 ℃搖床孵育過夜。用TBST清洗后室溫孵育相應的抗兔、抗鼠Ⅱ抗，最后使用ELC發光液顯影拍照存檔。

3.4 細胞培養 人TNBC細胞系MDA-MB-231購自Procell。37 ℃、5% CO2的培養箱內培養MDA-MB-231細胞，配制10% FBS和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的高糖型DMEM培養液培養細胞。當細胞密度達到90%左右時，棄去培養液，用無菌PBS潤洗2遍，隨后加入適量胰酶消化，用新鮮培養液終止消化，并按1∶3的比例進行細胞傳代。

3.5 包裝病毒 HEK293FT在6孔板密度為70%左右時轉染，將包裝質粒和目的質粒以及PEI分別加入200 μL培養液靜置5 min，再混合靜置20 min，置入培養皿中，轉染后6 h換液，24或48 h收集培養皿上清液即為病毒液，收集后以1 000×g離心5 min，立即使用或-80 ℃凍存。

3.6 構建穩定細胞系 選擇pLVX3-Hygpmycin載體，選擇XhoI限制性核酸酶對其進行單酶切，采用無縫克隆方法，設計過表達引物，構建pLVX3-Hyg-PDHA1質粒（正向引物序列為5'-CGGCCGCAGGTCTCGAGGTGAGGAAGATGCTCGCCGC-3'，反 向引物序列為5'-ACTACTTATTCACTCGATTAACTGACTGACTTAAACTT-3'）。選擇V2載體，構建V2-PDHA1質粒（正向引物序列為5'-CACCGGGTGTCCTTACTCTCAGCCC-3'，反向引物序列為5'-AAACGGGCTGAGAGTAAGGACACCC-3'）。將V2-PDHA1、陰性對照V2、pLVX3-Hygpmycin和pLVX3-Hyg-PDHA1質粒包裝成病毒［22］。待目的細胞在6孔板中的密度為60%時，更換培養液，加入1 mL新鮮培養液（0.001%聚凝胺）中，37 ℃孵育30 min，將病毒液與培養液等比例加入，感染MDA-MB-231細胞，24 h后換液加入嘌呤霉素篩選培養。

3.7 細胞增殖實驗 將細胞每孔10×104個接種于6孔板中，待細胞貼壁后，每天計數細胞數量，第3天將每孔細胞逐個傳代到6 cm培養皿中，每孔重復計數3次，連續計數6 d。

3.8 細胞劃痕實驗 將細胞接種于6孔板中，待細胞均勻長滿每個孔后，用無菌200 μL吸頭筆直地在每個孔中劃痕，更換成1% FBS和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的高糖型DMEM培養液培養細胞，進行第一次拍照，然后每隔24 h拍照記錄。

3.9 集落形成實驗 將目的基因穩定敲除和對照細胞按照每孔800個接種于6孔板中，每種細胞培養3個孔，當單個細胞集落長至肉眼可見時，從培養箱中取出，加入多聚甲醛固定細胞，隨后用結晶紫染液染色，最后拍照計數細胞集落個數。

3.10 Transwell實驗 取陰性對照、PDHA1穩定敲除、回補PDHA1成功的細胞，按每孔1×104個細胞接種于不含血清培養液的上室中，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清培養液，放入培養箱培養16 h后，將小室取出固定染色，顯微鏡下進行拍照記錄。

4 統計學處理

所有實驗至少重復3次，采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行統計分析。數據用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。當P＜0.05時表明差異有統計學意義。

結 果

1 PDHA1在乳腺癌中高表達

通過對TCGA數據的綜合分析，我們試圖了解不同臨床病理特征的乳腺癌組織中PDHA1的表達情況。結果顯示，與癌旁組織相比，各種乳腺癌亞型中PDHA1的mRNA表達水平顯著升高，其中TNBC亞型比Luminal和HER2陽性亞型表現出更明顯的上調，見表2和圖1A。此外，PDHA1 mRNA表達在T階段隨著腫瘤大小的增加而呈現上升趨勢，而N和M腫瘤階段之間沒有觀察到有統計學意義的差異，見表2和圖1B。乳腺癌組織中PDHA1的mRNA表達量與ER和PR相關，但與HER2無顯著相關性，見表2和圖1C～E。此外，乳腺癌細胞系（MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-486和T47D）中PDHA1的mRNA表達水平明顯高于正常乳腺上皮細胞（MCF-10A），見圖1F。

Figure 1.High expression of PDHA1 in breast cancer.A： the expression of PDHA1 in normal breast tissue and breast cancer tissue analyzed by UALCAN database；B： the expression of PDHA1 in different clinicopathological stages of breast cancer analyzed by TCGA database；C： the PDHA1 expression in ER negative or positive cases analyzed by TCGA database；D： the PDHA1 expression in PR negative or positive cases analyzed by TCGA database；E： the PDHA1 expression in HER2 negative or positive cases （n=1 226） analyzed by TCGA database；F： the expression of PDHA1 in normal breast epithelial cell line and breast cancer cell lines.Mean±SD.*P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs Luminal group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs T1 group；▲▲P＜0.01 vs negative group；@@P＜0.01 vs MCF-10A group.圖1 PDHA1在乳腺癌中高表達

表2 乳腺癌患者PDHA1表達與臨床病理特征的關系Table 2.Relationship between PDHA1 expression and clinicopathologic features in breast cancer patients

2 PDHA1在乳腺癌中高表達提示患者預后不良

免疫組織化學分析證實，與配對的癌旁組織相比，乳腺癌組織中PDHA1蛋白水平顯著上調，見圖2A。為闡明PDHA1對乳腺癌患者預后的影響，本研究利用KM-plotter數據庫根據PDHA1的表達水平對乳腺癌患者進行生存分析，結果顯示，PDHA1高表達患者的總生存期（overall survival， OS）、無遠處轉移生存期（distant metastasis free survival， DMSF）和無復發生存期（recurrence free survival， RFS）明顯低于PDHA1低表達患者，見圖2B。

Figure 2.High expression of PDHA1 in breast cancer suggestsed poor patient prognosis.A： the expression of PDHA1 in TNBC tissues and paracancerous tissues detected by immunohistochemical staining （scale bar=100 μm）；B： three different types of survival analysis of breast cancer patients with different PDHA1 expression levels in KM-plotter database.圖2 PDHA1在乳腺癌中高表達提示患者預后不良

3 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231細胞增殖

使用Western blot分析進行研究，以驗證TNBC細胞系MDA-MB-231中PDHA1的穩定敲除，見圖3A。隨后，對穩定的PDHA1敲除MDA-MB-231細胞系和對照細胞系進行細胞計數實驗和集落形成測定。結果表明，PDHA1敲除后細胞增殖減少，見圖3B～D。這些結果證明PDHA1在促進MDA-MB-231細胞的增殖能力中發揮著關鍵作用。

Figure 3.Knockout of PDHA1 inhibited MDA-MB-231 cell proliferation.A： Western blot detection of PDHA1 knockout effect in MDA-MB-231 cells；B： cell counting method to detect the proliferation ability of MDA-MB-231 cells after knockout of PDHA1；C： clone formation assay to detect the proliferation ability of MDA-MB-231 cells after PDHA1 knockout.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs parental group.圖3 敲除PDHA1抑制MDA-MB-231細胞增殖

4 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231細胞遷移和侵襲

為了研究PDHA1對細胞遷移和侵襲的影響，使用野生型、穩定PDHA1敲除和PDHA1回補3種MDA-MB-231細胞系進行劃痕實驗。結果顯示，PDHA1敲除明顯抑制細胞遷移，并且這種效應可以通過PDHA1回補來挽救，見圖4A、B。使用相同的細胞系進行后續Transwell測定以評估遷移能力。穩定敲除PDHA1可以抑制MDA-MB-231細胞的遷移潛力，而PDHA1回補恢復其遷移能力，見圖4C、D。進一步的探索涉及針對上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition， EMT）途徑標志物的蛋白質印跡實驗。結果表明，相對于對照組，MDA-MB-231細胞中穩定的PDHA1敲除導致E-cadherin蛋白水平升高，而N-cadherin和vimentin蛋白沒有表現出統計學意義上的顯著變化，表明PDHA1促進MDA-MB-231細胞的EMT，見圖4E、F?？傊?，PDHA1促進MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。

Figure 4.Knockout of PDHA1 inhibited the migration and invasion of MDA-MB-231 cells.A： scratch experiment to detect the migration ability of three MDA-MB-231 cell lines： wild-type， stable knockout of PDHA1， and complement of PDHA1 （scale bar=400 μm）；B： Transwell experiment was performed to detect the invasion ability of three MDA-MB-231 cell lines： wildtype， stable knockout of PDHA1， and complementation of PDHA1 （scale bar=400 μm）；C： Western blot experiment and related gray value analysis for marker proteins of the epithelial-mesenchymal transition pathway.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs vector+parental group；△△P＜0.01 vs parental group.圖4 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲

5 PDHA1在乳腺癌中的相互作用蛋白

為進一步闡明PDHA1促進乳腺癌進展的分子機制，我們使用String數據庫進行分析，以預測PDHA1的相互作用蛋白并利用在線工具仙桃學術對分析結果作圖。該結果揭示了涉及PDHA1及其相互作用蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用網絡，表明PDHA1與核糖核酸酶P/MRP蛋白亞基（ribonuclease P/MRP protein subunit， POP1）、支鏈氨基酸轉氨酶2（branched chain amino acid transaminase 2， BCAT2）、二氫硫辛酰胺S-琥珀酰轉移酶（dihydrolipoamideSsuccinyltransferase， DLST）等之間存在潛在的相互作用，見圖5。該網絡的形成意味著涉及這些蛋白質的蛋白質復合物可能影響乳腺癌的發生和發展。

Figure 5.Visualization of PHDA1 protein and its interacting proteins using String database.圖5 PHDA1蛋白及其互作蛋白可視化網絡

6 預測PDHA1在乳腺癌中的相互作用蛋白及通路

分析相對正常乳腺組織，乳腺癌中PDHA1高表達組和PDHA1低表達組之間共表達基因的差異。我們在高PDHA1表達組中相對于低PDHA1表達組確定了2 143個上調基因和1 422個下調基因（|log2FC|≥1，P＜0.05），見圖6A。為研究與PDHA1相關的差異表達基因的功能意義，對3 565個差異表達基因進行了GO和KEGG分析。結果表明PDHA1可能通過與生長發育的途徑調節乳腺癌的發生發展，見圖6B～E。

Figure 6.Compared with normal breast tissue， GO annotation and KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between high PDHA1 expression and low PDHA1 expression groups in breast cancer tissue.圖6 相對于正常乳腺組織，在乳腺癌組織中PDHA1高表達與PDHA1低表達組間差異表達基因的GO注釋和KEGG通路分析

為了明確PDHA1表達差異對腫瘤細胞信號通路的調控作用，我們以PDHA1表達的中位數為切點，將乳腺癌患者分為高表達PDHA1組和低表達PDHA1組，并進行組間差異基因分析。相較于低表達PDHA1組，高表達PDHA1組顯示出6 188個差異基因，其中上調的有1 110個，下調的有5 078個（圖7）。將GO注釋和KEGG通路分析的前10個結果繪制圖形，結果顯示，PDHA1失調可能影響細胞代謝進程，從而調控乳腺癌的發生發展，見圖7。

Figure 7.In breast cancer tissue， volcano plot， KEGG analysis and GO annotation of differentially expressed genes between PDHA1 high expression and PDHA1 low expression groups.圖7 在乳腺癌組織中，PDHA1高表達與PDHA1低表達組間差異表達基因火山圖及KEGG分析和GO注釋

討 論

腫瘤代謝重編程是促使惡性腫瘤發生發展的標志，而有氧糖酵解也是腫瘤細胞重要的代謝特征［23-24］。PDHA1是線粒體中確定糖酵解通路和三羧酸循環通路平衡的樞紐，在決定腫瘤代謝模式的轉換以及發生發展發揮著重要作用。TNBC缺乏明確的驅動基因，目前還沒有效果良好的靶向治療方案，而TNBC具有顯著的代謝紊亂，因此，我們對PDHA1在TNBC中的表達及影響進行了探討。

通過檢索TCGA數據庫，根據PDHA1的表達水平對乳腺癌患者進行生存分析，結果顯示PDHA1高表達與乳腺癌患者總生存期呈負相關，PDHA1在具有不同臨床病理特征乳腺癌組織中的表達，mRNA水平在不同乳腺癌亞型中明顯升高，在腫瘤T分期中隨著腫瘤大小的增加有上調的趨勢。臨床樣本免疫組化結果顯示，相對于癌旁組織，乳腺癌組織中的PDHA1表達水平顯著升高，提示PDHA1高表達會促進乳腺癌的發展，與生存分析結果趨勢一致。體外細胞實驗顯示，在穩定敲除PDHA1的TNBC細胞系MDA-MB-231中，細胞增殖、集落形成、遷移能力和EMT均明顯減弱，提示PDHA1的高表達與TNBC的發生發展以及遠端轉移密切相關。與之類似的是肺腺癌PDHA1的高表達與不良的總生存期相關，而胃腺癌患者中低表達PDHA1提示有良好的預后［25］。為了進一步驗證TNBC中高表達 PDHA1與腫瘤細胞增殖、遷移的關系，我們構建了穩定敲除PDHA1的MDA-MB-231細胞，檢測到敲除PDHA1后會抑制細胞遷移、侵襲能力，在穩定回補外源性表達的PDHA1后恢復了促進細胞遷移和侵襲能力，進一步說明PDHA1在TNBC增殖、轉移過程中具有重要作用。轉移是許多惡性腫瘤死亡率增加的主要原因，其中，EMT途徑是促進腫瘤遷移和侵襲的關鍵驅動因素［26-30］。乳腺癌具有顯著異質性，因此EMT通路中關鍵標志物表達水平的變化可作為指示性指標，為了解乳腺癌遷移和侵襲能力的動態變化提供見解［31-33］。認識到EMT在轉移級聯反應中的關鍵作用，為探索PDHA1對乳腺癌侵襲行為的潛在干預提供了寶貴的視角。為進一步探索PDHA1促進TNBC遷移的分子機制，我們檢測了EMT通路相關蛋白，結果顯示敲除PDHA1后E-cadherin蛋白量明顯上調，提示PDHA1促進TNBC的轉移。之前的研究表明，翻譯后修飾在調控PDHA1功能上起著重要的作用。酪氨酸激酶FGFR1在Y243、244位點和Y136位點磷酸化PDHK，激活其活性，從而進一步磷酸化PDHA1的S293位點，抑制PDHA1轉換丙酮酸的能力，促進肺癌細胞增殖和腫瘤生長。丙酮酸脫氫酶磷酸酶PDP1在Y381位點磷酸化修飾后脫離去乙?；窼IRT3、招募乙酰轉移酶ACAT1，進一步乙?；疨DHA1和PDP1，促進PDK對PDHA的抑制性磷酸化，促進有氧糖酵解和腫瘤細胞增殖［15］。此外，在TNBC細胞中，干擾PDHA1能夠導致TNBC腫瘤轉移能力下降和對葡萄糖缺乏引起的代謝壓力的不耐受，AMPK通過調節丙酮酸脫氫酶復合體的活性從而調控三羧酸循環水平促進TNBC轉移［34］。但是，PDHA1蛋白本身如何促進TNBC轉移還不清楚。為了進一步探索PDHA1促進TNBC增殖和轉移的機制，我們采用生物信息學方法來鑒定PDHA1在乳腺癌中潛在的過度表達，其可能與POP1、BCAT2和DLST形成蛋白復合物。乳腺癌中POP1的表達升高可促進細胞增殖和遷移，同時抑制細胞凋亡［35-37］。DLST（一種三羧酸循環酶）的耗盡會抑制人類TNBC細胞系的生長并誘導細胞凋亡［38-40］。與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中POP1、BCAT2和DLST的高表達水平與不良預后相關［35-41］，協同促進乳腺癌的發生和發展。使用GO和KEGG通路的差異表達基因分析表明，PDHA1的上調可以刺激與生長發育或細胞代謝相關的通路，從而促進乳腺癌的增殖和轉移。然而，PDHA1是否通過與上述蛋白的相互作用來促進TNBC細胞的增殖和遷移有待后續研究進一步探討。