hsa-miR-204-5p對人臍靜脈內皮細胞生物學行為的影響*

張義煒， 楊 英， 潘尚領

（廣西醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，廣西 南寧 530021）

血管內皮細胞在循環系統的發育和維持中起著關鍵作用［1］，其功能的障礙是冠狀動脈粥樣硬化發生的基礎［2］，而后者引發的冠心?。╟oronary heart disease， CHD）是近代以來人類最主要的死亡原因［3-4］。因此，明確內皮細胞功能障礙的機制，有助于CHD的防治，提高人類壽命。已知吸煙、熬夜等不良生活方式及高血壓、糖尿病、高血脂、肥胖等基礎病是血管內皮細胞損傷的重要因素，損傷所致的內皮細胞黏附因子/趨化因子表達、泡沫細胞的聚集、血脂的沉積、內皮細胞的異常增殖和凋亡［5-8］，是CHD發生發展的主要過程及機制，但具體的細節及信號轉導通路尚未明了。近年，高通量測序技術的進步及生物信息學的發展，讓人們對非編碼RNA的功能有了新的認識，它們在內皮細胞穩態失調中的作用逐漸被揭示。

微小RNA（microRNA， miRNA）是一類非編碼小RNA，其主要作用方式是通過靶向結合mRNA的3’UTR區抑制靶基因的翻譯或促進mRNA的降解［9］。新近有報道表明，miRNA參與調節血管生成的過程［10］，而且已發現多種miRNA作為CHD的生物標志物參與CHD的發生發展。例如miR-320b通過促進p65磷酸化水平來提升促炎細胞因子水平，進而促進動脈粥樣硬化［11］；miR-27a和miR-329表達水平的增加可能通過下調ABCA1和ABCG1基因的表達促進動脈粥樣硬化斑塊的進展［12］；miR-15b-5p通過抑制mTOR信號通路抑制CHD［13］。

hsa-miR-204-5p（以下簡稱miR-204-5p）在多個領域已被研究，其中作為腫瘤抑制因子的報道最為廣泛，例如miR-204-5p可抑制甲狀腺癌［14］和胃癌［15］的發生發展，其大概機制是抑制腫瘤細胞的增殖和遷移、促進腫瘤細胞的凋亡。而CHD的發生是內皮細胞的異常增殖和凋亡所致，因此，我們推測，miR-204-5p有可能會影響內皮細胞的功能狀態，故本研究的主要目的是進一步了解miR-204-5p對內皮細胞遷移、增殖、周期及凋亡的影響，為防治CHD提供新的參考資料。

材料和方法

1 實驗材料

人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926購自中科院上海細胞庫。

2 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自上海逍鵬生物科技有限公司；DMEM培養液購自GIBCO；LipoFiter 3.0脂質體轉染試劑購自上海漢恒生物科技有限公司；miR-204-5p mimics和mimics陰性對照（mimics-negative control， mimics-NC）購自蘇州吉瑪基因有限公司。hsa-miR-204-5p mimics的正義鏈序列為5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3'，反義鏈序列為5'-GCAUAGGAUGACAAAGGGAAUU-3'；mimics-NC的正義鏈序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈序列為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。SanPrep Column microRNA Extraction Kit和miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline， PBS）購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶細胞消化液購自上海生工生物工程股份有限公司；細胞周期試劑盒和細胞凋亡試劑盒（Annexin V-APC/7AAD）均由杭州聯科生物技術股份有限公司提供；75%乙醇溶液購自廣西博亨醫療用品有限公司；過氧化氫（H2O2）溶液購自Sigma；AxyPrepTm Multisource Total RNA Miniprep Kit購自杭州AXYGEN 生物技術有限公司；RNA文庫制備及測序由上海天昊生物科技有限公司完成。

3 主要方法

3.1 細胞轉染 選擇EA.hy926細胞用于分析miR-204-5p對細胞功能的影響［16］。培養基為含10% FBS的DMEM。將細胞放在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。所有操作均在超凈臺內進行，操作前紫外線照射30 min以上。將EA.hy926細胞接種于六孔板中，每孔4×105個細胞，待細胞匯合度達到80%左右，利用LipoFiter 3.0脂質體轉染試劑轉染miR-204-5p mimics和mimics-NC。轉染步驟以LipoFiter 3.0脂質體轉染試劑說明書為準。轉染30 h左右，利用San-Prep Column microRNA Extraction Kit提取細胞miRNA，并使用miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒將miRNA逆轉錄成cDNA。利用RT-qPCR測定轉染效率并進行后續的細胞功能實驗。RT-qPCR條件如下：95 ℃預變性600 s；隨后在95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s條件下進行40個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s后得到熔解曲線，最后50 ℃ 30 s進行降溫。miR-204-5p轉染效率測定公式為2-ΔΔCt［ΔΔCt=（CtmiR-204-5pmimics-CtmiR-204-5pmimicsU6）-（Ctmimics-NCCtmimics-NCU6）］。

3.2 細胞活力實驗 收集轉染了miR-204-5p mimics和mimics-NC的EA.hy926細胞，調整細胞懸液濃度為4×107/L，取一96孔板，每孔加100 μL，使細胞數為每孔4 000個。每孔加10 μL CCK-8試劑，放置于細胞培養箱孵育1 h。最后，使用酶標儀分別于0、24、48、72和96 h測量細胞在450 nm處的吸光度。

3.3 細胞劃痕實驗 轉染miR-204-5p mimics和

mimics-NC入EA.hy926細胞30 h后，用PBS洗滌一次細胞。利用1 000 μL槍頭按十字線進行劃痕，然后再次使用PBS洗滌兩次細胞，分別于0、12、24和36 h在倒置顯微鏡4倍目鏡/10倍物鏡下拍照。利用ImageJ軟件分析劃痕面積。

3.4 細胞遷移實驗 通過Tranwell實驗進一步研究miR-204-5p對EA.hy926細胞遷移能力的影響。使用胰蛋白酶細胞消化液消化細胞。利用含2% FBS的DMEM重懸細胞，使細胞濃度為2×108/L，充分混勻后吸取100 μL細胞懸液種于小室中，將小室浸于裝有500 μL含3% FBS的DMEM的24孔板內，24 h后，將小室取出，使用PBS洗滌3次后，利用甲醇固定30 min。最后，對小室外側細胞進行結晶紫染色，8～12 h后，使用PBS洗滌3次小室，晾干后于倒置顯微鏡下拍照。

3.5 細胞周期實驗 收集至少1×106個細胞到10 mL管中，1 000 rpm離心5 min。棄去上清液，向每管中加入1 mL預冷的PBS清洗3次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 mL PBS重懸細胞，隨后，使用200 μL槍頭吸取細胞懸液，逐滴加入到3 mL預冷的75%乙醇溶液中，邊加邊震蕩，-20 ℃避光固定過夜；次日，將細胞拿出，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，向每管中加入5 mL PBS清洗一次，放置15 min后1 000 r/min離心5 min；棄去上清，每個樣本中加入1 mL DNA staining solution，室溫下避光孵育30 min，隨后使用流式細胞儀檢測細胞周期。

3.6 細胞凋亡實驗 首先，利用不同濃度H2O2溶液構建細胞凋亡模型，濃度梯度依次為200、400、600、800、1 000和1 200 μmol/L。使用最佳濃度H2O2溶液和轉染了miR-204-5p mimics和mimics-NC的926細胞共培養24 h后，至少收集1×106個細胞，1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，每管加入1 mL PBS，洗滌3次。留取細胞沉淀，加入500 μL 1× Binding Buffer重懸細胞，隨后每管加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7AAD，輕輕震蕩混勻后，室溫避光孵育15 min，利用流式細胞儀（BD FACSC Calibur）檢測細胞凋亡率。

3.7 RNA-seq 使 用AxyPrepTm Multisource Total RNA Miniprep Kit提取細胞總RNA，確保RNA總量＞2 μg，濃度≥100 mg/L，A260/A230≥2.0，A260/A280在1.8～2.2之間，且Agilent 2100 Bioanalyzer檢測的RIN≥6.5。以美國Illumina生物技術公司的樣品制備試劑盒說明書為準構建cDNA文庫。構建完成后，應用Agencourt SPRIselect核酸片段篩選試劑盒純化文庫的同時進行片段大小篩選。使用Qubit和Agilent 2100 Bioanalyzer分別檢測文庫濃度與文庫片段長度分布。要求濃度＞5 mg/L，且片段長度集中在300～400 bp之間。文庫最終以2×150 bp雙端測序模式在Illumina高通量測序平臺進行高通量測序并獲得FastQ數據。采用FastQC軟件及R version 4.2.1對原始測序數據進行質量評估。使用STAR軟件將過濾后的reads與參照數據庫進行比對，比對上的堿基所占比例在一定程度上能反映測序水平的高低、所選參考基因組的優劣以及后期分析水平的可靠程度。利用Stringtie的分析流程對已知的基因和轉錄本進行表達定量。采用Deseq2軟件分析差異表達基因。篩選條件為P＜0.05且|log2（fold change）|＞0.5。

3.8 富集分析 利用miRWalk查找miR-204-5p的下游靶基因，結合位點選擇3'UTR，和RNA-seq得到的下調基因取交集，隨后進行基因本體論（Gene Ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。通過美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information， NCBI）設計基因引物并使用RT-qPCR對富集在MAPK通路里的MAPT、PPP3R1、PRKACB、PTPRR、MAP2K4、CACNA2D2和RPS6KA6進行驗證。以GAPDH作為內參照。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1.Primer sequences of the genes

4 統計學處理

涉及兩組之間的比較，若數據符合正態分布，則使用獨立樣本t檢驗，否則使用曼惠特尼檢驗。SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0被用來分析數據和作圖，數據以均數±標準差（mean±SD）表示。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

結 果

1 過表達miR-204-5p抑制EA.hy926細胞的活力和遷移

RT-qPCR檢測結果顯示，miR-204-5p mimics組EA.hy926細胞miR-204-5p的表達效率是對照組的2 149倍，表明轉染成功，可以進行下一步實驗。CCK-8實驗用于探究miR-204-5p對EA.hy926細胞活力的影響，結果發現，miR-204-5p mimics在第24及48小時抑制EA.hy926細胞的活力；Transwell實驗表明miR-204-5p mimics可以顯著抑制EA.hy926細胞的遷移能力，見圖1。

Figure 1.Results of CCK-8 and Transwell experiments.A： CCK-8 assay showing the viability of EA.hy926 cells in mimics-NC and miR-204-5p mimics groups at 0， 24， 48， 72 and 96 h；B： Transwell assay displaying the number of migrating cells with mimics-NC and miR-204-5p mimics under an inverted microscope（×100）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs mimics-NC group.圖1 CCK-8和Transwell實驗結果

細胞劃痕結果顯示，相對于mimics-NC，miR-204-5p mimics可以在12 h和24 h抑制EA.hy926細胞的愈合能力，見圖2。

2 過表達miR-204-5p使S期細胞減少并抑制細胞凋亡

過表達miR-204-5p使G0/G1期細胞數目增多，使S期細胞數減少（P＜0.05），見圖3A。使用不同濃度H2O2構建細胞凋亡模型，結果發現1 000 μmo/L的濃度可以在不過度損傷細胞的前提下使細胞凋亡率有較高提升，因此，選擇1 000 μmo/L濃度的H2O2構建細胞凋亡模型。細胞凋亡率分析發現，miR-204-5p mimics顯著降低了EA.hy926細胞的早期凋亡率（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3.Results of the cell cycle and apoptosis assays.A： the proportion of EA.hy926 cells in G0/G1， S and G2/M phases；B： the early and late apoptosis rates of EA.hy926 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mimics-NC group.圖3 細胞周期和細胞凋亡檢測結果

3 富集分析

RNA-seq結果顯示，過表達miR-204-5p后，以P＜0.05且log2FC≤-0.5為條件，共有432個基因表達下調，和miRWalk預測的下游靶基因取交集后，共得到138個可能的下游靶基因。將下游靶基因導入metascape進行GO/KEGG富集分析，發現在生物學過程（biological process，BP）中，下游靶基因主要富集在蛋白質磷酸化（protein phosphorylation）、小蛋白偶聯修飾蛋白（protein modification by small protein conjugation）和蛋白質分解代謝過程（protein catabolic process），見圖4A；在細胞組分（cellular components，CC）中，主要富集在軸突（axon）、主軸（spindle）和細胞導端（cell leading edge），見圖4B；在分子功能（molecular function， MF）中，下游靶基因主要富集在?；D移酶活性（acyltransferase activity）、激酶活性（kinase activity）和泛素樣蛋白轉移酶活性（ubiquitinlike protein transferase activity），見圖4C。KEGG通路富集分析顯示下游靶基因主要富集在單純皰疹病毒感染（herpes simplex virus 1 infection）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）和人類T細胞白血病病毒1型感染（human T-cell leukemia virus 1 infection），見圖4D。

Figure 4.Enrichment analysis of downstream target genes of miR-204-5p.A： biological process；B： cellular component；C： molecular function；D： KEGG.圖4 miR-204-5p下游靶基因富集分析

4 miR-204-5p可能通過抑制MAPT的表達來抑制CHD的發生發展

通過富集分析可知，富集在MAPK信號通路里的 基 因 為MAPT、PPP3R1、PRKACB、PTPRR、MAP2K4、CACNA2D2和RPS6KA6。RT-qPCR結果顯示，過表達miR-204-5p后，MAPT和MAP2K4擴增結果較好且表達下降，其中MAPT表達下降最明顯，其表達量約為對照組的30%，見圖5。因此，miR-204-5p可能通過抑制MAPT/MAPK信號通路而抑制內皮細胞的活力和遷移，減少細胞凋亡，進而減緩CHD的發生發展。

Figure 5.Results of RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs mimics-NC group.圖5 RT-qPCR結果

討 論

已有研究顯示，lncRNA uc003pxg.1可以促進內皮細胞的增殖、遷移進而促進CHD的發生［17］。SIRT1被認為可通過抗氧化、抗炎和抗細胞凋亡來抑制CHD［18］。在冠心病PBLs中高表達的miR-323-3p會導致血管內皮細胞凋亡率上升進而促進CHD發病進程［19］。以上結果證明，內皮細胞增殖、遷移增強，凋亡率上升均可以促進CHD的發生，而我們的研究結果發現過表達miR-204-5p可以抑制內皮細胞的增殖和遷移，并降低其凋亡率。因此，推測miR-204-5p可能通過影響內皮細胞功能而抑制CHD的發生發展。

真核生物細胞周期主要包括G1、S、G2、M四個時期，同時，細胞也可以退出細胞周期進入靜止狀態（G0期）［20］。其中，S期又稱為DNA合成期，M期包括有絲分裂和細胞質分裂，有絲分裂和S期之間的間隔稱為G1期，S期和M期之間的間隔稱為G2期［21］。S期是細胞增殖的關鍵時期，DNA數量在此期增加一倍［22］。本研究中，過表達miR-204-5p后，發現處于S期的細胞減少，說明miR-204-5p對于內皮細胞的生長和增殖具有抑制作用。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）信號通路在細胞增殖、凋亡和分化中發揮著重要的作用［23］。目前已發現MAPK信號通路可以促進多種癌癥的發生發展，例如肝癌［24］、肺癌［25］和乳腺癌［26］等。MAPK信號通路可以促進內皮細胞的增殖和遷移，并誘導細胞從細胞周期的G1期向S/G2期轉變［27］。已有研究表明MAPK信號通路的激活可以促進內皮細胞的凋亡和損傷從而促進CHD的發展［28］。MAPK信號通路可以促進巨噬細胞的凋亡［29］和M1極化［30］來促進動脈粥樣硬化，也可以促進炎癥的發生［31］。通過富集分析，我們發現miR-204-5p下游靶基因富集在MAPK信號通路，因此推測miR-204-5p可能通過抑制MAPK信號通路進而抑制內皮細胞的遷移、增殖和凋亡，并使S期細胞減少。

綜上所述，miR-204-5p可能通過抑制MAPT/MAPK信號通路進而抑制內皮細胞的活力、遷移和凋亡，這些內皮細胞生物學行為的改變可能對CHD的發生發展產生重要的影響，潛在的影響及其機制值得進一步研究。