雙氫青蒿素通過激活氯通道促進鼻咽癌CNE-2Z細胞放療敏感性*

劉世情， 周叢然， 唐鑫偉， 周漢芬， 李雪苛， 侯秀穎， 楊海峰， 朱林燕△

（1暨南大學基礎醫學與公共衛生學院藥理學系，廣東 廣州 510632；2廣東省中醫院病理科，廣東 廣州 510120；3廣東省中醫院大學城醫院放射科，廣東 廣州 510006；4廣州華商學院，廣東 廣州 511300）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是以低分化鱗狀細胞癌為主的一種頭頸部惡性腫瘤，好發于東南亞以及我國的華南地區［1］。由于鼻咽癌細胞對于射線非常敏感，放療通常作為鼻咽癌的首選治療方式［2］。近年來，由于放射技術的提高，鼻咽癌的放射治療手段從傳統的二維放射治療及常規的三維適形進展到調強放射治療（intensity-modulated radiation therapy， IMRT），這使鼻咽癌患者的局部控制率及總體生存率得到極大的改善［3-4］。然而，不可避免的是，放射對局部正常組織的損傷、腫瘤靶區對射線的抵抗性及鼻咽癌的復發、遠處轉移依然存在［5］。如何提高射線對腫瘤靶組織的敏感性，降低射線對正常組織的輻射損傷，減少鼻咽癌的殘留及復發仍然是臨床亟待解決的棘手問題。

雙氫青蒿素（dihydroartemisinin， DHA）是從中藥青蒿素中提取出的一種生物利用度較高的活性中藥單體。DHA除用于傳統的抗瘧疾外，相繼發現它也具有抗肝癌［6］、食道癌［7］、乳腺癌［8］、前列腺癌［9］及頭頸部鱗狀細胞癌［10］等多種惡性腫瘤的能力。隨著近幾年對DHA研究的進一步深入，發現DHA可提高某些腫瘤如淋巴瘤、宮頸癌、非小細胞肺癌和神經膠質瘤的放射敏感性［11-12］，有望成為新一代的高效低毒的靶向放療增敏劑。然而DHA對鼻咽癌是否具有放療增敏作用以及其放療增敏作用的機制目前尚未闡明。

氯通道是廣泛存在于機體細胞內最重要的一種陰離子通道，它廣泛參與腫瘤發生發展的多種細胞生物學行為，如細胞周期調控、細胞增殖與遷移、凋亡、細胞容積與胞內pH調節等［13-15］，這表明氯通道可作為治療惡性腫瘤的潛在靶點。本課題組前期研究發現鼻咽癌細胞的ClC-3氯通道蛋白的表達高于正常鼻咽上皮組織細胞［16］；DHA可誘導鼻咽癌CNE-2Z細胞ClC-3氯通道蛋白表達［17］。在此基礎上，本研究以鼻咽癌CNE-2Z細胞以及正常的鼻咽上皮細胞NP69-SV40T為實驗對象，探討DHA對鼻咽癌細胞增敏作用及其機制，以期為DHA聯合放療治療鼻咽癌的提供實驗依據。

材料和方法

1 細胞培養

人低分化鼻咽癌細胞CNE-2Z由廣東醫科大學唐慰萍教授惠贈；正常的鼻咽上皮細胞NP69-SV40T購于湖南湘雅醫學院細胞庫，本室保種于液氮罐中。上述細胞用含10%小牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基培養，生長在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱內。隔天用0.25%胰酶和0.02% EDTA進行消化傳代。

2 試劑及溶液

雙氫青蒿素購自Sigma，用DMSO溶解配成160 mmol/L的母液，于冰箱4 ℃避光保存；3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）購自Sigma，用PBS溶解并經0.22 μm的微孔濾膜過濾，避光分裝成1 mL/支保存于-20 ℃；5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid（NPPB）購自Sigma，DMSO配制成濃度為100 mmol/L儲存液，實驗時稀釋至100 μmol/L工作液濃度；抗ClC-3抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自賢至生物科技有限公司；山羊抗兔IgG購自鼎國科技有限公司；siRNA購于吉瑪基因公司。

電極內液組成（mmol/L）：70N-methyl-D-glutamine chloride （NMDG-Cl），1.2 MgCl2，10 HEPES，1 EGTA，140 D-mannitol，2 ATP。

等滲液（ISO）含（mmol/L）：70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES，140 D-mannitol。低滲液（47% Hypo） 滲透壓為160 mOsmol/L，除不含D-mannitol外，其余成分均同于等滲灌流液。配制好的液體用Osmomat 030冰點滲透壓計（Osmomat 030；Gonotec，Germany）測定滲透壓，Tris堿調pH至7.4。

3 實驗方法

3.1 MTT法檢測DHA對CNE-2Z細胞和NP69-SV40T細胞活力的抑制作用 取對數生長的上述兩株細胞經胰酶消化后接種于96孔板中，8 000個/孔，細胞過夜貼壁，分別加入0、5、10、20、40、80和160 mmol/L DHA，每組8個復孔，作用24、48及72 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 g/L），37 ℃避光孵育4 h，吸去培養液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，振蕩使孔里的紫色結晶完全溶解，酶標儀檢測490 nm波長的吸光度（A）值。計算公式：增殖抑制率（%）=（A對照組-A加藥組）/A對照組×100%。應用GraphPad Prism 9.0軟件計算10%和50%抑制濃度即IC10和IC50。后續將采用IC10進行放射增敏實驗。

3.2 平板集落形成實驗 取對數生長的CNE-2Z細胞胰酶消化后接種于6孔板中，每孔1 000個，待過夜貼壁。根據實驗進行分組，對照組、DHA+不同劑量放射組、氯通道阻斷劑NPPB（或NC siRNA）組+不同劑量放射組、DHA+NPPB（或ClC-3 siRNA）組+不同劑量放射組。各組藥物最終濃度分別為DHA 5 μmol/L、NPPB 50 μmol/L。繼續培養24 h后分別給予0、2、4、6和8 Gy的X加速直線射線照射，該部分實驗在廣東省中醫院放射科進行，由技師專業操作。放射完成后，置于37 ℃孵箱12 h后更換新鮮培養液繼續培養10 d，在孔板中看到肉眼可見的細胞集落時終止實驗，固定、Giemsa染色、計數。集落形成率=集落數目/接種細胞數×100%；存活分數（SF，%）=集落形成率處理組/集落形成率對照組×100%，利用單擊多靶模型SF=1-（1-e-Dq/D0）N，其中SF是細胞的生存分數，Dq代表準閾劑量，D0表示平均致死量，N為外推數，lnN=Dq/D0擬合曲線并得出放射增敏指數（sensitization enhancement ratio， SER）。

3.3 全細胞膜片鉗技術檢測細胞氯電流 常規消化細胞，然后取200 μL的細胞懸液滴到直徑為22 mm圓形玻片上（每片100～200 μL），孵育40 min待貼壁，玻片安放在灌流槽中，用等滲液灌流細胞5 min使其適應實驗環境。用EPC-10膜片鉗放大器（List Electronic）記錄全細胞氯電流。電流和電壓信號用CED1401（Cambridge）數字化（采樣頻率3 kHz），實驗數據用EPC（CED， Cambridge）軟件分析。采用的±40、0和±80 mV循環鉗制電壓，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s。在等滲條件下記錄3～5 min的背景氯電流，而后灌流5 μmol/L DHA溶液觀察細胞氯電流的變化，待電流平穩后，換為5 μmol/L DHA+100 μmol/L的NPPB溶液。NC siRNA和ClC-3 siRNA處理組等滲條件下記錄3～5 min的背景氯電流，而后灌流5 μmol/L DHA溶液觀察細胞氯電流的是否存在差異。

3.4 Western blot檢測蛋白表達 取對數生長的鼻咽癌CNE-2Z細胞消化后接種于6孔板中，待細胞24 h貼壁后，加入5 μmol/L的DHA溶液，分別培養3、6、12和24 h后棄去6孔板中的培養基，把孔板置于冰上，整個過程在冰上操作。收集細胞總蛋白并進行BCA蛋白定量，根據蛋白濃度計算20 μg蛋白上樣量。用10% SDS-PAGE根據分子量大小分離蛋白，結束后將目的蛋白進行切膠并轉移到PVDF膜上，牛奶封閉2 h后，加入用Ⅰ抗稀釋液配好的GAPDH抗體，以及ClC-3羊抗兔的多克隆抗體，置于4 ℃搖晃過夜；第2天，回收Ⅰ抗，然后用TBST洗滌膜3次，每次10 min，加入用TBST稀釋好的Ⅱ抗稀釋液，在室溫下孵育1 h后用TBST漂洗5～10 min，洗滌3次；最后采用ECL化學發光法進行顯影；采用圖像分析軟件ImageJ進行圖像分析。

3.5 細胞轉染實驗 轉染前一晚將CNE-2Z細胞常規消化接種于6孔板，每孔1.5×106個細胞過夜待貼壁，帶細胞密度達70%～80%時去除舊培養基，PBS洗兩次，每孔加入600 μL Opti-MEM浸潤，孵箱靜置20 min。配制轉染試劑：取10 μL GP-transfectmate與10 μL siRNA輕輕吹打混合，然后靜置20 min。然后在混合液中加入400 μL Opti-MEM中。陰性對照（negative control， NC）管操作相同?；旌暇鶆蚝蠹尤氲綄霓D染孔中，將細胞放入孵箱中培養，根據具體轉染要求在6～10 h內更換新的培養基。轉染48 h后，Western blot檢測細胞ClC-3蛋白表達。ClC-3 siRNA的正向序列為5'-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3'，反向序列為5'-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3'；NC siRNA的正向序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向序列為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

4 統計學處理

運用SPSS 25.0軟件進行分析。實驗重復3次以上，計量資料均采用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組數據間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。以P＜0.05表示差異存在統計學意義。

結 果

1 DHA呈濃度和時間依賴性抑制CNE-2Z細胞活力

用5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA作用于細胞不同時間，可觀察到鼻咽癌CNE-2Z細胞從DHA濃度5 μmol/L開始，細胞數逐漸減少，隨著DHA濃度越大其變化越明顯。然而，在正常的鼻咽上皮NP69-SV40T細胞，DHA增加到20 μmol/L左右才觀察到數量和形態的顯著改變（圖1A）。細胞存活率實驗進一步發現DHA隨著時間和濃度的增加對CNE-2Z細胞活力抑制作用也增加，DHA作用48 h時其IC50值為（39.17±4.760） μmol/L，IC10值為（5.244±1.050） μmol/L；然而，DHA作用48 h對NP69-SV40T細胞其IC50值則高達為（159.3±7.235） μmol/L（P＜0.01），IC10值為（13.02±4.831） μmol/L，見圖1B～D。將選擇與DHA細胞IC10值較近的5 μmol/L作為后續的實驗濃度。

2 DHA可促進CNE-2Z細胞對射線敏感性

通過集落形成實驗檢測單獨放射組以及DHA聯合放射組的細胞集落數，從圖2A、2B中可發現DHA聯合放射組的細胞集落數量比單獨放射組少（P＜0.05），利用單擊多靶模型SF=1-（1-e-Dq/D0）N，其中SF是細胞的生存分數，Dq代表準閾劑量，D0表示平均致死量，N為外推數，lnN=Dq/D0。經過曲線擬合，見圖2C所示，得出DHA的放療增敏比（SER）=D0放射組/D0聯合放射組，SER=1.9，提示DHA具有增加CNE-2Z對放射敏感作用。

Figure 2.The radiosensitization effect of DHA on CNE-2Z cells was detected by clone formation assay.A： optical images of CNE-2Z cells after treated with radiation and radiation plus DHA；B： the number of CNE-2Z cell colonies after radiation and DHA plus radiation；C： dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs radiation group.圖2 集落形成實驗檢測DHA對CNE-2Z細胞的放射增敏作用

3 DHA對CNE-2Z及NP69-SV40T細胞氯通道功能的影響

通過全細胞膜片鉗實驗觀察兩株細胞氯通道功能是否受到DHA的影響。研究發現，在0、±40和±80 mV的電壓鉗制下，胞外灌流等滲溶液5 min，可看到一段很小且穩定的基礎電流，更換DHA后CNE-2Z細胞的電流被激活，在±80 mV電壓鉗制下，DHA激活CNE-2Z細胞的電流密度逐漸增大至（50.94±5.616） pA/pF和（-22.98±3.485） pA/pF，如圖3A，在NP69-SV40T細胞DHA則無此作用，進一步灌流低滲刺激仍能激活電流（P＜0.01），見圖3B～C。

4 DHA可誘導CNE-2Z細胞的ClC-3氯通道蛋白表達增加

上述數據表明，DHA可以激活CNE-2Z細胞的氯電流。接下來我們檢測DHA作用不同時間點對CNE-2Z細胞ClC-3氯通道蛋白表達的影響。DHA分別作用0、3、6、12和24 h，可觀察到隨著DHA作用時間增加，CNE-2Z細胞ClC-3蛋白的表達也隨之增加，表現出時間依賴性，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4。

Figure 4.Effect of DHA on ClC-3 protein expression in CNE-2Z cells at different time points.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 h group.圖4 DHA作用不同時間對CNE-2Z細胞ClC-3蛋白表達的影響

5 氯通道阻斷劑NPPB可抑制DHA對CNE-2Z細胞的放射增敏作用

根據前面的研究結果得出DHA可激活鼻咽癌CNE-2Z氯通道，且具有放射增敏的作用。那么，DHA放射增敏作用是否有氯通道參與呢？為證明這一點，利用氯通道阻斷劑觀察其是否影響DHA放射增敏作用。結果發現，DHA+NPPB組的細胞集落數明顯多于DHA組（P＜0.05），見圖5A、B。利用單擊多靶模型曲線擬合可得出，DHA組的放射增敏比SER=1.42，DHA+NPPB組的放射增敏比則為SER=0.77，增敏比抑制率為1.84（圖5C）。這表明NPPB可顯著地抑制DHA對鼻咽癌CNE-2Z細胞的放射增敏作用。進一步全細胞膜片鉗檢測到在±80 mV電壓鉗制下，DHA激活CNE-2Z細胞的電流顯著被NPPB抑制，從（58.88±6.539） pA/pF和（-27.57±6.900） pA/pF 降 至（14.41±3.549） pA/pF 和（-8.763±5.686） pA/pF（P＜0.01，圖5D～5E）。

Figure 5.The chloride channel blocker NPPB inhibitd DHA radiation sensitization and activated chloride current.A： optical images of CNE-2Z cells after treated with radiation， radiation+DHA， radiation+NPPB and radiation+DHA+NPPB；B： the number of CNE-2Z cell colonies after treated with radiation， radiation+DHA， radiation+NPPB and radiation+DHA+NPPB；C：dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching；D： DHA could induce Cl- current in CNE-2Z cells as shown with a typical time course；E： the mean densities of the DHA-activated Cl- currents by NBBP at ±80 mV clamp voltage.Mean±SD.n=5.*P＜0.05， **P＜0.01 vs DHA group.圖5 氯通道阻斷劑NPPB抑制DHA放射增敏和激活氯電流作用

6 ClC-3 siRNA抑制DHA對CNE-2Z細胞的放射增敏作用

為證實ClC-3氯通道蛋白是否為DHA促進CNE-2Z細胞的放射增敏的氯通道分子基礎，利用siRNA干擾技術下調CNE-2Z細胞ClC-3蛋白表達，Western blot結果顯示ClC-3 siRNA處理后的細胞ClC-3的蛋白表達量明顯少于無序列干擾RNA組（P＜0.01），見圖6A。同時發現ClC-3 siRNA+DHA組的細胞集落數明顯多于NC siRNA+DHA組（P＜0.01），見圖6B。利用單擊多靶模型曲線擬合可得出，NC siRNA+DHA組的放射增敏比SER=2.01，DHA+ClC-3 siRNA組的放射增敏比SER=0.48，增敏比抑制率是4.19，見圖6C。這表明ClC-3 siRNA可抑制DHA對CNE-2Z細胞的放射增敏作用。進一步全細胞膜片鉗檢測到，NC siRNA組細胞在±80 mV電壓鉗制下，DHA激活 的 氯 電 流 分 別 為（59.38±3.807） pA/pF和（-28.87±6.405） pA/pF；然而，DHA無法激活ClC-3 siRNA組細胞的氯電流，進一步灌流低滲刺激仍能激活電流（P＜0.01），見圖6D～F。

Figure 6.ClC-3 siRNA inhibited the radiosensitizing effect of DHA on nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells.A： the representative Western blot analysis and densitometry quantitation demonstrated the interference efficiency of ClC-3 siRNA（n=3）；B： colony formation of CNE-2Z cells after treated with NC siRNA， NC siRNA+DHA， ClC-3 siRNA and ClC-3 siRNA+DHA；C： dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching；D and E： typical time course of DHAactivated Cl- currents in the cells treated with NC siRNA （D） and ClC-3 siRNA（E；Hypo： hypotonic solution）；F： the mean densities of the DHA-activated Cl- currents in the cells treated with NC siRNA and ClC-3 siRNA at ±80 mV clamp voltage.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs NC siRNA+DHA group.圖6 ClC-3 siRNA可抑制DHA對CNE-2Z細胞的放射增敏作用

討 論

鼻咽癌患者以放射治療為主，中晚期的鼻咽癌患者考慮放化療的綜合療法［5］。盡管目前的放射治療學的技術有很大的提高，但仍然存在部分患者經一段時間放射后出現正常組織輻射損傷，如口干、聽視力下降、吞咽困難、皮膚組織纖維化、張口困難、腦損傷［18］；此外乏氧細胞對輻射的抗性，從而限制腫瘤放療療效也是目前亟需解決的問題［19］。

針對輻射抗性，基礎和臨床放療研究也有很多嘗試，如加大放療的劑量、使用乏氧細胞增敏劑、放化療聯合應用等［20］，盡管多年來人們對放射增敏進行了大量的研究，然而目前安全有效的放射增敏藥物遠遠不能滿足臨床需求。因此，尋找一種高效低毒放療增敏劑是非常迫切的。在本研究中，我們通過細胞增殖實驗以及集落形成實驗選用使用可抑制鼻咽癌CNE-2Z細胞的生長繁殖，而對正常的鼻咽上皮細胞幾乎沒有抑制作用5 μmol/L的DHA，聯合X射線增強后者對CNE-2Z的敏感性，表明DHA具有對鼻咽癌細胞高效低毒的放射增敏作用。近些年來，有部分研究也證實DHA可增強宮頸癌、非小細胞肺癌和神經膠質瘤的放射敏感性，其主要的機制主要集中在以下幾方面：（1）DHA通過廢除G2周期檢驗點，阻止有絲分裂前期細胞發揮修復損傷的DNA的作用而發揮放療增敏效應［21］；（2）可通過腫瘤細胞內的Fe2+催化青蒿素類物質的過氧鍵裂解，產生大量以青蒿素碳原子為中心的氧自由基，后者誘導細胞毒作用而促進放療增敏［22］；（3）在低氧環境DHA通過增加細胞內ROS的合成及阻礙DNA的損傷修復過程促進放療效應［23］。然而DHA通過何種途徑在短時間的放射內提高射線的敏感性以及阻礙放射后癌細胞的DNA的修復過程仍然存在很大的爭議，人們對DHA的放射增敏作用的機制也并未完全清楚。

氯通道在機體的生理病理狀態下都起到非常大的作用，廣泛參與腫瘤發生發展的多種細胞生物學行為，如細胞容積調節、細胞增殖、遷移、凋亡等［24-25］。我們前期對鼻咽癌研究發現，DHA可選擇性的激活氯電流，誘導Cl-外流，引起AVD，導致［Ca2+］i積累，并激活caspase-3，最終誘導CNE-2Z細胞凋亡［17］。 然而ClC-3氯通道是否參與DHA對鼻咽癌的增敏作用還尚未報道。在本課題中，我們發現DHA可激活鼻咽癌CNE-2Z細胞的氯電流，且該電流可被氯通道阻斷劑NPPB抑制。此外，氯通道阻斷劑NPPB也可抑制DHA對鼻咽癌CNE-2Z細胞放射增敏效應，這提示氯通道參與DHA放射增敏的過程。緊接著，我們通過檢測DHA作用鼻咽癌CNE-2Z細胞3、6、12和24 h的ClC-3蛋白表達，結果發現僅在3 h的作用下，ClC-3氯通道蛋白表達增加，隨著作用時間增加，蛋白的表達量也隨之增加；此外，下調CNE-2Z細胞的ClC-3蛋白后，DHA無法激活其氯電流，并且可抑制DHA對鼻咽癌CNE-2Z細胞的放射增敏，抑制比達4.18倍。這說明ClC-3蛋白有可能是在DHA增敏過程起到關鍵作用。大量研究報道DHA可通過增加細胞的ROS合成來提高腫瘤組織的乏氧程度，進而提高改善腫瘤對射線的抵抗。有趣的是，有研究證實某些抗腫瘤藥物可誘導鼻咽癌CNE-2Z細胞的ROS增加介導ClC-3氯通道的激活達到抗腫瘤作用［26］，另外，也有研究發現鼻咽癌CNE-2Z細胞ROS含量增加，可上調ClC-3蛋白的表達介導細胞自噬產生［27］。而在本研究中是否存在ROS參與DHA介導ClC-3氯通道激活還有待進一步的探究?？傊?，ClC-3氯通道蛋白在DHA對鼻咽癌放射增敏過程作為潛在新靶點的研究有助于為臨床放療增敏劑的研發和合理使用提供新的觀點和實驗依據。