甘草酸抑制C57BL/6J小鼠耳蝸炎癥減輕順鉑誘導的耳毒性*

張鈺倩， 姜文君， 呂 昊， 盛子軒， 黃子蕓， 柴文敏， 肖 婧，李 陽， 李 麗， 曾憲思

（嘉興大學神經科學研究中心，醫學院基礎醫學部，浙江 嘉興 314000）

順鉑（cisplatin， CDDP）是一種金屬化療藥物，廣泛用于治療各種實體腫瘤［1］。但該藥具有嚴重的副作用，約80%接受CDDP治療的腫瘤患者出現永久性聽力損失［2-3］。目前臨床上尚無有效預防和治療其耳毒性的措施。有研究表明，CDDP可通過上調腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin 1β， IL-1β）等多種促炎因子，引發炎癥反應［4］，進而導致內耳細胞凋亡［5］。炎癥因子通過破壞血管紋毛細血管完整性和內淋巴離子平衡誘導聽力障礙［6］。血管紋血迷路屏障（blood-labyrinth barrier， BLB）將體循環與內淋巴液隔開，調節內耳體液平衡，調控內耳離子轉運，阻擋血液中大量物質通過屏障進入內耳，維持內耳微環境穩定［7］。有研究表明，脂多糖誘導的中耳炎因下調緊密連接蛋白表達而破壞耳蝸BLB［8］。

甘草酸（glycyrrhizic acid， GL）是一種三萜皂苷，是中藥甘草根部提取物的主要活性成分和甜味成分，具有抗炎作用，能顯著降低巨噬細胞白細胞介素類、趨化因子和TNF等十多種炎癥介質釋放［9-10］。同時，GL還可通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達來抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡，具有抗腫瘤作用［11］。GL合理長期用藥無明顯毒副作用［12］。盡管之前已經有研究顯示GL可抑制CDDP導致的小鼠腎毒性等毒性副作用［13-15］，然而，目前沒有關于GL抑制CDDP小鼠耳毒性的報道。本研究探討了GL對CDDP誘導的小鼠耳毒性的抑制作用及其分子機制，可為GL用于臨床防治CDDP化療導致的聽力損失提供參考資料。

材料和方法

1 動物

7周齡的SPF級雄性C57BL/6J小鼠共70只，體重（23±1） g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司［SCXK（浙）2019-0004］飼養1周，控制溫度20～25 ℃，控制濕度50%～70%，自由獲取水和食物。

2 主要試劑

CDDP（#153593）和DMSO（#1121E0329）購 自Sigma；GL（#A12HS191107，UV≥95%）購自上海源葉生物技術有限公司；伊文思藍（Evans blue， EB；#20221111）購自Solarbio；ZO-1抗體（GR3441013-1）、VE-cadherin抗 體（ES106BP06）、IL-1β試 劑 盒（#11618124222）和TNF-α試劑盒（#2411930331）購自Boster；TNF-α抗體（PY19810M）購自Abmart；IL-1β抗 體（#AF5103）購 自Affinity；Alexa Fluor?488（#GR3442006-1）購自Abcam。

3 主要方法

3.1 實驗分組與模型制備 將70只小鼠隨機分為對照（control）組、5% DMSO組、CDDP組、CDDP+50 mg/kg GL組和CDDP+100 mg/kg GL組，每組各14只。CDDP組腹腔注射CDDP（4 mg·kg-1·d-1）4 d［16］，control組腹腔注射等量的生理鹽水；CDDP+50 mg/kg GL組和CDDP+100 mg/kg GL組提前1 d按劑量灌胃GL，之后再連續灌胃7 d［17-18］。動物實驗按嘉興大學醫學院實驗動物倫理委員會實驗動物使用指南進行，動物實驗倫理批準號（JUMC2023-155）。

3.2 聽性腦干反應（auditory brainstem response，ABR）檢測 利用ABR聽力設備（PA-900，MADSEN）檢測不同組C57BL/6J小鼠聽力閾值及潛伏期，觀察各組小鼠聽力變化規律及特點。于隔聲屏蔽室內進行常規測試。動物腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行麻醉，記錄電極插入頭皮正中皮下，參考電極插入左耳垂下，接地電極插入鼻尖。刺激聲為4、8、16、24和32 kHz的短純音（升降時間1 ms，持續時間10 ms）。采樣頻率使用125 kHz以及16-bit數模轉換。聲音產生以及生物信號的放大及采集均由TDT系統進行。反應電位放大10萬倍（80 dB的增益），平均疊加次數200次。低通濾波的截止頻率為200 Hz。

3.3 耳蝸石蠟切片制作 ABR測試結束后，每組隨機挑選8只小鼠麻醉后斷頸脫臼處死，取出耳蝸，4% 多聚甲醛（PFA）固定24 h。PBS洗3次，10%EDTA常溫脫鈣7 d（每天更換脫鈣液）。脫鈣后，去除標本余骨，進行梯度脫水透明（70%、80%、90%、100%梯度乙醇、二甲苯溶液Ⅰ，Ⅱ各1 h）。將耳蝸于平行蝸軸方向浸蠟包埋，平行蝸軸方向連續切片（5 μm），最后65℃烤片4 h。

3.4 HE染色 上述石蠟切片脫蠟、水合，蘇木素染3～8 min，自來水洗，酸酒精分化5 s，自來水沖洗，0.6% 氨水返藍，流水沖洗。伊紅染液中染色1～3 min。脫水透明后，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，封片劑封片。顯微鏡（JEM-1230透射電子顯微鏡）鏡檢觀察血管紋形態學變化，圖像采集分析。

3.5 EB滲漏檢測 ABR測試結束后，每組剩余6只小鼠，置于專用固定器上，拉直尾巴后用酒精棉球輕輕擦拭，用微量注射器抽取2% EB從尾靜脈遠端平行進針注射。觀察到小鼠皮膚迅速變藍后，用干棉球壓迫止血。2 h后麻醉小鼠，脊椎脫臼處死后斷頭，取出耳蝸，用4% PFA灌注，直至圓窗和前庭窗無血性絮狀物沖出；顯微鏡下將血管紋從耳蝸內側壁剝離，放入含有4% PFA中4 ℃固定過夜。次日，用PBS沖洗3次，甘油封片。顯微鏡（CKX53，Olympus）掃描成像并觀察血管紋通透性變化。

3.6 免疫組化實驗 上述耳蝸石蠟切片，60℃烘箱平衡2 h，進行脫蠟、水合后用枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復。冷卻后放入3% H2O2溶液浸泡10 min，擦凈后用免疫組化筆圈住組織。滴加10% BSA于37 ℃溫箱封閉1 h，PBS洗3×5 min。Ⅰ抗（1：200）濕盒內4℃孵育過夜。37 ℃烘箱中抗原修復30 min，重復上述清洗步驟，Ⅱ抗（1：400）37 ℃孵育30 min，重復上述清洗步驟。DAB染色，蘇木素染細胞核，鹽酸酒精分化。脫水透明后封片，自然晾干后在正置顯微鏡（JEM-1230透射電子顯微鏡）下觀察耳蝸血管紋。

3.7 免疫熒光 上述耳蝸石蠟切片，60 ℃烘箱平衡2 h，進行脫蠟、復水后用枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復。冷卻后PBS洗3分鐘，滴加封閉液在濕盒中37 ℃封閉30 min。用濾紙擦去封閉液后，Ⅰ抗（1∶100）4 ℃孵育過夜。37 ℃烘箱中復溫30 min，PBS洗3×5 min。熒光Ⅱ抗（1∶200）37 ℃避光孵育2 h。避光條件下重復上述清洗步驟。用濾紙擦干后，用含DAPI的抗熒光猝滅劑進行封片，自然晾干后于顯微鏡（Olympus）下觀察。

3.8 ELISA 將每組8只小鼠的全血收集于EP管中，376 ×g離心10 min，取上清。確定本次檢測所需的已包被IL-1β或TNF-α抗體的酶標板孔數目，分別設標準孔、待測樣品孔和空白孔，用樣品稀釋液分別稀釋，蓋封板膜后37℃反應90 min。反應后吸取板內液體，每孔加入生物素抗體100 μL，蓋封板膜37℃反應60 min。洗滌液洗滌3×1 min。每孔加入ABC工作液100 μL，蓋封板膜37℃反應30 min。洗滌液洗滌5×1 min。每孔加入已37℃平衡30 min的TMB顯色液100 μL，避光反應18 min，每孔加入終止液100 μL。全波長酶標儀（BIO-RAD）測定430 nm處吸光度（A）值。

4 統計學處理

每組數據重復6次以上，所有實驗結果均以均數±標準差（mean±SD）表示。本研究利用ImageJ軟件進行圖像數據的采集，利用GraphPad Prism軟件進行多組數據單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 GL減輕CDDP小鼠的聽力損失

如圖1所示，與control組相比，CDDP組小鼠各頻率ABR波形紊亂，聽力閾值顯著增高，16 kHz 90 dB SPL下I波潛伏期延長（P＜0.05）；與CDDP相比，給予GL后小鼠各頻率ABR波形分化良好，聽力閾值顯著下降，I波潛伏期縮短，且CDDP+100 mg/kg GL組改善情況較為顯著（P＜0.01）。

Figure 1.GL reduced the hearing threshold of CDDP mice and shortened the latency of I-wave.A： ABR waveforms of mice in each group under 32 kHz TB sound field intensity.The waveform of the CDDP group is disordered， and the waveform of the CDDP+GL group is neat；B： ABR threshold statistical analysis of mice in each group under 8 k， 16 k， 24 k and 32 kHz TB；C： ABR I wave latency statistical analysis of mice in each group under 16 kHz， 90 dB SPL.Mean ± SD.n=14.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CDDP group.圖1 GL降低CDDP小鼠聽力閾值，縮短I波潛伏期

2 GL減輕CDDP小鼠耳蝸血管紋的形態損傷

利用HE染色檢測小鼠耳蝸血管紋的形態變化。與control組相比，CDDP組小鼠血管紋形態紊亂，胞質減少，空泡增多，細胞核固縮且邊界模糊；與CDDP組小鼠相比，GL組小鼠耳蝸血管紋明顯整體胞質更飽滿，空泡減少，細胞核更完整且邊界更清晰，以高劑量組作用效果更為顯著，見圖2。

Figure 2.GL improved the morphological damage of cochlear veins in the mice of the CDDP group（HE staining）.Compared with the control group， the vascular striations in the cochlea of mice in the CDDP group showed changed morphology， decreased cytoplasm， increased vacuoles， nuclear condensation and blurred boundaries.Compared with CDDP group， the vascular striations in the cochlea of mice in the CDDP+GL group showed significantly fuller cytoplasm， reduced vacuoles， more complete nuclei and clearer boundaries.Arrows indicated pyknotic nuclei and stria vascular vacuoles.圖2 GL減輕CDDP小鼠耳蝸血管紋的形態損傷

3 GL降低CDDP小鼠血管紋通透性

利用EB染色檢測小鼠血管紋通透性，結果顯示，control組和DMSO組紅色熒光主要集中于耳蝸血管紋毛細血管腔內，幾乎無紅色熒光滲漏至耳蝸血管紋毛細血管外的間隙內（圖3A、B）；CDDP組可見大量紅色熒光出現在毛細血管外的間隙內，血管內紅色熒光微弱，血管滲漏較control組顯著增加（P＜0.01），見圖3C、F；給予GL后，毛細血管外紅色熒光較CDDP組顯著減少，且CDDP+100 mg/kg GL組改善更為顯著（P＜0.01），見圖3D～F。

Figure 3.GL reduced the vascular permeability in CDDP mice.A～E： EB staining of the cochlear stria vascularis BLB of mice in control， DMSO， CDDP+50 mg/kg GL and CDDP+100 mg/kg GL group；a～e： magnified views of A～E ；F： semi-quantitative analysis of EB staining.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CDDP group.圖3 GL降低CDDP小鼠血管紋通透性

4 GL逆轉CDDP小鼠耳蝸血管紋黏附連接蛋白和緊密連接蛋白的表達

利用免疫組化檢測小鼠耳蝸血管紋黏附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白ZO-1的表達。與control組相比，CDDP組小鼠耳蝸血管紋上VE-cadherin和ZO-1表達顯著降低（P＜0.01）；與CDDP組相比，CDDP+50 mg/kg GL組小鼠耳蝸血管紋上VE-cadherin和ZO-1表達增加（P＜0.01），而CDDP+100 mg/kg GL組VE-cadherin和ZO-1表達增加更為顯著（P＜0.01），見圖4。

Figure 4.GL reversed the expression of VE-cadherin and ZO-1 in cochlear vascular veins of CDDP Mice.A： the expression of VEcadherin in the cochlear stria vascularis of mice in control， DMSO， CDDP+50 mg/kg GL， and CDDP+100 mg/kg GL group；B： the expression of ZO-1 in the cochlear stria vascularis of mice in control， DMSO， CDDP+50 mg/kg GL， and CDDP+100 mg/kg GL group；C： semi-quantitative analysis of VE-cadherin expression；D： semi-quantitative analysis of ZO-1 expression.The expression of ZO-1 and VE-cadherin in cochlear vascular veins of mice in the CDDP group decreased.After intervention of GL， the expression of ZO-1 and VE-cadherin increased.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CDDP group.圖4 GL逆轉CDDP小鼠耳蝸血管紋VE-cadherin和ZO-1的表達

5 GL抑制CDDP誘導的IL-1β和TNF-α表達

利用ELISA檢測小鼠血清中IL-1β與TNF-α的表達。與control組相比，CDDP組的血清中IL-1β和TNF-α的表達顯著升高（P＜0.01）；與CDDP組相比，CDDP+50 mg/kg GL組IL-1β和TNF-α的表達均顯著降低（P＜0.01），而CDDP+100 mg/kg GL組IL-1β和TNF-α表達降低更為顯著（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.GL inhibited the levels of IL-1β（A） and TNF-α （B） in the serum of CDDP mice.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CDDP group.圖5 GL抑制CDDP小鼠血清中IL-1β和TNF-α的表達水平

利用免疫熒光檢測小鼠耳蝸血管紋IL-1β與TNF-α的表達。與control組相比，CDDP組IL-1β與TNF-α熒光強度顯著升高（P＜0.01）；與CDDP組相比，給予GL干預后，IL-1β與TNF-α熒光強度均顯著降低（P＜0.01），見圖6。

Figure 6.GL inhibited the expression levels of IL-1β and TNF-α in the cochlea of CDDP mice.A： the immunofluorescence staining of IL-1β in the cochlear stria vascularis of mice in control， DMSO， CDDP+50 mg/kg GL， and CDDP+100 mg/kg GL group；B： the immunofluorescence staining of TNF-α in the cochlear stria vascularis of mice in control， DMSO， CDDP+50 mg/kg GL and CDDP+100 mg/kg GL group；C： semi-quantitative analysis of IL-1β；D： semi-quantitative analysis of TNF-α.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CDDP group.圖6 GL抑制CDDP小鼠耳蝸血管紋IL-1β和TNF-α的表達水平

討 論

耳毒性是CDDP治療腫瘤的主要副作用之一，CDDP可以通過對耳蝸毛細胞、螺旋神經節和血管紋造成不可逆性的損傷而引發聽力損失［19-20］。有學說提出抗氧化劑、自由基清除劑可緩解CDDP耳毒性，如硫代硫酸鈉、維生素E等［21］。然而，生理條件下細胞內氧化與抗氧化水平處于一種動態平衡狀態，一旦失衡，必然引起細胞損害［22］，包括維生素E在內的某些抗氧化物質甚至增加腫瘤死亡率［23］。Gentilin等［5］研究表明炎癥可能是CDDP導致聽力損失的第一個病理性變化。GL具有強大的抗炎作用，能顯著降低CDDP導致的肝腎損傷。但其對于CDDP耳毒性是否具有保護作用仍未可知。ABR是一種經聲音刺激后出現的瞬態反應，具有可重復性、客觀性、穩定性，常用于檢測聽力［24］。本研究通過ABR測試顯示，連續4 d注射CDDP干預后C57BL/6J小鼠ABR波形紊亂，聽力閾值明顯提高，16 kHz 90 dB SPL下I波潛伏期延長，提示CDDP導致了小鼠聽力損失。這與在不同的CDDP耳毒性動物模型中得到的結果一致［25-26］。而GL干預后，小鼠的ABR波形分化良好，聽力閾值顯著下降，I波潛伏期縮短，提示GL減輕了CDDP所致的聽力損失。這些結果表明本研究成功建立了CDDP耳毒性模型，且GL對CDDP導致的小鼠耳毒性表現出治療作用。本研究是首次關于GL抑制CDDP耳毒性的報道。

血管紋和耳蝸血管結構對內耳聽覺功能至關重要［27］。Dubno等［28］研究顯示血管紋萎縮引起的內淋巴液電位下降是人類高頻聽力下降的主要原因。HE染色結果顯示，CDDP破壞了耳蝸血管紋形態結構，導致胞質減少、空泡增多，細胞核固縮且邊界模糊；而GL干預使小鼠耳蝸血管紋整體胞質更飽滿，空泡顯著減少，細胞核完整且邊界更清晰，表明GL抑制了CDDP引起的耳蝸血管紋損傷。內耳是一個非常穩定的自體調節系統，通過BLB主動或被動轉運離子、液體和營養物來維持其平衡狀態［29-30］。血管紋中BLB通透性與聽覺密切相關［31］。EB染色顯示CDDP組微血管內紅色熒光微弱，EB大量滲出，提示BLB通透性增加。CDDP+50 mg/kg GL組微血管外有少量紅色熒光，EB少量滲出，CDDP+100 mg/kg GL組微血管外間隙內紅色熒光滲出顯著減少，EB微量滲出。提示GL呈劑量依賴性地降低了CDDP小鼠耳蝸血管紋BLB通透性。血管紋BLB通透性與內皮細胞間緊密連接蛋白和黏附連接蛋白有關，而ZO-1和VE-cadherin是內皮細胞上兩個重要的連接蛋白［32-33］。有研究表明，ZO-1和VE-cadherin表達下調可增加BLB的通透性［34］。而GL可通過上調occludin蛋白的表達保護血腦屏障的通透性［35］。本研究免疫組化結果顯示，CDDP組小鼠耳蝸血管紋上VE-cadherin和ZO-1表達降低，而GL給藥顯著逆轉了CDDP小鼠耳蝸血管紋VE-cadherin和ZO-1表達，表明GL通過上調CDDP小鼠血管紋內皮細胞間黏附連接蛋白和緊密連接蛋白的表達，從而降低了BLB的通透性。

CDDP耳毒性機制與炎癥有關［36］。許多研究表明炎癥反應會對耳蝸組織造成損害，從而導致耳蝸退化和永久性的聽力損失［37-39］。IL-1β和TNF-α是主要的促炎癥細胞因子，由激活的巨噬細胞分泌，是炎癥反應的重要標志［40］。一方面，CDDP可誘導巨噬細胞迅速釋放炎癥因子啟動炎癥反應［41］；另一方面，CDDP可通過激活MAPK信號通路，引起耳蝸中NFκB的活化，上調IL-1β和TNF-α表達［4，42］。我們的ELISA檢測結果顯示，CDDP組小鼠血清中IL-1β和TNF-α表達水平顯著升高，表明CDDP誘導了炎癥反應產生。GL干預后CDDP小鼠血清中IL-1β和TNFα表達水平顯著降低，表明GL抑制了IL-1β和TNF-α的表達。進一步檢測了小鼠耳蝸血管紋內TNF-α和IL-1β的表達水平。結果顯示CDDP組小鼠耳蝸血管紋上IL-1β和TNF-α的表達水平顯著升高，而GL干預后IL-1β和TNF-α表達水平顯著降低，表明GL顯著抑制了CDDP小鼠耳蝸血管紋中的炎癥反應。有研究表明炎性反應可破壞血管紋和BLB的通透性［43］。因此，GL可能通過抑制CDDP誘導的炎癥反應降低了BLB的通透性。

綜上所述，本研究報道了GL對CDDP誘導的C57BL/6小鼠的耳毒性的抑制作用。GL可能通過抑制CDDP引起的炎癥反應，降低小鼠耳蝸血管紋BLB的通透性，從而減輕CDDP耳毒性引起的小鼠聽力損失。