天麻素通過CCR5/JAK1/STAT1信號通路抑制缺血缺氧新生小鼠小膠質細胞介導的炎癥反應*

石金沙， 石浩龍， 左涵珺， 郭 濤， 張幸霖， 張皓南， 李經輝， 李娟娟△

（1昆明醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，云南 昆明 650500；2昆明醫科大學第一附屬醫院神經外二科，云南 昆明 650032）

缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage， HIBD）是由圍產期窒息和缺氧缺血引起的一種新生兒腦損傷，是新生兒常見且嚴重的神經系統疾病，存活的嬰兒通常伴有腦癱、智力低下和其他后遺癥［1］。近年來，HIBD的治療研究主要有低溫［2］、神經保護劑［3］和干細胞治療［4］等，但效果并不可觀。因此，深入研究HIBD的發病機制及其治療策略具有重要臨床意義。已有研究證明，神經炎癥反應是新生兒HIBD的關鍵發病機制，HIBD后小膠質細胞被激活并產生明顯的炎癥反應［5］，且釋放趨化因子和促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）等促進神經炎癥［6］。因此，抑制小膠質細胞釋放炎癥介質可能是治療HIBD的有效策略。

天麻是一種天然的中草藥，其主要生物活性成分天麻素（gastrodin， GAS）具有清除活性氧和減少脂質過氧化的作用，且毒性低，在阿爾茨海默病、帕金森病和腦缺血等不同神經系統疾病中均可發揮神經保護作用［7-8］，其作用機制包括調節神經遞質、抗凋亡、抗氧化、抗炎、抑制小膠質細胞激活等［9］。

C-C趨化因子受體5（C-C chemokine receptor 5，CCR5）是CC家族配體CCL3、CCL4和CCL5的受體，屬于七種跨膜G蛋白偶聯受體的超家族［10］，在小膠質細胞的激活和遷移中起重要作用。趨化因子CCL4可以調節小膠質細胞向中樞神經系統損傷部位的快速遷移，并放大神經炎癥［11］。CCL4對血腦屏障連接蛋白和功能有很強的影響，其激活CCR5能夠促進中樞神經系統血管通透性和神經炎癥［12］。因此，阻斷CCR5可能是抑制小膠質細胞釋放促炎細胞因子引起的神經炎癥的治療選擇之一。

Janus激酶（Janus kinase， JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription， STAT）信號通路是多種細胞因子的信號轉導途徑，其作用主要是參與細胞的增值、分化、凋亡以及免疫調節等［13］。有研究發現，在關節炎大鼠模型中，JAK1、JAK2和STAT1的磷酸化與CCR5相關聯［14］。另有報道，抑制JAK1/STAT1通路可減輕小膠質細胞激活和神經炎癥，改善缺血性腦損傷［15］。本研究擬通過體內外實驗探討天麻素是否靶向CCR5通過JAK1/STAT1信號抑制缺血缺氧性腦損傷后小膠質細胞的炎癥反應，為天麻素在新生兒HIBD中的治療作用提供新的實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級新生10 d的C57BL/6J小鼠48只，由河南斯克貝斯生物科技股份有限公司提供［許可證號：SCXK（豫）2020-0005］。室溫維持在22 ℃，每日光照時間12 h，新生小鼠均由母鼠喂養，予以清潔飲食飲水。

1.2 試劑與儀器 吸入用七氟烷購自Baxter Healthcare Corporation；CCK-8試劑盒購自中國白鯊科技有限公司；GAS購自昆明制藥廠；CCR5特異性拮抗劑Maraviroc（MVC）購自APExBIO；Trizol reagent購自于Invitrogen；RT-qPCR引物購自上海生工生物工程有限公司；反轉錄試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa；抗β-actin、CCR5和IL-1β抗體均購自Origeng；抗p-JAK1和p-STAT1抗體均購自Affinity；抗TNF-α抗體購自Millipore；山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均購自武漢三鷹生物技術有限公司。細胞培養箱和MULTISKAN FC型酶標儀均購自Thermo Fisher Scientific；電泳儀、轉膜儀、化學發光成像儀和PCR儀均購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 實驗動物分組、模型復制及給藥 將新生10 d的C57BL/6J小鼠分為假手術（sham）組16只、HIBD組16只和HIBD+GAS組16只。七氟烷吸入麻醉，分離左側頸總動脈并永久結扎（sham組僅分離不結扎），術后恢復1 h后放置于含有8% O2和92% N2的缺氧箱中，溫度維持在（28～30） ℃，缺氧40 min以建立HIBD模型。HIBD+GAS組分別于術前1 h、缺氧后2 h和缺氧后12 h腹腔注射GAS 100 mg/kg。HIBD組動物死亡率為14%，HIBD+GAS組動物死亡率為10%。分別在缺血缺氧1 d及3 d后用七氟烷吸入麻醉取腦，用眼科鑷取出缺血側胼胝體組織。分別用于RT-qPCR實驗以及Western blot實驗。

2.2 細胞培養及分組 BV-2小膠質細胞（新加坡國立大學林榮安教授惠贈）培養于含10%胎牛血清的高糖培養基中，在37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation OGD）模型制備是將BV-2細胞放置在無血清、無糖培養基，37 ℃含5% CO2、95% N2的缺氧小室中培養2 h。將細胞分為4組：對照（control，Con）組、OGD組、OGD+GAS組和GAS組。根據前期研究成果［15］，藥物使用濃度為0.34 mmol/L，進行OGD模型制備之前，GAS預處理1 h。用CCR5拮抗劑MVC預處理小膠質細胞，將其分為5組：Con組、MVC組、OGD組和OGD+MVC組和OGD+MVC+GAS組。MVC（10 μmol/L）預處理1 h后再進行其他處理。在此之后，提取蛋白用于Western blot實驗。

2.3 RT-qPCR實驗 采用Trizol法提取各組小鼠胼胝體總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行real-time PCR，檢測CCL4和CCR5的mRNA表達水平。數據用2-ΔΔCt公式計算mRNA的相對水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequences for RT-qPCR

2.4 CCK-8實驗 BV-2細胞以密度為每孔5 000個接種于96孔板中，MVC濃度分別為0、2.5、5、10、20、40和80 μmol/L預處理1 h后，每孔換成200 μL新鮮培養基并且加入20 μL的CCK-8試劑，置于培養箱中孵育3 h，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度（A）值。細胞活力（%）=（A加藥-A空白）/（A0μmol/L-A空白）×100%。

2.5 Western blot實驗 將收集的細胞及組織樣本中加入裂解緩沖液混合物（含1× RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），4 ℃條件下放置10 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清，根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣電泳，轉膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃過夜，TBST洗3次，每次15 min，對應的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min，在膜上滴加ECL化學發光液，用化學發光成像儀檢測條帶，ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2.6 免疫熒光雙標染色 BV-2細胞以密度為每孔1×105個接種于24孔板中，使用2.2所述方法進行分組及藥物干預后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，滴加PBS清洗 5 min、3 次，山羊血清室溫封閉1 h。加入Ⅰ抗（CCR5，p-JAK1， p-STAT1）在4 ℃下孵育過夜。次日，PBS清洗3次，分別加入 Cy3 標記的山羊抗兔 IgG（1∶200） 和 FITC 標記的Lectin（1∶200）混合液室溫孵育1 h，PBS清洗3次，用含有 DAPI 的抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下拍照。

3 統計學處理

用GraphPad Prism 7.0軟件對實驗結果進行單因素方差分析（one-way ANOVA），計量數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 GAS抑制HIBD新生小鼠胼胝體CCL4 和CCR5 mRNA的表達

RT-qPCR結果顯示，與sham組相比，HIBD后1 d和3 d組缺血側胼胝體區CCL4和CCR5 mRNA的表達水平顯著升高，而GAS干預后明顯降低（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CCL4 （A） and CCR5 （B） in the corpus callosum of mice was detected by RT-qPCR at 1 d and 3 d after HIBD and GAS treatment.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs HIBD group.圖1 RT-qPCR檢測CCL4 和CCR5 mRNA的表達情況

2 GAS抑制HIBD新生小鼠胼胝體CCR5，p-JAK1及p-STAT1蛋白的表達

Western blot實驗結果顯示，與sham組相比，HIBD后1 d和3 d缺血側胼胝體區CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平均顯著升高，而GAS干預后明顯降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The protein expression of CCR5， p-JAK1 and p-STAT1 in the corpus callosum of mice was detected by Western blot.A： 1 d after HIBD and GAS treatment；B： 3 d after HIBD and GAS treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs HIBD group.圖2 Western blot檢測CCR5、p-JAK1和p-STAT1的蛋白表達情況

3 GAS抑制OGD后BV-2小膠質細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白的表達

Western blot實驗結果顯示，與Con組相比，OGD組激活的BV-2細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平顯著升高，而GAS干預后明顯降低（P＜0.05），GAS組與Con組相比無明顯差異，見圖3。

Figure 3.The protein expression levels of CCR5， p-JAK1 and p-STAT1 in the BV-2 microglia after OGD and GAS treatment were detected by Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs OGD group.圖3 Western blot檢測OGD及GAS干預后BV-2細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平

免疫熒光雙標染色顯示，Con組CCR5、p-JAK1和p-STAT1免疫熒光強度（紅色）均較弱，OGD處理后激活的BV-2細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1免疫熒光強度顯著增高，而GAS干預后免疫熒光強度明顯降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.The protein expression levels of CCR5 （A）， p-JAK1 （B） and p-STAT1 （C） in the BV-2 microglia after OGD and GAS treatment were detected by immunofluorescence staining.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs OGD group.圖4 免疫熒光染色檢測OGD及GAS干預后BV-2細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平

4 MVC對BV-2小膠質細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示，MVC在0～80 μmol/L范圍內不會引起BV-2小膠質細胞死亡，見圖5A。

Figure 5.Effect of MVC on BV-2 microglia viability （A）， and effects of OGD， MVC and GAS treatments on the protein levels of p-JAK1， p-STAT1， TNF-α and IL-1β in the BV-2 microglia （B）.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OGD group.圖5 MVC對BV-2小膠質細胞活力的影響，以及OGD、MVC和GAS處理對BV-2小膠質細胞中p-JAK1、p-STAT1、TNF-α和IL-1β蛋白水平的影響

5 MVC抑制OGD后BV-2細胞中p-JAK1、p-STAT1、TNF-α和IL-1β的表達

Western blot實驗結果顯示，與OGD組相比，OGD+MVC組BV-2小膠質細胞中p-JAK1和p-STAT1及炎癥因子TNF-α和IL-1β蛋白水平顯著減低（P＜0.05），表明CCR5拮抗劑MVC可以抑制激活的小膠質細胞中JAK1/STAT1信號通路和炎癥因子的表達；此外，OGD+MVC組與OGD+MVC+GAS組相比無明顯差異，提示阻斷CCR5受體后天麻素將不能抑制JAK1/STAT1通路和炎癥因子的表達，見圖5B。

討 論

HIBD的確切發病機制尚未完全明確，除了缺氧和缺血引起細胞壞死和組織液化外，過度的炎癥反應可導致病情進一步惡化。研究表明，缺血缺氧會導致神經元死亡和小膠質細胞活化，引發神經炎癥，這種炎癥主要由小膠質細胞介導。小膠質細胞是感染和損傷的前哨細胞，參與中樞神經系統的先天性和適應性免疫反應；同時也是中樞神經系統的巨噬細胞，激活后能夠遷移到受損部位，增殖、吞噬細胞碎片［16］。此外，激活的小膠質細胞表達離子通道受體［17］、嘌呤能受體［18］和趨化因子受體［19］等，可調節小膠質細胞介導的炎癥級聯反應。因此抑制小膠質細胞的過度激活可能是治療HIBD的重要策略。

天麻，其主要活性成分GAS是一種酚類糖苷，GAS的含量被認為是天麻質量標準化中最重要的植物化學標志［20］。GAS可以有效去除血清、腦及其他組織中的脂質過氧化物，并提高各種抗氧化酶的活性，發揮神經保護作用。在血管性癡呆中［21］，GAS通過激活Nrf2/Keap1-GPx4信號通路抑制海馬神經元鐵死亡，減少鐵沉積，增強抗氧化能力，從而改善腦損傷。此外，在創傷性腦損傷（traumatic brain injury， TBI）中，GAS可以抑制NLRP3信號通路進而抑制焦亡。我們前期研究發現［22］，脂多糖刺激的BV-2小膠質細胞中TNF-α和IL-1β的表達急劇升高，但GAS處理后被顯著抑制。因此，我們認為天麻素可以有效抑制活化的小膠質細胞介導的炎癥反應。

趨化因子是一類在炎癥發生和發展過程中具有重要作用的低分子量細胞因子，介導細胞在損傷部位的聚集［23］。在一項創傷后腦挫傷的臨床研究中發現，趨化因子CCL4的mRNA水平明顯升高［24］。在創傷性腦損傷和中風后CCL4的受體CCR5在免疫細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元中上調［25］。張云莎等［26］發現調控CCL4-CCR5軸能減輕阿爾茲海默癥相關的神經炎癥反應。本研究結果顯示，HIBD后胼胝體區激活的小膠質細胞中CCL4 和CCR5 mRNA水平以及OGD誘導的BV-2細胞中CCR5水平均明顯上調，說明CCL4及其受體CCR5參與了HIBD的病理過程，但其具體的發生機制尚不清楚。有研究發現，在急性淋巴細胞白血病SUP-B15細胞中，CCR5激活的信號蛋白JAK1、JAK2和STAT3被CCR5拮抗劑MVC抑制，說明CCR5介導的趨化作用由JAK/STAT信號調節［27］。JAK激酶為非跨膜的酪氨酸激酶，其家族主要由JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2四個成員組成［28］。細胞質中的信號轉導及轉錄激 活 蛋 白STAT家 族 由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6七個成員組成，是JAK的下游靶點，也是免疫應答過程中最關鍵的細胞因子激活轉錄因子之一［29］。STAT家族在小膠質細胞和巨噬細胞極化中發揮不同的作用。在膠原酶誘導的腦出血小鼠中，磷酸化STAT3分子的抑制與一氧化氮合酶和環加氧酶2表達降低有關；STAT6在IL-4刺激的小膠質細胞中被激活，從而促進小膠質細胞向抗炎表型轉化。此外，JAK1/STAT1通路的過度活化在腫瘤的發生和發展中起重要作用?；罨腟TAT1抑制癌基因c-myc的表達，并通過與P53蛋白作用，參與調節細胞凋亡和細胞周期［30］。有研究報道，GAS通過下調JAK2-STAT3信號通路關鍵蛋白的表達，進一步降低下游炎癥因子IL-1β的表達，減少額葉皮質區神經元的炎癥反應，從而改善小鼠的抑郁樣行為。本研究發現，在HIBD后胼胝體區及OGD激活的BV-2小膠質細胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1表達明顯增強，而GAS干預后明顯下調，說明GAS可能通過降低CCR5、p-JAK1和p-STAT1的表達，抑制小膠質細胞的激活，從而減輕由炎癥反應介導的神經損傷。此外，為了探索CCR5與JAK1/STAT1信號通路的關系，我們發現阻斷CCR5受體可以抑制激活的BV-2小膠質細胞中p-JAK1和p-STAT1及炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，說明CCR5介導的趨化作用由JAK1/STAT1信號的磷酸化所調節。有趣的是，我們發現OGD+MVC組與OGD+MVC+GAS組相比，p-JAK1、p-STAT1、TNF-α和IL-1β的表達無明顯差異，說明GAS是通過CCR5受體來調節活化的小膠質細胞中JAK1/STAT1信號及炎癥細胞因子表達的。

綜上所述，本實驗的研究結果表明，GAS可能通過靶向CCR5抑制JAK1/STAT1信號通路及炎癥因子的表達，發揮神經保護作用。