葉酸通過JNK/p38 MAPK信號通路調節小鼠C2C12成肌細胞分化*

孫縵利， 鄧海峰， 金少舉，2， 陳旭東， 王興紅， 范文娟，2△

（1漯河醫學高等?？茖W校，河南 漯河 462000，2河南省營養與健康工程研究中心，河南 漯河 462000）

骨骼肌約占健康人體體重的40%，在機體運動、能量調節和機體穩態維持等方面發揮重要的作用［1］。骨骼肌是一種具有較強可塑性的組織，當骨骼肌因各種原因損傷后，可以通過再生過程修復受損骨骼肌。骨骼肌再生的過程主要涉及到骨骼肌成肌細胞的增殖、分化、遷移、多核肌管和肌纖維的形成等多個階段，但整個過程發生的比較緩慢［2］。因此，尋找合適的干預措施促進骨骼肌成肌細胞的分化、肌管和肌纖維的形成，從而提高骨骼肌損傷后的修復速度，助力運動機能的恢復，具有重要的臨床意義。

葉酸（folic acid， FA）是一種水溶性維生素，可以作為輔助因子為DNA的合成提供單碳供體［3］。哺乳動物體內不能合成FA，因此，通過外源性膳食獲得這種維生素是組成機體的細胞正常代謝所必需的。研究表明，飲食中缺乏FA會導致多種疾病發生，如神經管缺陷、肌肉無力和行走困難等［4］。一項針對中風的老年患者的隨機雙盲對照研究表明，與安慰劑對照組相比，口服FA和維生素B12可降低髖部骨折的發生率，同時也可以改善姿勢穩定性和肌肉功能和力量［5］，這些研究表明，FA對骨骼肌功能有積極的作用。但是FA改善肌肉功能的機制目前尚不清楚。本項工作以小鼠C2C12成肌細胞為研究對象，觀察不同濃度的FA對C2C12細胞增殖、分化的影響并試圖探討其中的作用機制，旨在為骨骼肌損傷后修復、骨骼肌功能的改善等方面的應用提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

SPF級小鼠骨骼肌C2C12成肌細胞購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；高糖DMEM培養液、馬血清和青霉素/鏈霉素混合溶液均購自Gibco；FA標準品購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠成肌細胞決定蛋白1（myoblast determination protein 1， MyoD）、成肌蛋白（myogenin， MyoG）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain， MyHC）抗體均購自Santa Cruz；兔抗鼠c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK， p-JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和磷 酸 化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK， pp38）抗體均購自GeneTex；胰蛋白酶、MTT試劑盒、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、EdU-488細胞增殖檢測試劑盒、JNK特異性抑制劑SP600125和p38特異性抑制劑SB203580均購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 主要方法

2.1 C2C12細胞培養及誘導分化 將C2C12細胞培養于含10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素混合溶液的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每2天換液1次，待細胞增殖融合達80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代或誘導分化。分化培養液為含有2%馬血清+1%青霉素/鏈霉素混合溶液的DMEM培養液，每天更換一次分化培養液，分化4 d。采用免疫熒光法檢測成肌細胞分化標志物MyHC的表達，肌分化程度用肌管中MyHC陽性細胞核數與總細胞核數的比值來量化，融合指數用有核細胞（≥5個）的細胞核數和總細胞核數的比值來表示［6］。

為了探索FA對小鼠C2C12成肌細胞增殖的影響，采用不同濃度（0、2.5、5、10和20 μmol/L）FA處理細胞。在小鼠C2C12成肌細胞分化階段，將細胞分為對照組（Ctrl組，FA 0 μmol/L）和FA組（FA組，FA 10 μmol/L），分別于分化第2天和第4天，采用免疫熒光染色和Western blot方法檢測成肌細胞分化相關蛋白MyoD、MyoG和MyHC的表達水平，并統計各組細胞肌管形成情況。另外，為了探索JNK/p38信號通路在小鼠C2C12成肌細胞分化過程中的作用，將細胞分為Ctrl組、FA組、FA+SP600125組或FA+SB203580組。FA+SP600125組和FA+SB203580組C2C12成肌細胞先接受10 μmol/L的SP600125或SB203580處理1 h，再經10 μmol/L的FA處理24 h，FA組經10 μmol/L FA處理24 h。抑制劑劑量選取參考［7］，分組處理參考［8］。

2.2 MTT法檢測細胞活力 用MTT法［9］檢測細胞活力，嚴格按照說明書進行操作。將C2C12細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養液（含5 000個細胞），同時加入相應濃度的FA，培養48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO，在酶標儀上檢測570 nm波長處吸光度（A）值。

2.3 EdU檢測細胞增殖 用EdU-488細胞增殖實驗檢測C2C12細胞的增殖情況，嚴格按照說明書進行操作。將C2C12細胞接種于6孔板中（每孔含2×105個細胞），同時加入相應濃度的FA，培養48 h后，每孔加入10 μmol/L的EdU工作液，孵育2 h后，去除培養液，4% PFA室溫固定15 min，0.3% Triton X-100室溫通透15 min， Click反應液室溫避光孵育30 min，熒光顯微鏡拍照。EdU標記指數用EdU染色陽性細胞核數和總細胞核數的比值來表示，EdU標記指數越高，說明細胞增殖能力越強［10］。

2.4 免疫熒光染色 將各組處理好的C2C12細胞用PBS清洗3次后，4% PFA室溫固定15 min，0.3%Triton X-100室溫通透15 min，然后加入Ⅰ抗（MyoD，1∶600；MyoG，1∶600；MyHC， 1∶300），4 ℃過夜孵育。PBS洗3次后，加入熒光標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，再用DAPI染核5 min。熒光顯微鏡拍照。

2.5 Western blot 將各組處理好的C2C12細胞用PBS清洗3次后，加入含PMSF的RIPA裂解液裂解10 min，32 198×g離心3～5 min，取上清，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE的電泳液，將蛋白進行電泳分離，然后將蛋白電轉至PVDF膜。封閉液室溫封閉15 min，Ⅰ抗（MyoD，1∶600；MyoG，1∶600；MyHC， 1∶300；p-JNK， 1∶1 000；JNK，1∶1 000；p-p38， 1∶1 000；p38， 1∶1 000）4 ℃過夜孵育，然后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。將膜置于凝膠成像儀中，加入ECL發光劑，曝光顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白水平。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件和GraphPad Prism 6.0繪圖軟件進行處理。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），事后兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的FA對小鼠C2C12成肌細胞活力的影響

小鼠C2C12成肌細胞與不同濃度（0、2.5、5、10和20 μmol/L）的FA共孵育48 h后，與0 μmol/L FA組相比，其余各組的細胞數量明顯增多，見圖1A。MTT結果顯示，2.5、5、10和20 μmol/L FA可顯著提高細胞活力（P＜0.05），且10 μmol/L濃度的FA對細胞活力的影響最為顯著（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.Effect of FA on C2C12 cell viability.A： C2C12 cell growth obseved by phase-contrast microsopy （scale bar=50 μm）；B：the viability of C2C12 cells increased following treatment with various concentrations of FA for 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖1 FA對小鼠C2C12成肌細胞活力的影響

2 不同濃度的FA對小鼠C2C12成肌細胞增殖的影響

EdU染色陽性細胞為紅色，藍色代表細胞核。EdU檢測結果顯示，與0 μmol/L FA組相比，其余各組細胞EdU陽性細胞率均顯著增加（P＜0.05），且以10 μmol/L FA組EdU陽性細胞率增加最為顯著（P＜0.01），見圖2。因此后續實驗中選擇使用10 μmol/L作為FA的濃度。

Figure 2.Effect of FA on the proliferation of C2C12 cells.EdU staining of C2C12 cells after treatment with various concentrations of FA for 48 h （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖2 FA對小鼠C2C12成肌細胞增殖的影響

3 FA對小鼠C2C12成肌細胞分化的影響

MyoD陽性細胞和MyoG陽性細胞為綠色，藍色代表細胞核。免疫熒光結果顯示，在分化的第2天和第4天，與Ctrl組相比，FA組MyoD和MyoG的陽性細胞數均顯著增加（P＜0.05），見圖3A和圖4A。Western blot檢測各組細胞MyoD和MyoG蛋白表達量，結果與上述免疫熒光結果一致，見圖3B和圖4B。

Figure 3.Effect of FA on MyoD expression in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyoD in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）；B： Western blot analysis of MyoD expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （day 2）；#P＜0.05 vs Ctrl group（day 4）.圖3 FA對小鼠C2C12成肌細胞MyoD表達的影響

Figure 4.Effect of FA on MyoG expression in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyoG in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）；B： Western blot analysis of MyoG expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （Day 2）；#P＜0.05 vs Ctrl group（Day 4）.圖4 FA對小鼠C2C12成肌細胞MyoG表達的影響

4 FA對小鼠C2C12成肌細胞肌管形成的影響

MyHC陽性細胞為綠色，藍色代表細胞核。免疫熒光結果顯示，在分化的第2天和第4天，與Ctrl組相比，FA組MyHC陽性細胞核數與總細胞核數的比值均顯著增加（P＜0.05），融合指數顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見圖5A、B。Western blot結果與免疫熒光結果一致，見圖5C。

Figure 5.Effect of FA on myotube formation in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyHC in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）， and the ratio of MyHC+ nuclei/total nuclei；B： quantitative results of fusion index；C： Western blot analysis of MyHC expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L）for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （day 2）；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs Ctrl group （day 4）.圖5 FA對小鼠C2C12成肌細胞肌管形成的影響

5 FA對小鼠C2C12成肌細胞JNK/p38信號通路的影響

Western blot結果顯示，與0 h組相比，FA處理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38/p38比值均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），且隨著處理時間的延長，p-JNK/JNK和p-p38/p38比值呈現逐漸增加的趨勢，見圖6。

6 JNK/p38信號通路在FA促進小鼠C2C12成肌細胞分化過程中的作用

MTT結果顯示，FA組細胞活力較Ctrl組顯著提高（P＜0.01），SP600125組和SB203580組細胞活力與Ctrl組相比差異均無統計學顯著性（P＞0.05）；與FA組相比，FA+SP600125組和FA+SB203580組細胞活力顯著降低（P＜0.01），見圖7A。Western blot結果顯示，與Ctrl組相比，FA組p-JNK/JNK比值和MyHC表達均顯著增加（P＜0.01）；與FA組相比，FA+SP600125組p-JNK/JNK比值和MyHC表達均顯著降低（P＜0.05），見圖7B。另外，與Ctrl組相比，FA組p-p38/p38比值和MyHC表達均顯著增加（P＜0.01）；與FA組相比，FA+SB203580組p-p38/p38比值和MyHC表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖7C。

Figure 7.The role of FA in promoting the differentiation of C2C12 cells through involvement in the JNK/p38 signaling pathway.The C2C12 cells were treated with SP600125 （10 μmol/L；a specific inhibitor of JNK） or SB203580 （10 μmol/L；a specific inhibitor of p38） alone or in combination with FA （10 μmol/L） for 24 h.A： the viability of C2C12 cells was assessed by MTT assay；B： the levels of p-JNK， JNK and MyHC in C2C12 cells were detected by Western blot；C： the levels of p-p38，p38 and MyHC in C2C12 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs FA group.圖7 JNK/p38信號通路參與FA促進小鼠C2C12成肌細胞分化的過程

討 論

骨骼肌細胞的分化是一個高度組織化的過程，涉及細胞周期的退出、肌管特異性基因的表達和細胞融合形成多核肌管等［11-12］，受生肌調節因子家族和肌細胞增強因子-2家族的控制［13］。其中MyoD和MyoG對于成肌細胞的分化是必不可少的，MyoD主要在肌分化的早期起作用，決定肌原性的命運，如果MyoD缺失或者表達降低，成肌細胞的分化就會停止［14］。MyoG主要在肌分化的的后期起作用，以控制成肌細胞的分化、肌管融合和肌纖維的形成［15］。因此，對MyoD和MyoG檢測可直接反映成肌細胞的分化情況。在本研究中，FA顯著提高了C2C12成肌細胞MyoD和MyoG的表達，表明FA可以促進C2C12成肌細胞的分化。本研究結果還顯示，與分化第2天相比，分化第4天MyoD的表達顯著降低，而MyoG的表達顯著增加，進一步明確了MyoD和MyoG在分化不同階段的作用。

成肌分化至成熟的肌纖維的一個關鍵步驟是成肌細胞融合產生多核肌管［16］。一般來說，MyHC+的細胞代表分化的成肌細胞，融合指數代表融合的多核肌管。對于上述指標的檢測可直接反映成肌細胞的肌管形成情況。在本研究中，FA顯著提高了My-HC+細胞核占總細胞核的比值和融合指數，表明FA可以促進C2C12成肌細胞肌管的形成。

JNK和p38是MAPK信號通路家族的主要成員，在骨骼肌發育過程中發揮重要的調控作用［17］。關于JNK在調節骨骼肌分化中的作用研究一直存在爭議。有研究報道JNK的活性在C2C12成肌細胞分化過程中被激活［18］，也有研究表明JNK的激活參與了表皮生長因子對骨形態發生蛋白誘導的成骨細胞分化的抑制作用［19］。炎癥條件下，p38被激活并參與骨骼肌蛋白降解的最終過程［20］。而在基礎或健康條件下，p38也被證明在骨骼肌細胞分化中具有積極作用［20］。本研究結果顯示，FA處理后，C2C12成肌細胞的JNK和p38的磷酸化水平以時間依賴方式升高，表明FA可以激活JNK/p38信號通路。

為了進一步驗證JNK/p38信號通路在C2C12成肌細胞分化過程中的作用，本研究在細胞分化階段，加入JNK抑制劑SP600125或p38抑制劑SB203580。結果顯示SP600125和SB203580單獨使用時對細胞活力基本沒有影響，而各自與FA聯合使用時則會降低細胞活力。另外，FA對JNK和p38的激活以及對C2C12成肌細胞的促分化作用可以被SP600125或SB203580抑制。提示FA可以通過激活JNK/p38信號通路促進C2C12成肌細胞分化。

綜上所述，本研究的結果初步表明FA可以通過激活JNK/p38信號通路促進C2C12成肌細胞分化，這為了解FA改善骨骼肌功能的作用機制提供了實驗參考。但FA怎樣作用于JNK/p38信號通路以及是否影響分化相關的其他信號通路，這些具體的分子機制仍不清楚，尚待深入研究。