糖尿病肝臟病變中GLUTs和SIRTs表達水平的研究*

郭 玉， 白文帆， 田亞平， 羅飛揚， 賈淑元， 羅明秀， 姚 青

（寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004）

糖尿病肝損傷（diabetic liver injury， DLI）是糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）引起的肝臟慢性并發癥。由于肝臟高代償的特性，所以在DM早期患者肝損傷的癥狀并不明顯［1］，但是隨著病情的發展，肝內逐漸出現炎性水腫、脂肪組織浸潤、脂肪性肝炎、肝纖維化，直至發展成為肝硬化甚至肝癌［2］。因此，作為DM的慢性并發癥之一，DLI越來越受到關注。

葡萄糖轉運體（glucose transporters， GLUTs）是由SLC2基因編碼的一類調控葡萄糖進入細胞內的跨膜蛋白家族，專職負責組織器官的能量供給和機體葡萄糖水平穩態調節功能。GLUTs家族中已鑒定出14種蛋白質，其中GLUT1在人體所有細胞/組織中普遍表達，是葡萄糖轉運的主要載體蛋白［3］；GLUT2主要存在于胰島B細胞和肝細胞中，將葡萄糖進行轉運以維持血糖水平的穩定［4］；GLUT4主要存在于骨骼肌和脂肪細胞中，在胰島素信號的刺激下，通過易位作用在細胞膜上調控葡萄糖進入細胞［5］。

沉默信息調節因子（silent information regulators，SIRTs）是一類具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）依賴性脫乙酰酶活性的蛋白質。哺乳動物有7種SIRT同系物，分別為SIRT1～SIRT7［6］。SIRTs能夠調節多種細胞過程，包括細胞存活、衰老和代謝穩態［7］。本實驗通過檢測GLUTs和SIRTs在DM大鼠肝臟和高糖培養下的人肝細胞系LO2中的表達情況，進一步了解DLI的發生機制，為其治療靶點提供新的思路。

材料和方法

1 實驗動物

選取20只8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體質量（200±20） g，購自寧夏醫科大學動物實驗中心（實驗動物合格證號為No.10752309202200094；動物倫理批準號為No.IACUC-NYLAC-2021-115）。實驗在寧夏醫科大學實驗動物中心SPF級實驗室進行，室內溫度20～22 ℃，相對濕度40%～70%。

大鼠適應性飼養5～7 d后禁食12 h，將鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）溶解于檸檬酸緩沖液［A液：稱取2.10 g檸檬酸（分子量210.14）加入純水100 mL充分溶解；B液：稱取2.94 g檸檬酸三鈉（分子量294.10）加入純水100 mL充分溶解；A液和B液按1∶1混合，pH 4.2～4.5）中，按60 mg/kg劑量給予大鼠一次性腹腔注射以誘導DM，正常對照（normal control，NC）組大鼠注射等體積檸檬酸緩沖液。常規喂養1周后禁食12 h，尾部采血檢測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG），以FBG≥16.7 mmol/L設置為DM組，其余為NC組。以后每隔2周檢測大鼠FBG并稱量體質量。本實驗通過寧夏醫科大學醫學實驗動物倫理委員會審查。

2 細胞培養

本實驗采用人肝細胞系LO2進行實驗。使用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養基，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后觀察細胞生長狀態，并更換一次新鮮的培養基，待細胞長至80%用胰酶消化（0.05%胰酶+0.02% EDTA溶于500 mL DHanks液），按1∶4比例傳代。

3 主要儀器和材料

STZ、無水乙醇、二甲苯、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、清潔蓋玻片、中性樹膠和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；油紅O染色試劑盒購自Sigma-Aldrich；過碘酸-席夫（periodic acid-Schiff， PAS）染液購自武漢塞維爾蛋白含量檢測試劑盒；全蛋白提取試劑盒和化學發光液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和預染蛋白Maker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；檸檬酸和檸檬酸三鈉購自天津市大茂化學試劑廠；SIRT1和SIRT6抗體購自Cell Signaling Technology；β-actin、SIRT2、SIRT3和SIRT7抗體購自Affinity；SIRT4、STRT5和GLUT1/4抗體購自Proteinch。臺式高速冷凍型微量離心機購自DragonLab；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad；化學發光成像儀購自Thermo Scientific；黏附載玻片、YD-14P1.5智能環保型雙吊籃生物組織脫水機、YD-6LA生物組織冷凍包埋機、RWDS700輪轉式切片機、YD-700全自動生物組織染色機和Minux FS800冰凍切片機購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；ML31生物顯微鏡購自廣州市明美科技有限公司；SCIENCE數字切片掃描系統購自山東志盈醫學科技有限公司。

4 主要方法

4.1 肝臟指數的測定 1%戊巴比妥鈉注射液（50 mg/kg）右下腹腔注射麻醉大鼠，腹主靜脈取血致大鼠死亡，用生理鹽水沖洗血跡，采集肝臟并進行稱重，計算肝臟指數。肝臟指數=肝臟質量/體質量，其值越高表示肝臟損傷越嚴重。

4.2 血清生化指標檢測 將大鼠血液離心后，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯（triglyceride， TG）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）、FBG、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyltransferase， γ-GT）、膽固醇（cholesterol， CHO）、總 膽 紅 素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin， DBIL）、白蛋白（albumin， ALB）、總膽汁酸（total bile acid， TBA）等指標。

4.3 大鼠肝組織病理形態學觀察 使用4%中性多聚甲醛固定肝組織，取出后進行組織脫水、包埋、切片（4 μm），按照說明分別進行HE、PAS和油紅O染色后，在光學顯微鏡下觀察大鼠肝組織形態學變化。

4.4 不同濃度葡萄糖對細胞活力的影響 正常培養LO2細胞按5×103mL-1接種于96孔板中，培養24 h后，棄去低糖培養基，PBS洗3次后，分別以含25、50、75、100、125、150、175和200 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液培養，每組設置5個復孔，干預48 h后每空加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養2 h，采用酶標儀在450 nm波長測每孔吸光度（A）并計算不同糖濃度下細胞活力：細胞活力（%）=（A加藥-A完培）/（ANC-A完培）×100%。每組取5個復孔的平均值，實驗重復3次。

4.5 Western blot檢測大鼠肝組織和LO2細胞中GLUTs和SIRTs的表達水平 根據CCK-8實驗結果，收集含25和150 mmol/L葡萄糖的培養液干預各組細胞48 h，用顯微鏡觀察細胞形態變化并拍照記錄。將不同分組的肝組織和LO2細胞分別置于裂解液中，充分研磨，離心取上清液。通過BCA試劑盒檢測樣本蛋白濃度，將蛋白通過SDS-PAGE分離后轉印到PVDF膜上，用10%的脫脂牛奶封閉2 h后孵育Ⅰ抗（β-actin抗體，1∶5 000；SIRT1～7抗體，1∶1 000；GLUT1抗體，1∶4 000；GLUT4抗體，1∶2 000）。搖床4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗膜后孵育Ⅱ抗（1∶5 000），搖床孵育后TBST洗膜，配制ECL發光液（VA液∶VB液=1∶1），在凝膠系統成像儀上曝光，灰度值結果與β-actin蛋白表達水平相比較并進行分析。

5 統計學處理

用GraphPad Prism統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠FBG和體質量的變化

與NC組大鼠相比，DM大鼠均出現多飲、多食、多尿、體質量減輕的癥狀。STZ注射2周后，DM組大鼠FBG水平均顯著高于NC組（均P＜0.05），見圖1A；8周后DM組大鼠體質量顯著低于NC組（均P＜0.05），見圖1B。

Figure 1.Changes of fasting blood glucose （FBG；A） and body mass （B） of the rats in normal control （NC） group and diabetes mellitus （DM） group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs NC group.圖1 NC組和DM組大鼠空腹血糖和體質量的變化

2 大鼠肝臟指數變化比較

與NC組相比，DM組大鼠肝臟明顯增大，肝臟指數顯著升高（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Changes of liver size and liver index of the rats in normal control （NC） group and diabetes mellitus （DM） group.A： size of rat liver；B： liver index.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs NC group.圖2 NC組和DM組大鼠肝臟大小和肝臟指數的變化

3 大鼠血清生化指標變化比較

與NC組相比，DM組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、DBIL、TBIL、TBA、FBG、GSP、TG和CHO水平均顯著升高，ALB水平顯著降低，見圖3。

Figure 3.Changes of serum biochemical indexes of the rats in normal control （NC） group and diabetes mellitus （DM） group.A： alanine transferase （ALT）；B： aspartate aminotransferase （AST）；C： alkaline phosphatase （ALP）；D： γ-glutamyltransferase（γ-GT）；E： total bilirubin （TBIL）；F： direct bilirubin （DBIL）；G： total bile acid （TBA）；H： albumin （ALB）；I： fasting blood glucose （FBG）；J： glycated serum protein （GSP）；K： triglyceride （TG）；L： cholesterol （CHO）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖3 NC組和DM組大鼠血清生化指標的變化

4 大鼠肝組織病理變化比較

HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肝小葉輪廓清晰完整，肝索排列整齊，肝竇無擴張，肝細胞結構清晰，細胞核形態正常；模型組大鼠近中央靜脈肝血竇擴張充血，肝細胞輕度水腫，少量炎細胞散在浸潤（圖4A）。油紅O染色結果顯示，正常對照組大鼠肝小葉輪廓清晰完整，模型組大鼠肝細胞內有多量紅色脂肪小滴彌漫散在分布于細胞漿內，以中央靜脈區肝細胞內明顯（圖4B）。PAS染色（PAS陽性顯示為細胞漿內糖原著淺紫色）結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠中央靜脈區肝細胞內有多量淺紫色圓形小滴彌漫分布于細胞漿內（圖4C）。

Figure 4.Patological changes of rat liver tissues in normal control（NC） group and diabetes mellitus （DM） group.A： hematoxylineosin （HE） staining；B： oil red O staining；C： periodic acid-Schiff （PAS） staining.圖4 NC組和DM組大鼠肝組織病理變化

5 大鼠肝組織中GLUTs和SIRTs的表達情況

Western blot結果顯示，與NC組相比，DM組大鼠肝組織中的GLUT1、GLUT2和GLUT4蛋白表達水平升高，SIRT1、SIRT3、SIRT5、SIRT6和SIRT7蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Expression levels of GLUTs （A） and SIRTs （B） in liver tissues of the rats in normal control （NC） group and diabetes mellitus （DM） group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖5 各組大鼠肝組織GLUTs和SIRTs蛋白的表達水平

6 高濃度葡萄糖對肝細胞活力的影響

將LO2細胞用不同濃度的葡萄糖干預24 h后檢測細胞活力。CCK-8實驗結果顯示，與25 mmol/L葡萄糖組比較，50 mmol/L葡萄糖組細胞活力顯著升高（P＜0.01）；75 mmol/L、100 mmol/L和125 mmol/L葡萄糖組細胞活力有所下降，但與25 mmol/L葡萄糖組相比均無顯著差異（均P＞0.05）；而150 mmol/L、175 mmol/L和200 mmol/L葡萄糖組細胞活力均顯著下降（均P＜0.01），見圖6。這提示高濃度葡萄糖能夠降低LO2細胞的活力。

Figure 6.The viability of human hepatocytes （LO2 cells） after treatment with different concentrations of glucose for 48 h.A： morphological changes of LO2 cells （×40）；B： the viability of LO2 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 25 mmol/L group.圖6 不同濃度葡萄糖干預48 h后人肝細胞系LO2的活力

7 LO2細胞中GLUTs和SIRTs的表達情況

Western blot結果顯示，與25 mmol/L葡萄糖組相比，150 mmol/L葡萄糖組細胞中GLUT1、GLUT2和GLUT4蛋白表達水平升高，SIRT1、SIRT3、SIRT5、SIRT6和SIRT7蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖7。

Figure 7.Expression levels of GLUTs （A） and SIRTs （B） in LO2 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 25 mmol/L group.圖7 LO2細胞中GLUTs和SIRTs蛋白表達情況

討 論

DLI是DM的并發癥之一，也是非酒精性脂肪肝的一種類型，隨著DM病程的延長與發展，DLI會逐漸加重，繼而轉變為肝硬化，更有甚者發展為肝癌［8］。DLI的發生伴隨著肝臟病理結構的改變、肝臟內脂肪堆積、出現炎癥細胞浸潤，進而肝臟發生纖維化，最終發展為肝癌。DLI的發病機制目前尚未完全闡明，目前有炎癥反應、氧化應激、內質網應激和自噬等學說［9］。因此，探索DLI的發病機制，找尋安全有效的方法預防及治療DLI的發生具有積極的意義。

在本次的實驗研究顯示DM大鼠血糖指標顯著升高，體質量降低，DM大鼠血清中的AST、ALT、ALP、γ-GT、DBIL、TBIL和TBA均升高，ALB降低，說明DM大鼠的肝功能有一定程度的損傷。通過病理學檢測發現DM大鼠的肝臟體積變小，肝體指數顯著升高。肝組織HE染色顯示DM大鼠近中央靜脈肝血竇擴張充血，肝細胞輕度水腫，證明DM大鼠的肝臟發生病變。另外，DM大鼠FBG和血清GSP均升高，肝組織PAS染色結果顯示肝細胞著色較深，提示大鼠肝臟的損傷與糖代謝異常有關。同時，本研究發現DM大鼠血清中的TG和CHO升高，進一步對大鼠肝臟切片進行油紅O染色可見DM大鼠肝組織內有大量的甘油三酯聚集，提示大鼠肝臟的脂質代謝也發生紊亂。這些結果說明大鼠糖脂代謝紊亂造成肝臟的損害，而肝功能的下降會進一步促進體內物質代謝紊亂，從而加重對機體的損害。

GLUTs是被動膜轉運蛋白，有14種不同的類型，按照序列相似性和底物親和力可被分為3類：I類GLUTs（1～4和14）能夠促進葡萄糖和其他己糖的攝取，但不能促進果糖的攝??；II類GLUTs（5、7、9和11）是果糖轉運蛋白；III類GLUTs（6、8、10、12和13）是結構非典型成員［10］。GLUT1是已知體內分布最廣的GLUT，幾乎存在于各種組織細胞膜上，不僅參與葡萄糖跨膜轉運的正常生理過程，還與DM慢性并發癥的發生直接相關，如在糖尿病心肌病、糖尿病胃腸病變、糖尿病腎病等中發揮重要作用［11］。相關研究也發現，在空腹和DM狀態下，患者肝細胞中GLUT1表達也增加［12］。我們對DM大鼠肝組織中的GLUT1進行了檢測，與上述研究結果相一致。同時，我們通過CCK-8實驗發現在適當范圍內增加葡萄糖的濃度可以提高LO2細胞的活力，而當葡萄糖濃度達到75 mmol/L時，細胞活力開始下降，結合光鏡下細胞形態的觀察，提示當葡萄糖濃度達到150 mmol/L時，LO2細胞發生明顯的損傷。因此，我們選取150 mmol/L作為細胞高糖損傷條件。對LO2細胞高糖損傷模型檢測發現細胞中GLUT1的表達顯著高于正常糖對照組，與DM大鼠肝組織的表現一致。GLUT2是胰島β細胞和肝細胞中的葡萄糖轉運蛋白，在小腸、腎臟和中樞神經系統中也有表達。在正常條件下，GLUT2對葡萄糖的親和力相對較低，它的變化與各種激素分泌水平和細胞代謝紊亂有關［11］。當血糖升高時，葡萄糖會刺激胰島β細胞分泌GLUT2來攝取葡萄糖，將葡萄糖代謝為葡萄糖-6-磷酸，然后通過糖代謝的一系列反應生成ATP，從而增加細胞質中的ATP/ADP比例，促進胰島素的分泌［11，13］。在本次研究中，我們發現DM大鼠肝組織中GLUT2的表達明顯高于NC組，與高糖培養的LO2細胞GLUT2的表達相一致，這提示GLUT2可能與細胞內糖代謝異常有關，而這一結論與韓文祺等［14］的研究結果相一致。GLUT4主要存在于脂肪、心臟和骨骼肌等胰島素敏感組織中，介導跨膜葡萄糖轉運，促使外周葡萄糖的利用，其水平影響靶組織對葡萄糖的處置［15-16］。在正常情況下，胰腺β細胞會隨著能量底物（例如葡萄糖、脂肪酸和氨基酸）、激素和能量需求變化（例如，空腹-喂養周期、運動和壓力）的存在而分泌胰島素，以維持正常的血糖水平［17］。在本研究中，大鼠肝組織中GLUT4蛋白的表達和LO2細胞的表達符合上述研究結果。

SIRTs是依賴NAD+的脫乙酰酶，其功能包括組蛋白和非組蛋白的脫乙?；虯DP-核糖基化。該酶家族由7種亞型組成，其活性主要與DNA修復、細胞周期、代謝和衰老的調節有關［18］。SIRT1和SIRT6存在潛在治療靶點，包括癌癥、心血管疾病、呼吸系統疾病和其他疾?。?9-20］。SIRT1主要定位在細胞核中；SIRT2定位在細胞質中，但也存在于細胞周期G2至M相變的細胞核中；SIRT3～5主要定位于線粒體，并具有線粒體靶向序列；SIRT6和SIRT7是核蛋白；其中，SIRT6主要位于染色質中，SIRT7主要存在于核仁中［21］。此外，SIRT的定位和亞細胞穿梭取決于不同類型的細胞類型和細胞周期振蕩；SIRT1、SIRT3和SIRT6參與葡萄糖代謝。在飲食誘導的胰島素抵抗發展期間增加肝臟SIRT3的全身益處也已被證明；SIRT3通過抑制缺氧誘導因子1α負調節有氧糖酵解。SIRT6參與維持全身及肝臟、骨骼肌等局部組織的葡萄糖代謝穩態［22-23］。SIRT1能減輕糖尿病腎?。?4］。研究表明，胰腺β細胞中的SIRT6使FOXO1脫乙?；?，隨后增加GLUT2的表達，以維持胰腺β細胞的葡萄糖敏感能力和全身葡萄糖耐量［25-26］。同時，肝硬化患者肝臟中SIRT1和SIRT6蛋白水平降低［27］。

本研究顯示，GLUTs在DM大鼠肝組織和高糖處理的LO2細胞中均呈高表達狀態，而SIRTs中的SIRT1、SIRT3、SIRT5、SIRT6和SIRT7呈低表達狀態，說明GLUTs和SIRTs可能與DLI的發生發展有一定的相關性。而DLI引起GLUTs和SIRTs表達發生變化的相關性及其信號機制尚待進一步的研究。