黃芩、貓眼草、連翹單味中藥體外抗HIV-1病毒活性的研究*

李承乘,張清燕,劉 真,鄧博文,楊瑤瑤,沈俊嶺,李 強

(河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心,河南 鄭州 450000)

全球人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人數已超過6 000萬,約3 000萬感染者死于艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),使得目前AIDS的防治任務依然十分艱巨[1-2]。AIDS的治療主要采取兩種方案,即高效抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)和中醫藥治療。HAART療法臨床效果顯著,但有毒副作用大、耐藥率高等缺陷。中藥在傳統理論研究與應用方面有著堅實的基礎,研究[3-4]證明中藥能有效降低HIV病毒載量,減緩AIDS病情。部分中醫藥復方也具有抗病毒作用[5-8]。因此篩選出更多有效的抗HIV中藥具有重要意義。祛毒顆粒是臨床治療HIV的常用中藥復方,由黃芩、連翹、貓眼草、紅辣蓼、生甘草等組成,有解毒散結之功效,臨床效果較好,毒副反應小。方中黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,為君藥;連翹清熱解毒,散熱消癰,為臣藥;貓眼草祛痰散結,拔毒殺蟲,為佐藥。本研究從體外實驗角度探索組方中黃芩、貓眼草、連翹單味中藥的抗病毒效果,選用重組質粒PLAI(含HIV包膜蛋白基因)和JRFC(含HIV骨架基因)制備假病毒,建立抗HIV-1藥物篩選平臺,觀察黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對HIV假病毒感染MAGI-CCR5細胞系的影響,評價其抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株

293T細胞,來源于中國科學院細胞庫,批號GNHu17;DH5α大腸桿菌感受態細胞, 來源于生工生物工程(上海)股份有限公司,批號B528413;MAGI-CCR5細胞,重組質粒PLAI、JRFC,由中國科學院上海巴斯德研究所贈送。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃芩、連翹和貓眼草水煎劑由河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部制備。分別取黃芩、連翹和貓眼草各50 g,加入500 mL純水,使用加熱回流系統水煎3次,每次1 h。濃縮藥液,最終制得35 mL浸膏。取500 μL 浸膏,加入2 mL DMEM培養基,混勻后過濾備用。培養基DMEM,美國?？寺」井a品,批號SH30022.01;質粒提取試劑盒,德國Macherey-Nagel公司產品,批號740410.50;脂質體2 000轉染試劑盒,美國英杰公司產品,批號11668019;熒光素酶檢測試劑盒, 普洛麥格生物技術公司產品,批號E1501。NanoVue Plus型核酸蛋白定量測定儀,美國通用電氣公司產品;E1501型熒光素酶檢測系統,普洛麥格生物技術公司產品。

1.3 重組質粒的保存與鑒定

取制備好的大腸桿菌DH5α感受態細胞懸液100 μL,加入30 μL質?；靹?置于冰水混合物中45 min,43 ℃水浴中90 s,再轉移至冰浴中冷卻15 min;管內加800 μL無抗性LB培養基混勻,置于搖床上以振幅40 mm、轉速150 r/min、37 ℃下培養1 h;轉移感受態細胞至氨芐抗性的LB瓊脂培養基,37 ℃培養過夜;挑取轉染成功的大腸桿菌菌株大量擴增,提取質粒,進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定及熒光素酶報告基因測序;凍存轉化成功的菌落。

1.4 假病毒篩選平臺的構建

將293T細胞傳代至密度為80%左右;按照 3∶1比例加入質粒PLAI和JRFC共 8 μg,脂質體 2 000 轉染試劑 8 μL,共轉染293T細胞,置于37 ℃、體積分數50 mL /L CO2培養箱中;6 h后更換為含血清的完全培養基繼續孵育48 h;收集病毒上清液,稀釋為不同濃度梯度,感染MAGI-CCR5細胞。將空白細胞設為對照組;將空白細胞加不同濃度病毒上清液設為實驗組,設5個梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16),每個梯度4個復孔。采用熒光素酶檢測試劑,在化學發光儀上測定每孔的相對熒光單位(relative light unit, RLU)以測定假病毒活性滴度,判斷假病毒篩選平臺是否構建成功。進行半數組織培養感染劑量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)測定,選取100TCID50病毒量用于藥物抑制試驗。

1.5 檢測指標

1.5.1 對MAGI-CCR5細胞無毒性的單味中藥溶液質量分數篩選

通過中藥水煎液體外對MAGI-CCR5細胞的毒性實驗確定藥物的相對安全劑量,采用MTT法檢測單味中藥對MAGI-CCR5細胞增殖情況的影響。將MAGI-CCR5細胞接種于96孔板中,在37 ℃、體積分數50 mL /L CO2條件下培養過夜;棄上清液,重新加入完全培養基DMEM。將空白細胞設為對照組,加入100 μL完全培養基;將空白細胞加中藥設為實驗組。以制備好的中藥水煎劑為初始濃度,10倍比稀釋加入培養板中,每孔100 μL,設置6個梯度(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000),每梯度4個復孔;96孔板置于37 ℃、50 mL /L CO2條件下培養48 h;計數檢測MAGI-CCR5細胞生長狀態,篩選出對細胞無毒性的最合適質量分數。

1.5.2 單味中藥體外假病毒感染MAGI-CCR5細胞抑制實驗

將96孔板中MAGI-CCR5細胞培養基上清液棄去,設置對照組1為空白細胞,對照組2為空白細胞加病毒,實驗組為空白細胞加病毒加中藥;各組別藥物以上述毒性實驗篩選出的最合適質量分數為初始質量分數,2倍等比稀釋,設置8個稀釋梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128);除對照組1外,每孔加入50 μL病毒(100TCID50),在37 ℃、50 mL/L CO2下培養6 h后,將對照組2更換為完全培養基,將實驗組更換為不同質量分數的中藥煎液;48 h后,熒光素酶檢測試劑盒測定每孔RLU。計算藥物對假病毒的抑制率。抑制率=[1-(實驗組發光值-對照組1發光值)/(對照組2發光值-對照組1發光值)]×100%

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 假病毒篩選平臺構建結果

實驗組不同濃度梯度的相對熒光單位均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。結果表明,假病毒篩選藥物平臺構建成功。

表1 不同濃度梯度病毒上清液感染MAGI-CCR5細胞的熒光素酶值對比

2.2 3種單味中藥對MAGI-CCR5細胞的無毒質量分數篩選結果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對MAGI-CCR5細胞的毒性較小,高劑量有毒性作用,低劑量無毒作用(P<0.05),甚至部分藥物的最低劑量對細胞有促進增殖作用(P>0.05)。藥物對細胞的抑制增殖作用呈現出劑量依賴性趨勢。黃芩、貓眼草、連翹均在藥物稀釋比例為1∶100 000時對細胞的增殖不再具有抑制作用,因此選擇2.17 mg/L黃芩、3.45 mg/L貓眼草、2.50 mg/L連翹作為其抗病毒研究起始劑量。見表2。

表2 黃芩、貓眼草、連翹對MAGI-CCR5細胞的無毒質量分數篩選結果

2.3 3種單味中藥體外對假病毒感染MAGI-CCR5的抑制實驗結果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥均有體外抗HIV假病毒作用,且與質量分數呈正相關趨勢,分別黃芩2.17 mg/L、貓眼草3.45 mg/L、連翹2.50 mg/L時表現出最高抑制率,依次是41.87%、37.38%、14.12%。見表3。

表3 不同質量分數黃芩、貓眼草、連翹對HIV假病毒的抑制率對比

3 討 論

研究表明,HIV-1假病毒與活病毒在細胞內復制的很多環節相同,因此在抗HIV-1藥物的篩選、藥物抗病毒效果評價等研究中,HIV假病毒檢測系統被廣泛應用[9]。多項研究利用HIV-1假病毒在細胞水平進行抗HIV-1藥物的篩選、對患者體內HIV-1毒株進行耐藥性分析,取得較好效果[10-12]。本研究基于重組質粒PLAI和重組質粒JRFC共轉染293T細胞,成功包裝出假病毒,建立抗HIV-1假病毒篩選平臺,與活病毒相比具有較高的生物安全性,適用于普通實驗室對抗HIV-1藥物篩選的需求。在此模型中,不同稀釋度的假病毒感染MAGI-CCR5細胞后,熒光素酶的表達水平與病毒稀釋度呈明顯的劑量依賴效應,較靈敏地體現了HIV-1的復制水平,其特點符合藥理篩選模型的要求。

病毒復制的晚期步驟發生在報告基因表達之后,故檢測報告基因的表達不能反映藥物對病毒復制晚期的抑制情況,該方法不適用于蛋白酶等晚期過程抑制劑的活性篩選[13-14]。由于課題組所聯系HIV/AIDS患者均為河南地區人員,大部分為HIV-1 B’型病毒感染,因此研究中只采用了含B亞型ENV基因的質粒制備假病毒毒株,所建立的假病毒篩選體系符合此型HIV/AIDS治療的中藥及臨床中藥復方的抗病毒篩選需求,后期可制備多種類型假病毒毒株以對藥物進行更全面篩選,進一步優化和完善篩選平臺。

現代藥理學研究顯示,黃芩的主要有效成分是黃酮類成分,其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調節等方面具有較好效果[15-16]。連翹的主要成分為連翹苷和連翹酯苷,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤、免疫調節等活性,主治熱病初起、風熱感冒、發熱、心煩、咽喉腫痛等[17-18]。貓眼草中含有萜類、黃酮類、甾醇、揮發油和酚類等多種化學成分,具有祛寒、鎮咳、平喘、拔毒止癢、利尿消腫之功。貓眼草內服有抗菌抗病毒作用,可用于治療呼吸系統疾病,還可抗腫瘤;外用可治療淋巴結結核、皮癬等疾病[19-20]。多種清熱解毒中藥如紫花地丁[21]、夏枯草[22-23]、穿心蓮[24-25]、黃芩[30]、魚腥草[26]、金銀花[27-28]等對HIV病毒的增殖具有抑制作用。紫花地丁的二甲基亞砜、夏枯草的含硫多糖、穿心蓮的內酯具有抗HIV病毒作用的成分。通過對中藥有效成分的藥理分析,發現了諸多抗HIV活性物。如：栝樓中分離出的天花粉蛋白目前已被用于AIDS的臨床治療[29]。又如：黃芩苷能夠抑制HIV逆轉錄酶的活性,且對酶活性的抑制作用有濃度依賴關系;其對HIV-1假病毒的抑制作用隨著給藥濃度的增高而增大,100 μmol/L黃芩苷的抑制率為60%左右[30]。

近年來,中醫藥防治AIDS在中藥復方的研發方面取得了較好的成果[31]。益艾康膠囊[32-33]、唐草片[34-35]、復方三黃散[36-37]、艾寧顆粒[38-39]等中藥復方制劑在臨床上應用較為廣泛且臨床效果確切。同時實驗研究證明這些中藥復方具有較好的抗病毒作用,使CD4淋巴細胞的比例升高、患者的機體免疫能力明顯改善[40]。本研究前期建立合理的假病毒平臺,利用此平臺對不同質量分數的黃芩、貓眼草、連翹單味中藥進行篩選,通過熒光素酶報告基因的表達檢測,觀察藥物對HIV假病毒影響,體外篩選其抗病毒作用。結果顯示：單味中藥黃芩、貓眼草具有較好的體外抗HIV病毒的作用,且抗病毒作用與藥物質量分數呈明顯的劑量效應關系;連翹的抗HIV病毒作用相對較弱。此結果對中藥的有效成分研究提供了實驗依據,為開發我國自主產權的抗AIDS天然藥物提供了數據支撐。