鑒定LTBP1 作為胃癌預后的生物標志物及其與腫瘤免疫微環境的相關性

王小瑞 ,王覓柱

1包頭市第四醫院消化內科 內蒙古自治區包頭市,014030

2內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院消化內科 內蒙古自治區包頭市,014030

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發病率居惡性腫瘤的第五位[1-3]。胃癌早期通常無癥狀,有些患者診斷時已處于晚期,生存率僅為24 %[4-6]。近年來,一些治療晚期胃癌的靶向藥物已被開發并批準用于臨床,包括曲妥珠單抗、雷莫昔單抗和帕博利珠單抗[7-9]。然而,胃癌患者的總體預后仍然較差。在中國,胃癌的發病率和死亡率均位居第三。全球每年新發胃癌病例中,中國約占其中的40 %。我國早期胃癌占比很低,僅約20 %,大多數發現時已是進展期,總體5 年生存率低于50 %,以手術為基礎的綜合治療仍是胃癌的主要治療方法[10]。一些研究表明,胃癌患者術后的中位生存時間僅為37～43 個月,術后隨訪27.8 個月,復發率高達36.8 %,其中大部分為遠處轉移[11-13]。

潛在轉化生長因子β 結合蛋白1 (latent transforming growth factor beta binding protein 1,LTBP1)作為一種分泌蛋白,是細胞外基質的重要組成部分,屬于轉化生長因子-β 蛋白家族成員,具有獨特的結構域激活TGF-β 信號通路,發揮多種生物學功能[14]。研究發現,LTBP1 促進食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC) 的腫瘤發生與進展[15],并且可能通過調控細胞外基質(extracellular matrix,ECM) 介導了抑郁癥與惡性膠質瘤的發生進展[16],而在宮頸癌中有發現LTBP1 的降低與腫瘤惡性進展有關[17]。此外,LTBP1與AFP 合用可以更好的診斷和預測肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[18]。但是LTBP1在胃癌中的生物學功能研究仍不多。有研究發現,在胃神經內分泌癌中的部分樣本中檢測到LTBP1 的突變[19],另一項研究表明,LTBP1 的高表達可能與微衛星不穩定性高的胃癌患者總生存率低相關[20]。本研究主要探索LTBP1 與胃癌發生發展的關系,為LTBP1 應用于胃癌靶向治療提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 TCGA 中胃癌測序數據的處理

在R 軟件中使用limma 包來標準化矩陣數據,并在每個數據集中識別腫瘤組織和癌旁組織之間的差異表達基因(DEG)。使用Benjamin Hochberg 方法調整P值。調整后的P＜0.05 和| log2 倍數變化| ＞1 表明基因差異具有統計學意義。

1.2 患者和組織樣本

胃癌組織芯片HStm-Ade150 CS-01 購買于上海芯超生物公司,該組織芯片包含75 例胃癌組織及癌旁組織,所有組織的收集都獲得患者的知情同意,組織芯片的使用已獲得樣本倫理使用審查(YBM-05-02)。將胃癌石蠟切片脫蠟至水。在室溫下用3 %過氧化氫孵育5 min,以消除內源性過氧化物酶的活性。用蒸餾水沖洗,在PBS 中浸泡5 min,重復兩次。用10 %山羊血清(用PBS 稀釋) 封閉,室溫孵育10 min,小心倒出血清,加入一抗工作液,4 ℃孵育過夜。用PBS 沖洗5 min,重復3 次。滴加1 mL生物素標記的二抗工作液,37 ℃孵育20 min。用PBS 洗滌5 min 并重復3 次。滴加1 mL 辣根酶標記的鏈霉親和素工作溶液,在37 ℃下孵育20 min。用PBS沖洗5 min,重復3 次。顯影劑顯色后,每隔30 s 立即在顯微鏡下觀察是否有染色(DAB),2 min 后變為灰褐色時表示染色成功。用自來水充分沖洗,復染,脫水,透明并密封薄膜。

1.3 TIMER 分析LTBP1 與免疫細胞的相關性

利用TIMER (Tumor Immune Estimation Resource) 免疫浸潤分析在線網站,在基因模塊中輸入LTPB1 基因表達水平和免疫標記基因列表,并將它們分組以進行進一步的參數設置,分析LTBP1與腫瘤免疫B 細胞、T 細胞、Th1 細胞,Treg 細胞的相關系數。

1.4 生存和預后分析

為了驗證關鍵基因的可靠性,我們使用在線工具GEPIA22 驗證了TCGA-STAD 數據中腫瘤組織和正常組織中關鍵基因的mRNA 表達水平。然后,基于TCGA-STAD 數據,我們使用R 軟件中的生存包進行Kaplan-Meier 單變量生存分析,以探討患者的總生存率(OS) 與關鍵基因之間的關系。在這項研究中,只選擇完成隨訪時間的患者進行生存分析,然后根據關鍵基因的表達中值分為兩組。與預后相關的關鍵基因(P＜0.05) 被認為具有統計學意義。

1.5 統計分析

使用R 軟件版本4.0.2 (https://www.r-project.org/) 處理實驗數據。測量數據表示為。獨立樣本采用獨立樣本t檢驗,配對樣本采用配對樣本t檢驗。Kaplan-Meier 生存率分析采用對數秩檢驗。P＜0.05 表明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LTBP1 在胃癌中的表達及臨床意義

泛癌分析結果顯示,LTBP1 在TCGA 的33 種腫瘤中均有表達(圖1A)。LTBP1 在腫瘤組織中的表達水平顯著高于其在癌旁組織中的表達(圖1B)。在配對的胃癌樣本中LTBP1 也顯著高表達(圖1C)。

圖1 LTBP1 在胃癌中的表達分析

應用ROC 分析驗證LTBP1 的潛在診斷價值,并計算LTBP1 ROC 曲線下的面積。ROC 曲線下的面積為0.733,表明LTBP1 可能是一種潛在的診斷標志物(圖1D)。

2.2 LTBP1 表達與胃癌的臨床相關性

我們比較了LTBP1 表達與患者臨床病理關系特征的相關性。結果顯示,與T1 期患者相比,LTBP1 在T1、T2 和T3 期患者中表達也逐漸升高(圖2A),病理分期中也出現了一致的結果,在惡性高的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期中表達升高(圖2B),LTBP1 在M0 和M1 期患者中的表達無顯著差異(圖2C)。這些結果表明,LTBP1 的高表達與胃癌的惡性進展密切相關。

圖2 LTBP1 表達與胃癌臨床參數相關性分析

2.3 LTBP1 表達與胃癌預后的關系

使用“survminer” 軟件包繪制的Kaplan-Meier圖評估LTBP1 在胃癌中的預后價值。結果顯示,LTBP1 的高表達與總生存期縮短[HR=1.46 (1.05～2.03),P=0.026] 和無進展生存期縮短[HR=1.35 (0.95～1.93),P=0.038] 相關(圖3)。

圖3 LTBP1 表達與胃癌患者生存預后的關系

2.4 LTBP1 表達與胃癌免疫浸潤的相關性

采用Spearman 相關分析法對胃癌患者腫瘤微環境中LTBP1 的表達水平與TIMER 定量的免疫浸潤進行相關性分析。

我們分析了T 細胞、B 細胞、Treg 和Th1 細胞與LTBP1 表達之間的相關性,首先我們發現LTBP1 在T 細胞、B 細胞和Th1 細胞富集分數高的組中高表達,具有統計學差異,與調節性T 細胞(Treg) 富集分數無顯著差異。進一步分析發現,發現LTBP1 的表達與T 細胞、B 細胞、Th1 細胞和Treg 細胞的浸潤相關系數分別為0.203、0.289、0.182 和0.061,統計學分析顯示LTBP1 的表達與T 細胞、B 細胞、Th1 細胞顯著正相關,差異具有統計學意義(圖4)。

圖4 TIMER 定量分析LTBP1 與胃癌免疫細胞浸潤關系

2.5 評估LTBP1 表達作為胃癌預后標志物

為了進一步驗證LTBP1 蛋白在胃癌中的表達情況,我們在75 例胃癌患者及配對癌旁組織進行免疫組織化學染色,結果表明,與癌旁組織相比,LTBP1 在胃癌組織中高表達(圖5)。

圖5 免疫組化檢測LTBP1 在胃癌及胃癌旁組織中的表達情況(200 ×)

3 討論

胃癌是世界上發病率較高的惡性腫瘤,被發現時大多處于晚期。晚期胃癌患者預后較差,對化療不敏感[21-22]。因此,尋找有效的生物標志物對預測胃癌預后和作為潛在靶點具有重要意義。LTBP1是一類具有多種生物學功能的分泌蛋白,通過其自身的EGF 結構域調節TGF-β 的活化。TGF-β 的異?；罨c多種疾病的發生特別是腫瘤的發生相關。

LTBP1 在胃癌中的研究不多,作用尚不明確。本研究通過綜合生物信息學分析,結合TCGASTAD 分析了LTBP1 在胃癌的表達情況,我們發現LTBP1 高表達于胃癌樣本,此外通過比較LTBP1在GTEx 數據庫及TCGA 數據庫中正常樣本和胃癌患者樣本中的表達,發現LTBP1 在胃癌患者樣本中高表達。ROC 曲線表明LTBP1 具備潛在的胃癌診斷價值。接下來,我們進一步比較了LTBP1 表達與患者臨床病理關系特征的相關性并對LTBP1在胃癌中的預后價值進行評估,我們發現LTBP1的表達與TNM 分期和組織學分級有一定的相關性,且LTBP1 的上調與胃癌總體生存率期和無進展生存期縮短顯著相關。我們通過免疫組織化學染色進一步在75 例胃癌組織及配對癌旁組織中檢測了LTBP1 的表達,進一步驗證了LTBP1 在胃癌中的表達水平顯著高于癌旁組織。此外,通過TIMER我們進行了LTBP1 表達與胃癌中免疫細胞浸潤情況的分析,我們發現LTBP1 的表達與T 細胞、B細胞、Treg 和Th1 細胞的浸潤具有相關性。這些結果證實了LTBP1 在胃癌組織中高表達,且和胃癌的臨床特征密切相關。但是LTBP1 促進胃癌的分子生物學機制還需進一步研究。未來我們將繼續分析和探討LTBP1 在胃癌的發生發展中的可能機制,以提高胃癌的篩查和早期診斷,改進治療方法,減少復發和轉移。