通過式固相萃取結合高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜測定雞蛋中62種獸藥殘留

侯 軒,王 彬,劉愛軍,黃曉兵,柴 娟,張航俊,陸春波

(浙江省動物疫病預防控制中心,杭州 310000)

隨著物質生活水平的逐漸提高,人們對食品質量安全也越來越重視,其中畜產品獸藥殘留問題受到了社會各界的關注。雞蛋作為一種重要的動物性食品,能夠為人們提供大量的蛋白質以及各種維生素[1],在人們日常飲食中占有重要的地位。在蛋雞養殖過程中,抗生素作為一類天然、半合成或人工合成的化合物,因其具有促進動物生長、減少疾病發生率、提高飼料利用率等優點而廣泛使用[2],但若其使用不當則會造成雞蛋抗生素殘留超標?？股貧埩敉ㄟ^食物鏈富集進入人體后,會危害人類健康。目前我國已制定了一系列獸藥限量標準[3-4],對其用于畜禽動物的養殖加以限制或禁止,但獸藥品種繁多,如何同時快速甄別與確證雞蛋中多種抗生素殘留,保障消費者健康安全顯得意義重大。因此,針對雞蛋建立一套高通量、高靈敏度、快速準確的獸藥多殘留測定方法具有重要的實際應用價值。

目前,動物源性食品中抗生素檢測方法主要有免疫分析法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]、氣相-串聯質譜法[9-10]、液相-串聯質譜法[11-13]等。其中,液相色譜-串聯質譜法(LC-MS / MS)因其具有高通量、高靈敏度、抗干擾能力強的特點,越來越多地被廣泛應用于食品中獸藥殘留的檢測,但LC-MS / MS受限于其掃描速率及分辨率,對于同時測定多組分獸藥分析的效果不佳。飛行時間質譜作為一類高分辨質譜,由于具有更快的掃描速率和更高的分辨率[14-16],在抗基質干擾能力方面表現更強,可同時實現對數百種化合物的快速篩查和分析,進一步提高檢驗效率。

本研究擬采用通過式固相萃取樣品前處理技術,該技術可同時減少雞蛋中蛋白質、脂質、色素等雜質干擾,有效降低基質效應,還可免除活化與平衡步驟,減少前處理時間與成本,適合多組分檢測時大規模樣品的凈化。同時結合高分辨質譜檢測的優勢,可對8大類62種獸藥化合物進行同時測定,建立一套快速準確的篩查確證分析方法。本方法具有簡便快捷、覆蓋目標物范圍廣、通量高且準確可靠的特點,適用于大批量雞蛋中痕量獸藥多殘留的快速篩查與確證分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 甲醇、乙腈(色譜純,Mecrk公司);甲酸、乙酸銨(色譜純,阿拉丁公司);PRiME HLB 固相萃取小柱(200 mg/6 mL,Waters 公司);聚四氟乙烯針式濾膜(0.22 μm,Green Mall公司)等。

62種獸藥標準物質(喹諾酮類13種、磺胺類21種、大環內酯類10種、硝基咪唑類6種、酰胺醇類3種、硝基呋喃類4種、喹噁啉類4種、林可胺類1種)分別購于德國Dr. Ehrenstorfer公司、美國Sigma公司和中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備 Agilent 1290-6550高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀(配雙噴霧器電噴霧源),美國Agilent公司;Agilent MassHunter軟件工作站,美國Agilent公司;XS205分析天平,美國Mettler Toledo公司;KQ-500E超聲儀,昆山市超聲儀有限公司等。

1.3 樣品前處理 稱取已均質的雞蛋樣品2±0.02 g于50 mL離心管中,準確加入10 mL甲酸乙腈溶液(甲酸、乙腈、水體積比為0.1∶90∶10),渦旋振蕩提取1 min,超聲提取10 min,10000 r/min離心5 min,收集全部上層提取液過PRiME HLB固相萃取柱,收集濾液,準確吸取5 mL 濾液于另一帶刻度離心管中,40 ℃氮氣吹至1 mL以下,殘渣用0.2%甲酸水定容至1.0 mL,過0.22 μm 濾膜后,供 HPLC-QTOF測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 采用Waters ACQUITY T3,1.7 μm,100 mm×2.1 mm色譜柱,柱溫25 ℃,進樣量2 μL,流動相條件見表1。

表1 HPLC-QTOF流動相條件Tab 1 HPLC-QTOF Mobile Phase Conditions

1.4.2 質譜條件 質譜采用Dual AJS ESI源,掃描方式為正離子、負離子全掃描。電離源溫度120 ℃,毛細管電壓3000 V,噴嘴電壓200 V,干燥器溫度250 ℃,鞘氣溫度320 ℃。一級質譜數據采集為全掃描模式,掃描范圍:m/z100～1 000 Da,采集速率為1.5 spectra/s。二級質譜數據采集為目標離子采集模式,碰撞能量為 10、20和40 eV,掃描范圍:m/z50～1000 Da,采集速率為2.5 spectra/s。采集數據的同時連續導入參比溶液,對儀器質量軸進行實時校正,參比離子為m/z121.0509和m/z922.0098。62種化合物質譜參數見表2。

表2 62種化合物測定信息Tab 2 Determination Information of 62 Compounds

1.4.3 高分辨質譜庫的建立 針對62種待測化合物,在Agilent MassHunter軟件工作站項下的譜圖數據庫軟件(PCDL)中錄入各化合物的中文名稱、CAS號、分子式等基本信息;采用本研究建立的液相、質譜條件對62種化合物標準溶液進行測定,得到各化合物的保留時間、母離子精確質量數、子離子特征圖譜等信息,將所有信息導入PCDL中,建立62種化合物高分辨質譜譜庫。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優化 考察了流動相組分、比例對待測化合物測定的影響。本研究流動相A為含5 mmol/L乙酸銨的0.2%甲酸水溶液,B相為含5 mmol/L乙酸銨的0.2%甲酸甲醇溶液,分別采用0.1%和0.2%甲酸添加量進行了分析,發現0.2%的甲酸水乙酸銨溶液和甲酸甲醇溶液做流動相所得化合物的峰型更好。由于此方法篩選的化合物種類較多,各種藥物的極性強弱、在色譜柱上保留強度以及洗脫的時間長短均不相同,若使用等度洗脫的方法無法得到非常理想的峰形,因此本研究選擇梯度洗脫,具體色譜條件見表1。

2.2 質譜條件的優化 配制濃度為20 ng/mL的62種化合物的混合標準溶液,優化最佳的電離源溫度、毛細管電壓、鞘氣溫度、干燥器溫度等質譜條件,用HPLC-Q-TOF測定。采用MS全掃描模式采集各化合物的一級質譜信息,Target-MS/MS模式采集二級質譜信息,確定了62種化合物的實測母離子精確質量數、保留時間、特征子離子精確質量數等質譜參數,具體見表2。

2.3 基質效應考察 雞蛋脂類、蛋白豐富,在化合物質譜分析中可能出現基質效應的情況。對62種化合物在雞蛋中基質效應情況進行了考察。其中,酰胺醇類、喹噁啉類藥物表現為基質抑制效應。為保證實驗結果的準確,本研究采用基質匹配標準曲線以消除或減弱基質效應對定量分析結果的影響。

2.4 定量方法確定 為獲得準確可靠的定量結果,待測樣品采取全掃描模式(FULL-MS)進行初步篩查后,疑似陽性樣品采取目標離子模式(Target-MS)進行二級質譜數據采集,該模式利用三重四極桿對目標化合物的母離子進行選擇與裂解,確保掃描速率與掃描時間的同時,可有效減少雜質干擾、提高檢測靈敏度,保證定量結果準確。

2.5 標準曲線、檢出限及定量限 按1.3項處理空白樣品后,采用雞蛋空白提取液配制 62種化合物的標準工作液,供HPLC-QTOF檢測。以目標化合物色譜峰面積及其對應化合物濃度繪制標準曲線,獲得待測物質的線性回歸方程,取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD),取信噪比S/N=10 的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。62種化合物濃度在 0.5 ～500 ng /mL 范圍內,雞蛋中 62 種化合物的線性關系良好(r2≥0.99),方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別在 1.0～ 2.0 μg / kg 和 2.0 ～5.0 μg / kg 范圍內,均滿足檢測需求。

2.6 方法的回收率、精密度 分別在各化合物定量限、2倍定量限及10倍定量限濃度添加水平下進行添加回收實驗,每個濃度設5個平行,重復3次。計算添加回收率及變異系數,結果見表3。

表3 雞蛋中62種化合物的回收率(n=5)Tab 3 Recovery rates of 62 compounds in eggs (n=5)

2.7 實際樣品檢測 應用建立的分析方法,對浙江省內市面上售賣的150份雞蛋樣品進行測定,其中1批次雞蛋檢出恩諾沙星,含量為5.3 μg/kg。該檢測結果表明,本方法能滿足對雞蛋中62種化合物有效監控的需要。

3 討論與小結

3.1 液相條件的優化 因待檢化合物存在同分異構體,僅靠質譜分析很難將所有化合物有效定性,故對液相條件進行了優化。一是考察了流動相組成對化合物靈敏度和離子化效率的影響,發現在流動相中添加0.1%甲酸及5 mmol/L乙酸銨,可以有效提高化合物在正離子和負離子模式下的離子化效率,提高靈敏度。二是對流動相比例進行了考察,發現采用梯度洗脫能保證待測化合物的有效分離。如待測化合物磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶為同分異構體,分子式為C11H12N4O3S,采取1.4.1項液相條件進行分析,保留時間分別為8.94、9.29、10.16 min,得到有效分離,進一步保證化合物定性的準確,具體見圖1。

圖1 磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶標準溶液(10 ng/mL)Fig 1 Sulfameter, Sulfamethoxypyridazine and sulfamethoxypyrimidine Standard solution(10 ng/mL)

3.2 提取條件的優化 本研究對純乙腈、乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)、乙腈:水:甲酸(80∶20∶0.1,V/V/V)3種提取劑進行了考察。3種提取劑對8大類62種獸藥的提取效果,見圖2。結果表明,乙腈-水體系提取效率明顯高于純乙腈,可能是乙腈乙腈-水體系有效沉淀蛋白的同時,還具有更強的滲透力,可有效提取基質中的待測化合物;90% 甲酸乙腈水溶液提取效果與80%甲酸乙腈水溶液提取效果差別不大,但提取液過Prime HLB小柱后還需氮吹,考慮到氮吹效果,減少氮吹時間,選擇乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)作為提取液。

圖2 不同提取液提取效率(添加濃度為 10 μg/kg)Fig 2 Extraction efficiency of different extraction solutions (added concentration of 10 μg/kg)

本研究采用通過式固相萃取與高分辨質譜技術相結合的檢測方式,建立了同時測定雞蛋中62種獸藥殘留的分析方法,并進行了方法學驗證,回收率在71.2%～113%之間,日內變異系數范圍為1.3%～14.3%,日間變異系數范圍為4.2%～18.3%,檢測限為1.0～2.0 μg/kg,定量限為2.0～5.0 μg/kg。本方法操作簡便,靈敏度高,適用于大批量雞蛋中痕量獸藥多殘留的快速測定。