可溶微針負載富血小板裂解液對糖尿病小鼠創面愈合的基礎研究

吳嘉康 鄭詩凡 游訓儀 王紅 徐瑩璨 鐘銳 劉嘉馨

(中國醫學科學院北京協和醫學院輸血研究所，四川 成都 610052)

糖尿病足部潰瘍是糖尿病最為常見的并發癥之一，有報道指出，約30%的糖尿病患者會出現慢性不愈合創面，且一年內的復發率高達40%[1]。 隨著研究的不斷深入，創面形成被認為是細胞組織功能受限或病變而導致內源性生物因子的缺乏等多因素造成，可通過局部遞送外源性藥物來提高創面愈合的質量[2]。

微針(microneedles， MNs)是一種新型經皮給藥技術，相較于傳統糖尿病敷料，通過刺破皮膚形成微小通道，繞過存在于慢性創面中的理化屏障，可將大分子藥物遞送至皮膚深處，可極大提高藥物遞送效率，降低藥物損失率，提高生物利用率[3]。按照結構和釋藥方式的不同，微針可分為可溶微針、實心不溶微針、空心微針和涂層微針[4]。 其中可溶微針采用生物相容性良好，穩定易降解的生物醫用材料如透明質酸，殼聚糖等制備而成，兼具皮下注射與皮膚貼片的雙重優勢，在治療糖尿病創面領域中有著巨大潛力[5]。 富血小板血漿(plateletrich plasma，PRP)是通過離心全血后制備成的血小板高度濃縮的血漿制劑。 這種制劑富含各種血小板相關生長因子，近年來已被廣泛應用于關節、韌帶和肌肉等損傷修復中[6-7]。 PL 是在PRP 的基礎上，采取反復凍融的方法或加入血小板激活劑，激活PRP 中高濃度的血小板，使其活化釋放大量生長因子后再去除血小板所得到的制劑[8-9]。 有文獻表明PL 中含有豐富轉化生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子等生長因子，能夠促進細胞增殖分化，刺激細胞趨化性，在組織修復方面效果卓越的基礎[10-12]。

本研究使用羧甲基殼聚糖與聚乙烯基吡咯烷酮K-60 的復合材料為針體材料、聚乙烯基吡咯烷酮40000，透明質酸與D-山梨醇的復合材料為背襯材料制備負載PL 的微針貼片，通過對微針陣列的整體形貌、壓變實驗、微針測力等，生長因子含量以及糖尿病小鼠創面愈合效果評價等，考察PL 微針的療效，為糖尿病組織修復方面提供一種新思路，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 血小板來源

濃縮血小板由成都市血液中心提供，取回后于血小板震蕩箱中22℃保存。

1.2 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，6 ～8 周齡，體重(20±2)g【實驗動物許可證號:SCXK[湘]2019-0004，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司】實驗動物的管理和使用已通過倫理審查委員會評審。

1.3 主要儀器與試劑

真空泵(AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；集熱式磁力攪拌器[MS-H280-Pro，大龍興創實驗儀器(北京)股份公司]；真空干燥器；高清測量工具顯微鏡(GP-490，昆山高品精密儀器有限公司)；高速冷凍離心機(ALLEGRAX-15R，BECKMAN COULTER 公司)； 高級型數字測力儀(M5-5，MARK-10 公司)；圓錐可溶微針PDMS 凹模具(針長600 μm，底部尺寸300 μm，陣列數量20×20)；石蠟包埋機(JB-L5，武漢俊杰電子)；脫色搖床(SLK-03000-S，SCILOGEX)；正置光學顯微鏡(DM500，Leica)；羧甲基殼聚糖(CMCS，批號C12864697，上海麥克林生化科技有限公司)；DAB 顯色劑(20X)(BL732A，biosharp)；人血管內皮細胞生長因子(VEGF)酶聯免疫試劑盒(批號:CSB-E11718h，武漢華美生物工程有限公司)；蘇木素染液(BL700B，biosharp)；聚乙烯吡絡烷酮K-60(PVPK-60，批號BSF210317，合肥巴斯夫生物科技有限公司)；聚乙烯吡絡烷酮40000(PVP，平均分子量40000，批號No.505X044，北京索萊寶科技有限公司)；低分子透明質酸鈉(HA-TLM 20-40，批號20110241，華熙生物科技股份有限公司)；D-山梨醇(批號No.324R021，北京索萊寶科技有限公司)；人血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)酶聯免疫試劑盒(批號:CSB-E08923h，武漢華美生物工程有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 針體材料的配制

1)60 mg/mL CMCS、明膠混合溶液:將CMCS 與明膠按質量比5 ∶3溶解于超純水中，50℃溫水浴并持續攪拌，待材料充分溶脹，自然冷卻；2)60 mg/mL CMCS 與不同濃度PVPK-60 混合溶液:分別稱取一定量的PVPK-60 與CMCS 溶解于超純水中，室溫靜置待材料充分溶脹，依次配制成濃度為20、30、40、50、60 mg/mL PVPK-60 與60 mg/mL CMCS 的溶液。

1.4.2 背襯材料的配制及篩選

1)500 mg/mL HA 溶液:將HA 溶解于超純水中，室溫靜置待材料充分溶脹，2 000 g 離心10 min去除氣泡；2)15 mg/mL HA，250 mg/mL PVP40000混合溶液:將HA 與PVP40000 混合粉末溶解于超純水中，再加入26.5 mg/mL D-山梨醇，50℃溫水浴并持續攪拌1 ～2h 至材料充分溶脹，冷卻后室溫2 000 g離心10 min 去除氣泡。 為考察材料的成型性能與穩定性，篩選出制備微針的最佳背襯材料，以背襯平整度、背襯韌性、氣泡含量、脫模難易度與針型為指標對背襯材料進行綜合打分。

1.4.3 針體材料的篩選

1)砝碼壓變實驗:參考文獻[4]的方法，計算微針壓變前后的平均高度與彎折率。 2)力學實驗:使用高級型數字測力儀，測得PL 微針平均受力情況及形變程度，從而選出最佳濃度。

1.4.4 微針制備工藝

取150 μL 針體溶液倒入模具中，室溫下2 500 g離心10 min，抽真空至約-0.08 MPa，室溫下保持12 min，取出模具刮去多余針體溶液，加入約150 μL背襯溶液后，抽真空至約-0.08 MPa，保持12 min，刮去溶液并重新加入約250 μL 背襯溶液，然后將模具放置干燥器中過夜干燥，干燥器溫度維持在24℃左右，濕度維持在18%。

1.4.5 PL 的制備

參照文獻[13]的方法，將冷凍保存的濃縮血小板反復凍融6 次，在第6 次解凍后，室溫下3 100 g離心23 min，棄掉沉淀，將上清液凍存備用。

1.4.6 PL 微針的制備及表征

1)PL 微針的制備， 根據“1.4.4 項”方法，將材料溶解于PL 中制備微針。 2)PL 微針表征:①形貌高度，用高清顯微鏡觀察針體形貌與高度；②生長因子含量檢測，將微針置于0.5 mL PBS 溶液中，待微針完全溶解后采用ELISA 試劑盒的方法檢測溶液中生長因子含量。

1.4.7 糖尿病小鼠創面愈合效果評價

1)糖尿病小鼠模型的建立及創面的制備:將小鼠禁食10 h(過夜禁食不禁水)，稱重后尾尖采血，記錄血糖水平，按照小鼠體重120 mg/kg 的劑量，單次腹腔注射1%STZ 溶液。 造模后3 d 后，測定其空腹血糖，當空腹血糖值高于11.10 mmol/L 視為模型建立成功。 麻醉小鼠后，將脫毛膏均勻涂抹于背部，等待數分鐘后將脫毛膏擦凈，裸露出無毛粉嫩的皮膚，用打孔器在脫毛區中部制造1 個直徑1.0 cm的全皮層損傷創面。 2)糖尿病小鼠創面愈合效果評價: 根據“1.4.6 項”建立糖尿病小鼠創面模型，將16 只糖尿病小鼠隨機每組4 只分為4 組，分別采用PL 微針治療、不含有PL 的空白微針治療、PL 涂抹的方式治療、不做任何處理的對照組，在d0，d2，d4 給予治療，并于d0，d2，d4，d6，d8，d10拍照記錄創面變化情況，根據創面面積計算不同時間點的創面愈合率(At)。 At ＝×100% 注:S0為術后即刻創面面積；St 為t 時間點的創面面積；At 為t 時間點的創面愈合率。 3)取材: d10 采用戊巴比妥鈉過量麻醉的方式處死各組小鼠。 在無菌環境下，切下整個創面組織后將其置于固定液中固定，然后經脫水，包埋等步驟進行后續處理。 4)蘇木素伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H＆E):將組織石蠟切片按照蘇木素染色、伊紅染色、脫水、鏡檢等步驟進行后續處理。 5) 免疫組化: 將切片脫蠟，水化，經抗原修復等步驟，分別在切片上滴加IL-6(1 ∶200)，TGF-β(1 ∶200)，CD31(1 ∶100)，并將其置于濕盒4℃孵育過夜，隨后滴加二抗標記并進行DAB 顯色、復染細胞核、脫水封片。 最后各組內每張切片隨機選擇3 個視野拍照。 采用Image-Pro-Plus6.0 分析軟件。

1.5 統計學分析

采用GraghPad8.0.2 版統計學軟件處理和分析數據，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，計量數據均以“均數±標準差(±s)”表示，P＜0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 針體材料篩選結果

材料為CMCS 與明膠時，針體溶液流動性差，成針后高度較低，針體不飽滿，充斥氣泡，針型不均一，成針效果差。 材料為CMCS 與PVPK-60 時，各個濃度溶液流動性好，成針后整高度較高，針體飽滿銳利，無彎曲變形，受到一定壓力時未出現斷針。5 種不同PVPK-60 濃度微針砝碼壓變實驗結果見表1，圖1。 力學實驗結果見圖2，當PVPK-60 濃度為40 mg/mL 時，PL 微針機械強度最高。 位移從0 μm增加到200 μm，每根針的壓力從0 N 增加到≈1.5 N，最終選取PVPK-60 濃度為40 mg/mL。

圖1 5 種不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變前形貌Figure 1 Morphology of CMCS microneedles before compression change at five different PVPK-60 concentrations

圖2 5 種不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針的力學-位移曲線Figure 2 Mechanical-displacement curves of CMCS microneedles at five different PVPK-60 concentrations

表1 不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變性能(±s，n＝10)Table 1 Crushable properties of CMCS microneedles with different PVPK-60 concentrations (±s，n＝10)

表1 不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變性能(±s，n＝10)Table 1 Crushable properties of CMCS microneedles with different PVPK-60 concentrations (±s，n＝10)

壓變前50 g砝碼100 g砝碼200 g砝碼針體濃度高度(μm) 503±2503±2492±5 463±10(20 mg/mL) 彎折率(%)-02±18±2針體濃度高度(μm) 504±5504±5487±5483±9(30 mg/mL) 彎折率(%)-03±04±1針體濃度高度(μm) 503±2503±2488±9481±7(40 mg/mL) 彎折率(%)-03±14±1針體濃度高度(μm) 509±3509±3 490±10 486±11(50 mg/mL) 彎折率(%)-04±14±2針體濃度高度(μm) 505±2505±2486±6478±6(60 mg/mL) 彎折率(%)-04±15±1

2.2 背襯材料篩選結果

按照文獻[14]的標準對2 種背襯材料進行評分，A:500 mg/mL HA；B:15 mg/mL HA＋250 mg/mL PVP40000＋26.5 mg/mL D 山梨醇。 評分結果見表2，最終選擇B 作為背襯材料。

表2 不同背襯材料評分結果Table 2 Scoring results for different backing materials

2.3 PL 微針的形貌特征

本研究所制備的PL 微針陣列完整，針體飽滿，針尖銳利，整體高度約為(518±4)μm(圖3)。

圖3 PL 微針整體高度及形貌特征Figure 3 The overall height and morphological characteristics of PL microneedles

2.4 PL 微針生長因子檢測結果

結果如表3 所示，本研究制備的PL 中PDGFBB 含量為(18 741±1 287)pg/mL，VEGF 含量為(625±35)pg/mL，符合文獻[15]中的報道。 將PL制成微針后生長因子濃度仍能保持一半以上，表明本研究制備的PL 微針具有一定生物活性。

表3 PL 及PL 微針的生長因子含量Table 3 Growth factor content of PL and PL microneedles

2.5 糖尿病小鼠創面愈合效果評價

創面大體觀結果如圖4 所示，PL 微針組愈合率遠遠高于前3 組，有明顯差異。 在d6 時，PL 微針組小鼠創面愈合率為(83±5)%，PL 涂抹組小鼠創面愈合率為(64±4)%，空白微針組小鼠創面愈合率為(58±4)%，對照組小鼠創面愈合率為(52±4)%。 結果提示使用PL 微針有助于糖尿病小鼠傷口愈合。

圖4 糖尿病小鼠創面愈合情況Figure 4 Wound healing in diabetic mice

2.6 PL 微針對糖尿病小鼠創面組織病理變化

對d10 小鼠傷口組織進行H＆E 染色，結果如圖5 所示，空白微針組出血點最多，PL 微針組相較于其他三組，炎細胞浸潤及出血點較少，新生毛細血管數量較多，皮膚組織結構較清晰。 結果提示使用PL 微針有助于糖尿病小鼠傷口愈合。

圖5 不同治療方式對糖尿病小鼠傷口愈合的影響Figure 5 Effect of different treatment modalities on wound healing in diabetic mice

2.7 PL 微針對糖尿病小鼠創面的抗炎作用

本實驗選用促炎因子IL-6 和抗炎因子TGF-β對糖尿病小鼠創面組織切片進行免疫組化染色。結果如圖6 所示，對照組IL-6 表達量明顯升高，空白微針組陽性區域與對照組相比無明顯差異，PL涂抹組與PL 微針組IL-6 表達量明顯下降，與對照組和空白微針組有顯著差異；而TGF-β 對照組表達量明顯下降，空白微針組與PL 涂抹組陽性區域與對照組相比無明顯差異，PL 微針組TGF-β 表達量明顯上升，與前三組均有顯著差異。 以上結果提示，使用PL 對糖尿病小鼠創面有一定抗炎作用，PL 微針的抗炎作用優于PL 涂抹。

2.8 PL 微針對小鼠組織中血管新生的影響

本實驗選用血管標記物CD31 對傷口組織切片進行免疫組化染色。 圖7 所示，PL 微針組CD31標記的血管內皮細胞表達量顯著上升，與對照組，空白微針組及PL 涂抹組有明顯差異。 結果提示，PL微針對糖尿病小鼠傷口組織新生血管有促進作用。

3 討論

醫用高分子生物材料是一類天然或人工合成的特殊功能材料，種類繁多，可用于輔助診斷、治療疾病及替換人體器官等[16]。 其中CMCS 是水溶性殼聚糖衍生物，具有生物降解性，優秀的生物相容性等特性，同時有文獻報道，CMCS 能促進成纖維細胞的增殖，加速創面愈合，是用于糖尿病傷口理想的材料[17-18]。 但僅使用CMCS 制備微針，針體機械強度不佳，成針率較低。

增稠劑是一類增加體系黏度的助劑，近年來以發展新型高分子材料為主，具有增稠明顯，用量較少等特點[19]。 本研究選用兩種具有良好生物相容性的增稠劑:明膠與PVPK-60，來改善針體機械強度，增加成針率。 通過實驗發現，加入PVPK-60 制備得到的微針機械性能優于明膠組，且當PVPK-60濃度為40 mg/mL 時，微針力學性能最佳。

糖尿病難愈合創面形成的主要因素有持續炎癥，新生血管不足等[20]。 目前治療糖尿病創面方法多種多樣，雖能夠較好保護創面但藥物遞送能力都較弱。 微針擁有注射給藥以及皮膚貼片的雙重優勢，按照結構和釋藥方式的不同，微針可分為可溶微針、實心不溶微針、空心微針和涂層微針。 實心不溶微針是通過刺破皮膚后，移除微針，留下小通道孔徑以達到增強藥物遞送的能力，但由于微針材料是非降解材料，可能出現斷針裂針的情況，將針體滯留在組織內，造成安全隱患；空心微針類似于縮小的注射器針頭，可最大化精確定量進行藥物遞送，其造價昂貴，使用不便捷；涂層微針是將遞送的藥物包被在實心微針表面，形成藥物涂層，在刺入皮膚后吸收溶解，但由于微針針體較小，表面積極大地限制了載藥量，而以生物醫用材料制備而成的可溶微針，將藥物包封在針體中，插入皮膚后全部溶解，局部釋放，與其他類型的微針相比，可溶微針既能將藥物遞送至傷口深處，溶解后又能在表面形成粘稠液體，保護傷口微環境，提高載藥量，無廢棄殘留，患者使用便捷[21-22]。 目前有研究團隊使用微針載藥治療糖尿病潰瘍，如Yuan 等[23]開發了1 種新型微針，通過負載人臍靜脈內皮細胞外泌體與他扎羅汀來治療糖尿病創面，藥物釋放持續一周左右，動物實驗表明療效顯著，但外泌體存在提取困難、造價昂貴等問題，目前難以普及。 本研究采用的PL 制備簡便易保存，同時含有大量生長因子，是治療糖尿病創面的理想材料。 在本研究中，使用空白微針治療的小鼠創面中可見較多出血點與炎細胞浸潤，可能是微針造成微小創傷且未負載PL使得出血點增加。 使用PL 涂抹治療的小鼠創面中，愈合情況優于對照組與空白微針組，以H＆E 染色以及免疫組化結果觀察，是由于PL 促進了傷口組合的愈合，同時下調了促炎因子IL-6 的表達，減緩了傷口的炎癥情況。 本研究選用了TGF-β 作為抗炎因子檢測指標，是因為糖尿病創面在臨床上表現為難以結痂封閉傷口環境，TGF-β 既能作為1 個抗炎的指標，同時也是組織修復和創面纖維化的指標，TGF-β 表達增高在一定程度上表示傷口結痂封閉的能力有一定提升[24]。 使用PL 微針治療的小鼠創面中，由于微針的通道作用將PL 遞送至組織深處，使其大幅度抑制了促炎因子的表達，并促進抑炎因子TGF-β 與內皮細胞標志物CD31 的表達，高表達的CD31 表明其微血管新生旺盛，使其最終表現為糖尿病創面愈合效果最佳。

本研究制備的微針陣列完整、針體飽滿、針尖銳利、整體平坦，在維持一定機械強度的條件下有一定柔韌性，既能充分貼合創面，又不會對創面產生二次傷害。 從糖尿病小鼠創面大體觀察，H＆E染色與免疫組化結果均顯示PL 微針組治療有明顯效果。 但微針治療目前仍存在許多問題，如在微針制備方面還可以進一步優化工藝，篩選更穩定，效果更好的生物醫用高分子材料等，在動物實驗后期，會出現創面表層痂皮變厚，微針無法刺破，涂抹的藥物無法滲透等，這些還都需要我們進一步研究。