糞菌移植治療DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的免疫學機制研究

劉 揚, 劉 青, 路 明

(新疆醫科大學第一附屬醫院肛腸外科, 烏魯木齊 830054)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)屬于一類復發性、慢性結腸炎癥性疾病。研究認為,其發病機制可能與免疫功能紊亂、環境、腸道微生物、遺傳等多因素相關[1],但具體機制仍需深入研究。UC的治療主要依賴內科藥物,如氨基水楊酸、糖皮質激素及免疫抑制劑等,但其療效較為局限且副作用明顯,而糞菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)作為一種特殊的微生物移植方法,在功能性便秘、肝衰竭、自身免疫性腦脊髓炎、潰瘍性結腸炎(UC)等疾病方面具有較好的治療效果[2]。然而,FMT在UC中的具體作用機制尚不明確。有實驗結果顯示,經FMT治療后,由葡聚糖硫酸鈉(DSS)所致UC小鼠的體重、大便性狀和遠端結腸病理改變均有顯著改善,說明FMT能夠改善DSS所致的小鼠結腸炎[3]。FMT通過重建腸道微生態平衡、調整和抑制腸道紊亂引起的免疫炎癥反應,穩定腸道免疫以達到治療效果[4]。本研究旨在通過DSS誘導形成小鼠UC模型,驗證FMT的療效及其可能的免疫學作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑雄性C57BL/6J,SPF級小鼠60只,8周齡,體重20～24 g,由湖北省疾病預防控制中心提供(使用許可證號:202310061)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)(源葉公司,貨號:02160111080);HE染色試劑盒(經科化學,貨號:L9406);ELISA試劑盒(貨號: JL15150)、 小鼠白介素-6(IL-6)試劑盒(貨號:FB-0111F1)、小鼠白介素-17(IL-17)試劑盒(貨號:FB-0063F1)、小鼠白介素-22(IL-22)試劑盒(貨號:FB-0079F1)、小鼠白介素-35(IL-35)試劑盒(貨號:FB-0071F1)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(貨號:FB-0189F1)、小鼠可溶性Fas試劑盒(貨號:FB-0182F1)均購自武漢豐賓生物科技有限公司。本實驗已通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的審批(審批號:202310061)。

1.2 糞菌的制備取10只雄性 C57BL/6J小鼠(不參與后續實驗)的新鮮晨便5 g,溶于10 mL無菌生理鹽水中,分別經2.0、1.0、0.5和0.25 mm不銹鋼篩過濾,6 000 r/min,離心15 min,收集菌體,無菌生理鹽水洗滌3遍,25 mL滅菌生理鹽水重懸,置于4℃冰箱中保存備用。

1.3 動物分組、模型制備及處理[5]對50只雄性 C57BL/6J小鼠逐個稱重,編號。采用隨機數字表法隨機分為空白組(n=10)、模型組(n=20)、研究組(n=20)?？瞻捉M自分組首日起自由飲用滅菌蒸餾水,正常飲食,連續30 d。模型組和研究組自分組首日起自由飲用2%DSS溶液,正常飲食,連續30 d,誘導形成潰瘍性結腸炎小鼠模型。判定標準:光鏡下結腸黏膜病理學檢查提示,黏膜變薄,上皮結構缺失,腺體分布無規則性,固有層充血水腫,伴大量炎癥細胞浸潤及毛細血管充血、淋巴管明顯擴張,彌漫分布小潰瘍等病變。臨床觀察排便次數≥3次、排便質量為稀便或黏液便、排便量的增加符合潰瘍性結腸炎的臨床癥狀時確認模型成功。造模成功后,空白組不予處理,模型組予以生理鹽水灌腸,研究組予以糞便混懸液生理鹽水混合物灌腸,每3天灌腸1次,共2次。根據小鼠體重,本研究灌腸量設定為1.0 mL/次。在造模及實驗過程中,用于留取大便的小鼠存活6只,空白組存活6只,模型組存活7只,研究組存活8只,共27只。

1.4 HE染色觀察結腸組織病理形態表現[6]取最終存活的所有小鼠病變結腸部分組織,置于4%多聚甲醛中固定24 h,常規脫水、包埋和切片,根據HE試劑盒說明書進行蘇木素-伊紅染色,中性樹膠封片,通過顯微鏡觀察結腸組織病理受損情況。

1.5 ELISA法檢測血清中炎癥因子水平[7]在第2次灌腸結束后第2天處死小鼠,采集小鼠眼底靜脈血1.0～1.5 mL,置于干燥的滅菌血清分離管內,室溫靜置2 h,待自然凝固,2 000 r/min,離心15 min,分離血清,-20℃冰箱存儲備用。通過ELISA法測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-35(IL-35)、白介素-22(IL-22)、白介素-17(IL-17)與可溶性Fas等細胞因子水平。通過空白孔調零,測定每孔450 nm處的吸光度值(OD)。

1.6 腸道菌群測定[8]采用光岡氏腸內細菌群分析法定量測定腸道菌群值及雙歧桿菌與腸桿菌的數量比值(B/E值),取模型組和研究組小鼠各0.5 g糞便,加入滅菌生理鹽水充分振搖做成1︰10的均勻稀釋菌液。取20 μL稀釋菌液接種于腸桿菌、腸球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及梭菌的選擇性培養基中。需氧菌置于37℃普通培養箱培養48 h,厭氧菌置于28℃～37℃厭氧培養箱中培養72 h。參照API細菌鑒定系統(API bacterial identification system)的厭氧菌三級鑒定法鑒定菌種至屬水平,計算各平板的平均菌落數,結果以每克濕糞的菌落形成單位(CFU)的對數值表示,即為菌群值。若B/E>1表示腸道菌群組成正常,若B/E<1表示腸道菌群失調,且B/E比值越低,提示菌群失調越嚴重。

2 結果

2.1各組小鼠排便次數、排便量及體重的比較與空白組比較,模型組平均每日排便次數和排便量明顯增多,體重下降(P<0.05);與模型組比較,研究組每日排便次數和排便量減少,體重上升(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠排便次數、排便量和體重的比較

2.2 各組小鼠結腸組織病理形態表現空白組黏膜形態未見異常,腺體規則分布,各層結構完全且清晰,未見潰瘍與炎性細胞浸潤。模型組黏膜變薄,上皮結構缺失,腺體分布無規則性,固有層顯示充血水腫,伴大量炎癥細胞浸潤及毛細血管充血、淋巴管明顯擴張,彌漫分布小潰瘍;研究組小鼠結腸黏膜病變程度較模型組有所減輕,但部分仍可見淋巴管輕度擴張,伴少量炎癥細胞浸潤,見圖1。

空白組 模型組 研究組

2.3 各組小鼠腸道菌群的變化與空白組比較,模型組和研究組腸桿菌、腸球菌、擬桿菌和梭菌的菌群值顯著升高,B/E值降低(P<0.05);與模型組比較,研究組酵母菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌群值顯著增加,B/E值升高(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群的比較濕糞)

2.4 各組小鼠血液中炎癥因子水平比較與空白組比較,模型組和研究組TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平升高,IL-35與可溶性Fas水平降低(P<0.05);與模型組比較,研究組TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平降低,IL-35和可溶性Fas水平升高(P<0.05),見表3。

3 討論

結腸黏膜連續性炎癥是UC的主要特征[9],但其發病原因尚不完全清楚。FMT是指向患者的腸道內植入健康者糞便內所含的所有菌群,以調控腸道微生態平衡,減輕炎癥反應,幫助修復腸黏膜[10]。因此,FMT作為一類新療法受到廣泛重視。FMT可使UC小鼠腸道菌群結構發生改變,增強有益菌群數量,抑制有害菌群生長。Zhang等[11]研究表明,糞便菌群移植可通過調節腸道菌群,改善Th1/Th2和Th17/Treg失衡以控制實驗性潰瘍性結腸炎。但關于FMT治療UC的免疫學機制研究尚有待深入研究。

本研究探討利用FMT治療DSS所致UC小鼠的效果及相關的免疫學機制。結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠平均每日排便次數和排便量明顯增多,體重下降。提示模型組小鼠腸道發生炎癥侵害,免疫功能受到影響,體重下降。與模型組比較,研究組每日排便次數和排便量減少,體重上升。說明糞菌移植治療后腸道菌群趨于平衡,有益菌成為優勢菌,腸道炎癥改變逐漸減輕,小鼠腸道吸收功能及免疫功能逐步恢復,體重逐步增加。本研究結果顯示,與空白組比較,模型組和研究組小鼠TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平顯著升高,而可溶性Fas與IL-35水平顯著降低。與模型組比較,研究組小鼠TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17水平顯著降低,而可溶性Fas與IL-35水平升高。提示小鼠結腸受到炎癥侵害時TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17等促炎因子表達水平增高,可溶性Fas與IL-35水平等抑炎因子水平降低,炎癥反應劇烈。對小鼠進行FMT治療后,TNF-α、IL-6、IL-22與IL-17等促炎因子水平顯著降低,可溶性Fas與IL-35等抑炎因子水平增高,炎癥反應被控制,提示腸道FMT治療可抑制腸道炎癥反應,穩定腸道免疫[12]。組織病理形態結果顯示,空白組小鼠結腸黏膜形態無異常,腺體規則分布,各層結構完整且清晰,未見潰瘍與炎性細胞浸潤。模型組小鼠結腸黏膜變薄,上皮結構缺失,腺體分布無規則性,固有層顯示充血水腫,可見廣泛的炎癥細胞浸潤、淋巴管明顯擴張和彌漫分布小潰瘍。表明在潰瘍性結腸炎模型中,DSS處理會引起免疫失調和炎癥反應的增強[13]。潰瘍性結腸炎模型的建立導致了結腸組織的病理性損傷,免疫反應失衡及炎癥因子的異常表達[14-15]。

基于以上結論,通過FMT治療UC小鼠。結果顯示,與模型組比較,研究組小鼠結腸黏膜病變程度有所減輕,部分小鼠仍可見輕度的淋巴管擴張,伴有少量的炎癥細胞浸潤。提示糞菌移植可改善潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織病理損傷。在菌群值方面,與空白組比較,模型組和研究組小鼠腸桿菌、腸球菌、擬桿菌和梭菌的菌群值顯著升高,B/E值降低。與模型組比較,研究組小鼠酵母菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌群值顯著升高,B/E值升高。提示糞菌移植可重建腸道菌群,維護腸道微生態平衡,降低潰瘍性結腸炎的炎癥反應[16],促進腸道菌群平衡,且抑制炎癥因子的釋放,促進腸黏膜的修復[17-18]。

綜上所述,FMT能夠改善DSS所致的UC小鼠的結腸組織病理性損傷,抑制TNF-α、IL-6、IL-17與IL-22等促炎因子水平的上調,通過升高IL-35和可溶性Fas等抑炎因子的水平來降低炎癥反應。FMT通過重建腸道微生態平衡、調整和抑制腸道紊亂引起的免疫炎癥反應,穩定腸道免疫以達到治療效果。這為進一步研究UC的免疫學機制提供了新的線索和證據。

(本文編輯： 王艷、 尼麗帕爾·亞熱)