不同劑量腺嘌呤建立脾腎陽虛型慢性腎衰竭大鼠模型的實驗研究

劉 曉, 李 悅, 李靜茹, 陸 蕾, 謝 娜, 朱慧敏, 舒占鈞

(新疆醫科大學1第四臨床醫學院, 2附屬中醫醫院中醫藥臨床研究基地, 烏魯木齊 830099)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)是由各種原因引起的,在原發或繼發腎臟疾病基礎上造成的慢性腎實質損害,我國CKD的患病率約5%～10%,30%～40%的CKD患者在診斷后20年內會發展為慢性腎衰竭(Cronic renal failure,CRF),最終需要接受腎臟替代治療以維持生命質量[1-3]。有研究表明準確、及時、盡早地對CRF患者進行中醫辨證論治,可以有效地改善患者的臨床癥狀及相關指標,延緩CRF進展[4-5]。在眾多實驗模型中,嚙齒類動物被廣泛用于研究腎臟疾病誘發的進展機理以及確定潛在的治療靶點。本研究通過對模型大鼠腎大部分切除法(5/6腎切除法)、單側輸尿管梗阻模型法、阿霉素注射模型法以及腺嘌呤灌胃等多種造模方式進行預實驗并進行比較后,確定腺嘌呤灌胃作為本研究的造模方法。本研究通過腺嘌呤灌胃建立脾腎陽虛型慢性腎衰竭動物模型,驗證腺嘌呤不同劑量灌胃大鼠模型的穩定性和可靠性,通過監測和分析大鼠肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白定量(24-hour urinary protein quantification,24 h-UTP)水平的變化,并結合腎臟病理學檢查,旨在確定腺嘌呤灌胃制備脾腎陽虛型慢性腎衰竭(Chronic kidney disease,CRF)大鼠模型的最佳造模劑量。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SD大鼠24只,體重(220±20)g,由新疆醫科大學實驗動物中心供給。實驗動物飼養及觀察在新疆醫科大學動物實驗中心進行。12 h晝夜循環照明,環境溫度保持在22～26℃,濕度50%～60%,動物自由進食和飲水。動物實驗倫理審批號IACUC-20230217-71。

1.2 造模藥物、試劑腺嘌呤(烏魯木齊經科興業生物科技有限公司,A8626-25 g,純度≥99%);Scr、BUN、24 h-UTP試劑盒(南京建成生物工程研究所,C011-2-1、C013-2-1、C035-2-1);蘇木素染液(福州邁新生物技術開發有限公司,CTS-1097);伊紅染液及中性樹膠(北京中杉金橋生物技術有限公司,ZLI-9613、ZLI-9555);馬松(Masson)染液(南京建成科技有限公司,D026-1)。

1.3 儀器恒溫箱及恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司,DNP-9272、DHG);顯微鏡(Nikon生物顯微鏡,E200);包埋機(普瑞斯星醫療器械有限公司,PBM-B);烤片機(金華市益迪醫療設備有限公司,YD-AB3);切片機、染色機、組織脫水機(Leica公司,RM2235、AUTOSTAINER XL、ASP300S)。

1.4 分組與造模方法24只SD大鼠適應性喂養1周未見不良反應后,按隨機數字表法分為:正常組(n=6)、模型1組(M1組,n=6),模型2組(M2組,n=6)及模型3組(M3組,n=6)。正常組以等量生理鹽水灌胃,將腺嘌呤溶于0.9%Nacl中制備成混懸溶液,根據預實驗劑量,M1組以腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃;M2組以腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1灌胃;M3組以腺嘌呤300 mg·kg-1·d-1灌胃,實驗周期3周。

1.5 標本采集方法各組大鼠每周稱重記錄,于實驗開始后第7天、第14天、第21天放入代謝籠中留取尿液,留尿期間禁食不禁水。記錄24 h尿量,取10 mL,3 000 r/min離心沉淀,取上清液檢測24 h-UTP。實驗開始后第7天、第14天以2%戊巴比妥(25 mg/kg) 腹腔注射麻醉,眼眶取血約1.5 mL,以3 000 r/min離心10 min,分離血清檢測Scr、BUN。3周結束對大鼠進行稱重取材,取材前禁食12 h,禁水4 h。麻醉成功后,腹主動脈取血2 mL,離心后保存待檢測。迅速分切腎臟組織,一半置于4%多聚甲醛進行固定,一半置于凍存管中凍存備用。石蠟包埋后切片、染色,行光鏡病理組織學檢查并攝片。以肉眼和顯微鏡觀察腎臟組織的大體及病理變化。取材結束后斷頸處死大鼠。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 大鼠一般情況 大鼠飲食狀況、精神狀態、反應活動度、毛發光澤、墊料潮濕、二便等情況。每周大鼠稱重,記錄24 h尿量。

1.6.2 BUN、Scr及 24 h-UTP水平 BUN 采用脲酶法,SCr采用苦味酸法,24 h-UTP采用尿蛋白定量試劑盒法。

1.6.3 腎臟組織病理 腎臟組織脫水、透明、包埋、封固、切片后,用蘇木-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察腎臟組織形態改變。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態正常組精神狀態佳,毛色柔順有光澤,拱背、激惹反應明顯,飲食進水及二便皆正常。各模型組大鼠出現不同程度的精神萎靡不振,活動度降低,弓背蜷縮,毛發稀疏無光澤,耳緣及腳趾蒼白發涼,小便頻數,大便稀溏等現象。見圖1。

注: A, 正常組; B, M1組; C, M2組; D, M3組。

2.2 大鼠體重、24 h尿量、Scr、BUN及24 h-UTP水平變化與正常組大鼠比較,各模型組大鼠體重均有不同程度的減輕(P<0.05),造模第2周,與M1組大鼠體重比較,M2組、M3組大鼠差異均有統計學意義(P<0.05)。與正常組大鼠比較,各模型組大鼠24 h尿量明顯增多(P<0.05),Scr、BUN及24 h-UTP水平均升高(P<0.05),且M3組大鼠各指標升高最明顯。各模型組大鼠Scr、BUN及24 h-UTP比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模前、造模后各項指標變化比較

2.3 大鼠死亡情況造模第3周,M3組死亡1只,其余組未出現死亡情況,見表2。

表2 各組大鼠存活率的比較

2.4 大鼠腎臟外觀的比較正常組大鼠雙側腎臟大小適中呈棗紅褐色,無明顯腫大,表面圓潤有光澤,質地柔軟,包膜結合緊密,不易剝離。模型組大鼠較正常組明顯腫大,顏色蒼白,表面凹凸不平,包膜易脫落,腎臟表面有明顯的灰白色顆粒狀,尤其M3組,出現“大白腎”,觸之易碎。見圖2。

注: A, 正常組; B, M1組; C, M2組; D: M3組。

2.5 大鼠腎臟病理損傷情況光鏡觀察下,正常組腎小球結構及數目基本正常,腎小球囊腔、球囊無明顯異常,系膜細胞及內皮細胞無增生,未見腎小管壞死或蛋白管型,腎間質未見纖維組織增生。經腺嘌呤灌胃后,各模型組大鼠的腎臟組織出現不同程度的改變,鏡下見腎小球形態基本完整,腎小球數目稍減少,其中M2組及M3組腎小球數目減少明顯且結構破壞嚴重;部分近腎小管空泡變性嚴重,上皮萎縮,刷狀緣消失,部分腎小管管腔擴張;腎小球內可見大量黃綠色結晶沉淀物,存在腎間質炎性細胞浸潤和纖維組織增生,其中M2組黃綠色結晶沉淀物明顯,M1組及M3組見少量結晶沉淀。見圖3、4。

注:A,正常組;B,M1組;C,M2組;D:M3組。

注:A,正常組;B,M1組;C,M2組;D:M3組。

3 討論

CRF是在各種慢性腎臟疾病的基礎上,引發腎實質受損破壞,出現腎功能減退直至衰竭的疾病[6]。中醫對CRF的認識源于《黃帝內經》,其當屬于“水腫”“癃閉”“腎痿”等病的范疇[7]。CRF 的基本病機為本虛標實[8]。本虛多責之于脾腎兩虛,因外感六淫、情志內傷、飲食失調、久病勞倦等多種病因累及脾腎,如《素問·至真要大論》云:“濕氣大來,土之勝也,寒水受邪,腎病生焉”“諸濕腫滿,皆屬于脾”。標實常歸咎于濁瘀內阻,如《素問·調經論》言:“瘀血不去,其水乃成”。水積之處必是氣滯之所,氣結之地必是瘀血濁毒之鄉。

本實驗中隨著造模劑量增加及時間延長,大鼠畏寒肢冷、蜷縮抱團取暖、小便頻數,大便稀溏及耳緣足部發涼現象越明顯,這些現象皆符合中醫脾腎陽虛證型。正如《素問·上古天真論》:“腎者主水,受五臟六腑之精而藏之,故五臟盛乃能瀉”。若腎陽不足,氣化失常,則水液不能氣化,而見小便清長,夜尿頻多;同時因腎陽不足,命火虛衰,則不能溫煦脾土,運化失職,致大便溏瀉;而腎陽虛衰,溫煦失職,故見畏寒肢冷,蜷臥少動之證。有學者研究證實腺嘌呤所致mTO下游信號的腎臟激活、內質網應激、腎小管損傷、纖維化,其腎臟線粒體功能受損[9]。線粒體為細胞內的負責產生細胞所需能量的重要細胞器,當線粒體功能受損時,細胞無法有效地產生足夠的能量,導致身體各部位的血液循環減弱,從而出現畏寒肢冷等癥狀。

腎間質纖維化是各種原因引起的CKD發展到CRF的共同途徑,以腎小管萎縮、腎小球硬化為主要特征[10-11]。 5/6腎切除法制備CRF模型穩定性強,但模型制備時間較長,需二期手術,容易出血、感染甚至死亡[12];單側輸尿管梗阻模型法制備CRF動物模型可用于研究腎小球硬化,適用于CRF早期研究,但其造模時間較長,常用于急性腎衰竭的模型制備,不符合臨床慢性腎衰竭慢性漸進病程的發病特點,難以模擬人類CKD到CRF的過程[13];阿霉素注射制備CRF模型對多系統具有較強的毒性,模型死亡率高,需要控制阿霉素造模劑量[14]。腺嘌呤灌胃作為一種常見的CRF制備模型,能夠在一定程度上模擬人類慢性腎臟疾病的復雜進展過程。因此本研究確定腺嘌呤灌胃作為造模方法。有研究顯示,大鼠經灌胃腺嘌呤不同劑量后,體內尿酸合成加速,在血中呈過飽和狀態而形成結晶,沉積于腎間質及髓質,刺激局部,引起腎小管間質纖維化,并波及腎小球的廣泛化學炎癥反應連續性破壞病變,最終導致腎功能損害[15]。另有研究報道腺嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用形成極難溶于水的2,8-二羥基腺嘌呤,后者經腎小球濾過,沉積在腎小管,堵塞腎小管腔從而影響氮質化合物的排泄,導致氮質血癥,最終形成腎衰;還可以直接損傷腎小管,引起炎癥和纖維化反應[16]。本實驗結果顯示,腺嘌呤破壞腎臟病理學改變是首先通過結晶沉淀破壞腎小管,而后波及腎小球,腎間質被破壞,最終致腎臟功能受損。本實驗結果顯示,模型大鼠腎臟體積增大,呈現“大白腎”,此腎臟體積變化與實際臨床中CRF腎臟體積萎縮有出入,分析原因可能是2,8-二羥基嘌呤堵塞于腎小管,為腎后梗阻性模型,而臨床上同屬于這一類的梗阻性腎病,其腎臟表現為體積增大和水腫。

CRF動物模型建模成功依據通常有以下幾方面[17]:表觀指標,包括大鼠一般行為狀態、活動情況及24 h尿量等;生化指標,如Scr、BUN、24 h-UTP等;腎臟病理組織指標,如腎小球數量減少、結構破壞,腎小管空泡樣變性,管腔擴張可見蛋白管型,中性粒細胞浸潤等。依據中醫慢性腎衰竭診療指南[18],脾腎陽虛型慢性腎衰竭的中醫辨證主癥:畏寒肢冷;倦怠乏力;氣短懶言;食少納呆;腰酸膝軟。次癥:腰部冷痛;脘腹脹滿;大便不實;夜尿清長。舌淡有齒痕,脈沉弱。本實驗中腺嘌呤灌胃制備脾腎陽虛CRF動物模型,大鼠一般行為狀態符合中醫主癥和次癥,脾腎陽虛型中醫證型吻合度高,實驗中不同劑量的腺嘌呤灌胃大鼠3周后,3組模型組的Scr、BUN及24 h-UTP水平均顯著高于正常組?？紤]M3組死亡率較高且M1組腎臟病理組織改變不明顯,綜合評價各模型組生化指標及腎臟病理結果,認為M2組更接近臨床脾腎陽虛型慢性腎衰竭發展進程,且死亡率較低,符合脾腎陽虛型CRF生理病理學特點。

本實驗建立了制備脾腎陽虛型CRF動物模型的較為穩定的造模方法,但仍有局限之處:如估算腎小球濾過率是反映腎臟病變嚴重程度的一個重要指標,不僅可以反映腎小球的濾過功能,同時也提示腎小管的濃縮功能[19],但是本實驗缺乏估算大鼠腎小球濾過率的方法,因此無法通過腎小球濾過率評估CKD的分期;同時本研究發現,隨著造模時間延長,大鼠麻醉后蘇醒時間隨之延長,推測可能與大鼠腎臟功能受損,致使麻醉藥物在大鼠體內代謝及排泄減緩有關。提示在后期實驗中,需要根據大鼠灌胃濃度及周期適量減少麻醉藥物的配比濃度,或減少麻醉藥物的劑量。

綜上所述,腺嘌呤灌胃建立脾腎陽虛動物模型方法可行,在后續研究藥物干預脾腎陽虛型CRF中具有一定的應用價值。