RIP1、MLKL蛋白在未分化甲狀腺癌中的表達及臨床意義

姜 燕, 郭 越, 王 芳, 張 學, 牛彥斌

(山西白求恩醫院/山西醫學科學院/同濟山西醫院/山西醫科大學第三醫院中心手術部, 太原 030032)

未分化甲狀腺癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)患者生存預后較差[1-2]。迄今為止,還沒有針對此類患者的特異性靶向治療方法。受體相互作用蛋白激酶1(Receptor interacting protein kinase 1,RIP1)是一種跨膜糖蛋白,在多種惡性腫瘤中都存在過表達,是乳腺癌、肝細胞癌、卵巢癌等惡性腫瘤靶向治療的理想候選標志物[3-6]。RIP1在食管鱗癌和乳腺癌中的表達與患者預后不良顯著相關[7]。

混合系激酶區域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)是RIP1激酶的底物,它的磷酸化修飾也標志著細胞壞死復合體的激活[8]。Husain等[9]研究顯示,作為壞死復合體的核心組分,MLKL與程序性細胞壞死的執行密切相關。MLKL在程序性細胞壞死信號通路中的關鍵作用在于其獨特的“膜爆破”機制[10]。在ATC細胞系中,RIP1水平較正常甲狀腺上皮細胞系顯著升高,因此有研究者認為ATC中RIP1的異常表達與更強的侵襲性生物學行為有關[9]。本研究旨在評估ATC中RIP1、MLKL的免疫組化表達,并探討其作為ATC診斷和預后指標的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2010年1月至2019年1月山西白求恩醫院收治的48例ATC患者為研究對象。納入標準:(1)均經術后病例確診為ATC;(2)首次診斷并治療;(3)行手術切除治療;(4)手術標本均包括癌旁組織及癌組織;(5)臨床資料及隨訪資料完整。排除標準:(1)院內或出院后30 d內死亡;(2)隨訪依從性較差;(3)復發性患者。最終48例患者被納入研究,其中男性26例,平均年齡(53.2±13.2)歲,女性22例,平均年齡(55.2±12.2)歲。在電子病歷系統內收集患者臨床資料,包括年齡、性別、T分期、N分期、美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期等。本研究已獲得山西白求恩醫院倫理委員會批準(201901014)。

1.2 免疫組織化學染色從HE染色切片中仔細選擇一個有代表性的腫瘤區域。在二甲苯和梯度乙醇中脫蠟,熱修復抗原,0.3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶,血清孵育阻斷非特異性結合。切片與抗RIP1抗體、抗MLKL抗體共同孵育24 h。將生物素標記的二抗和辣根過氧化物酶標記的親和素與樣品孵育,利用DAB法染色。由兩名醫生對患者切片進行獨立評估。染色強度隨機分為4級:0級(無染色)、1級(弱染色)、2級(中度染色)、3級(強染色),陽性細胞百分率分別為0(0%)、1(1%～30%)、2(31%～50%)、3(>50%)。染色陽性的判定公式為:總積分=陽性百分率分數×強度分數。評分為0～2分記為“陰性”,>2分記為“陽性”。

1.3 隨訪所有患者都通過門診或電話隨訪,術后第1年每3個月隨訪一次,從第2年開始,每6個月隨訪1次,直至患者死亡或研究結束?？傮w生存率(overall survival,OS)被定義為從手術之日到死亡或最后一次隨訪的時間。無病生存期(disease free survival,DFS)定義為:從隨機化開始至疾病復發或(因任何原因)死亡之間的時間。通過影像學檢查診斷術后復發。所有受試者均對本研究知情同意。

1.4 細胞系人未分化型甲狀腺癌 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101細胞系、分化型甲狀腺癌細胞系CAL-62、PDTC-1、正常人甲狀腺細胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3均購于美國典型培養物保藏中心。細胞常規培養在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養液或RPMI1640培養基中,在含5%CO2的37℃培養箱中進行孵育。

1.5 Western blot檢測細胞用放射免疫沉淀測定裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA),4℃,13 000 r/min離心20 min,用二辛可寧酸(bicin choninic acid,BCA)蛋白測定法測定蛋白質含量。然后用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白質,并轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結合90 min。用抗RIP1(1∶2 000)、抗MLKL(1∶1 000)一抗與PVDF膜共同孵育過夜。然后用0.1%的TBST清洗PVDF膜,并與二抗體溝通孵育2 h。ECL化學發光檢測試劑盒檢測特異性蛋白條帶。結果用Quantity One軟件進行量化。

1.6 RT-PCR檢測提取細胞總RNA,合成cDNA。使用用于SYBR Green和7500快速實時聚合酶鏈式反應系統進行實時聚合酶鏈式反應。引進引物序列如下,RIP1:正向5′-TCTGCTGACCTGCT-CCATCTGAC-AAAAC-3′ 和反向5′-GGTGATC-AGTTGTGCTGAGGCTAAT-3′; MLKL: 正向: 5′-ACTGGACCCTGGAAGCACTTTGC-3′和反向5′-GAGTGTTGTACCAGGGGA-3′。所有引物序列均由上海生物工程技術有限公司合成。RT-PCR反應條件如下:95℃預變性10 min,然后95℃變性30 s,50 ℃退火30 s,40個循環,最后70℃延伸10 min結束。

1.7 統計學分析所有數據均采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計數資料采用例(%)表示,組間比較采用卡方檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法,Log-rank檢驗比較生存率差異。將單因素生存分析結果差異有統計學意義的因素納入Cox回歸進行多因素分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 未分化甲狀腺癌細胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA相對表達水平RT-PCR檢測顯示,RIP1 mRNA在正常人甲狀腺細胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3、分化型甲狀腺癌細胞系CAL-62、PDTC-1、人未分化型甲狀腺癌 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101細胞系的相對表達量分別為(1.0±0.1)、(1.2±0.2)、(1.7±0.4)、(1.6±0.3)、(1.9±0.3)、(2.3±0.5)、(2.4±0.4)、(2.7±0.4)、(3.2±0.5),MLKL mRNA的相對表達量分別為(1.0±0.1)、(1.1±0.1)、(1.5±0.2)、(1.8±0.2)、(1.4±0.2)、(1.8±0.3)、(2.3±0.3)、(2.5±0.3)、(2.7±0.3),與正常人甲狀腺細胞系及分化型甲狀腺癌細胞系相比,未分化甲狀腺癌細胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA的相對表達水平明顯更高,見圖1。

圖1 不同細胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA相對表達水平

2.2 未分化甲狀腺癌細胞系中RIP1蛋白、MLKL蛋白相對表達水平Western blot檢測結果顯示,與Nthy-ori 3-1細胞相比,RIP1蛋白在HTORI-3、CAL-62、PDTC-1、 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101細胞系的相對表達量分別為(1.3±0.1)、(1.4±0.1)、(1.1±0.1)、(1.5±0.2)、(1.8±0.3)、(2.7±0.3)、(2.0±0.2)、(1.8±0.2),MLKL蛋白的相對表達量分別為(1.4±0.2)、(1.3±0.1)、(1.0±0.2)、(1.5±0.2)、(1.7±0.2)、(1.9±0.2)、(1.7±0.2)、(1.8±0.3),與正常人甲狀腺細胞系及分化型甲狀腺癌細胞系相比,未分化甲狀腺癌細胞系中RIP1蛋白、MLKL 蛋白的相對表達水平明顯更高。見圖2。

圖2 不同細胞系中RIP1 蛋白、MLKL 蛋白相對表達水平

2.3 ATC組織學特征48例ATC患者中,14例起源于乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、34例起源于濾泡狀甲狀腺癌(follictalar thyroid carcinoma,FTC)。ATCs的組織學特征復雜多變,生長特征可表現為彌漫性實性,多灶性壞死和出血融合區。腫瘤細胞表現出明顯的多形性。形態學特征包括梭形細胞為主的肉瘤樣及鱗狀細胞樣。起源于PTC成分表現為多種組織學變異,起源于FTC成分表現為以微濾泡為主的生長模式,腫瘤細胞核微增厚。見圖3。

圖3 ATC組織學特征(×200,HE染色)

2.4 ATC組織中RIP1的免疫組化染色免疫組化染色顯示,RIP1表達主要定位于ATC細胞膜。48例ATCs中有24例(50.0%)患者RIP1染色陽性,組織中含有混合島狀或低分化癌成分,而癌旁組織中RIP1陽性率為14.6%(7/48)。見圖4。

圖4 RIP1在組織中的表達(×200,SP染色)

2.5 MLKL免疫組化染色MLKL陽性細胞核表達清晰,MLKL表達主要定位于腫瘤細胞膜,在細胞質中也有少量表達。48例ATCs中有29例(60.4%)患者MLKL染色陽性,而癌旁組織中MLKL陽性率為16.7%(8/48)。見圖5。

圖5 MLKL免疫組化染色(×40,SP染色)

2.6 RIP1/MLKL表達對患者總體生存率的影響Kaplan-Meier生存分析顯示,RIP1和MLKL的過度表達對ATC患者的DFS有顯著的消極影響(χ2=14.52,P<0.05;χ2=7.54,P<0.05),但對患者的總體生存期(Overall survival,OS)無明顯影響(χ2=2.74,P=0.152;χ2=1.63,P=0.405)。見圖6。

圖6 RIP1及MLKL表達對患者總體生存率的影響

2.7 影響患者DFS的Cox多因素分析Cox多因素分析顯示,RIP1高表達、MLKL高表達、N分期、M分期均是影響ATC患者DFS獨立危險因素(P<0.05)。見表1。

表1 影響患者DFS的Cox多因素分析

3 討論

ATC是一種罕見但高度惡性的甲狀腺腫瘤,約占所有甲狀腺癌的1.6%,患者5年生存率不足10%[1]。單一治療模式對ATC的作用有限,目前常采用積極的多模式綜合治療,盡管如此,ATC患者從診斷到死亡的平均生存時間仍然僅有6個月左右[2,11]。迄今為止,還沒有針對此類患者的特異性靶向治療方法。

RIP1是一種跨膜蛋白,在多種類型的腫瘤膜上均過表達細胞外結構域,且相對于正常細胞表達增加。一些針對RIP1的治療方法,如抗RIP1抗體和靶向RIP1抗體藥物偶聯物已被開發應用于臨床[12]。Tao等[13]早期臨床試驗已證明,以RIP1為基礎的靶向藥在多種類型腫瘤治療中的安全性和臨床效益均較可靠,包括小細胞肺癌、三陰性乳腺癌和鉑耐藥尿路上皮癌。對于甲狀腺腫瘤,Sakr等[14]研究顯示,RIP1有助于區分甲狀腺良、惡性病變。Kanematsu等[15]一項對組織微陣列進行的研究顯示,90%(54/60)的原發性PTC、3.7%(1/27)的FTCs和21.4%(3/14)的ATC為RIP1陽性。本研究中,多數PTC病例表現為RIP1高表達,因此推測PTC可能會從靶向RIP1治療中受益。此外,本研究結果顯示,50%的ATC中RIP1表達陽性,其中6例表現為彌漫性或局灶性鱗狀分化或鱗狀樣特征。ATC是一種高度侵襲性的惡性腫瘤,目前尚無有效的靶向治療方法。本研究結果表明,RIP1表達上調的ATC患者,可能會從靶向RIP1治療中獲益。特別是具有鱗狀改變的ATC患者,由于RIP1在該ATC亞群中持續高表達,該亞群極可能受益于靶向RIP1治療[16]。RIP1蛋白不僅與腫瘤進展相關,其表達也與腫瘤預后、化療的耐藥密切相關[17]。D′Onofrio等[18]以結直腸癌患者為研究對象,發現與RIP1蛋白低表達患者相比,RIP1蛋白高表達患者普遍有較差的DFS。本研究也有相同發現,且本研究通過Cox多因素分析發現,RIP1高表達是ATC患者DFS的獨立危險因素。

MLKL作為癌癥發生及進展的表觀遺傳改變的標志物,已成為診斷和治療靶點。與正常組織相比,前列腺癌、乳腺癌、腎癌、肺癌、結腸癌以及黑色素瘤的MLKL表達水平較高[19]。Lai等[20]研究發現,相較于結節性甲狀腺腫,PTC中MLKL表達量明顯升高。Desai等[21]研究發現,在ATC中,MLKL水平顯著升高是惡性腫瘤的表觀遺傳標志[10]。本研究發現,ATC中MLKL表達水平明顯升高,提示MLKL可作為一種診斷ATC的生物標記物。Colbert等[22]提出MLKL是早期可切除胰腺癌患者的生物學預后標記物,其中低MLKL組和高MLKL組患者的總體生存時間分別為16個月和6個月,生存差異有統計學意義(P=0.006)。Li等[23]的研究發現,接受輔助化療的結腸癌患者中,高MLKL表達的結腸癌患者同樣提示生存預后不佳。本研究也發現,MLKL高表達是影響ATC患者DFS獨立危險因素。提示MLKL高表達可能是提示ATC患者預后不佳的生物學標記物。

ATC是較為罕見但具侵襲性的甲狀腺癌亞型。本研究結果表明,在未分化甲狀腺癌細胞系及組織中,RIP1、MLKL表達水平均顯著升高,且二者均是影響ATC患者DFS的獨立危險因素,二者或可作為ATC潛在的治療靶點及預后預測的生物學標記物。