大蒜辣素軟膏的體外透皮吸收特性研究

劉 紅, 宋百靈, 馬雪紅, 李新霞

(1新疆醫科大學藥學院, 烏魯木齊 830017; 2伊犁州友誼醫院藥劑科, 新疆 伊寧 839300;3新疆胡蒜研究院(有限公司); 4新疆大蒜藥用研究重點實驗室, 烏魯木齊 830013)

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物的地下鱗莖,具有殺蟲、解毒、消腫、止痢、消食等功效,主要用于腹瀉、痢疾、鼻炎、銀屑病等疾病的治療[1-4]。大蒜辣素(Allicin)是從新鮮大蒜中分離得到的一種含硫化合物,具有多種藥理活性,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、調血脂、降壓、降糖、抗腫瘤、免疫調節等[5-7]。大蒜辣素性質不穩定,易受多種因素影響,在一定程度上限制了其成藥性[8]。皮膚給藥的優點在于避免了消化道對大蒜辣素的代謝。本研究通過建立離體大鼠完整背部皮膚及去角質層皮膚透皮模型,采用超高效液相色譜-質譜-質譜串聯法(UPLC-MS-MS)測定大蒜辣素軟膏皮膚滲透特性,現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀(美國Waters沃特世公司);ACQUITY? TQD型質譜儀(美國沃特世公司);Empower 3型液相工作站(美國沃特世公司);TP-6型智能透皮試驗儀(天津市鑫州科技有限公司);AB135-S型分析天平(美國梅特勒公司);Milli-Q超純水系統,Millipore超純水機(德國默克公司);2-16K型低溫離心機(德國賽多利斯公司)

1.2 試藥蒜氨酸 (新疆胡蒜研究院(有限公司),批號AL080317);蒜酶(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號20171001),羥苯乙酯(中國藥品生物制品檢定所,批號20180324),色譜甲醇(美國Sigma-Aldrich公司,批號180630),色譜乙腈(美國Sigma-Aldrich,批號180331),色譜無水甲酸(天津市福晨化學試劑廠,批號2019013),0.9%氯化鈉注射液(西安京西雙鶴藥業有限公司,批號C20180912),大蒜辣素軟膏(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號20191015);空白軟膏(新疆胡蒜研究院(有限公司),批號20191035)。

1.3 動物SD健康雄性大鼠50只,體重(200±20)g,SPF級,由新疆醫科大學動物實驗中心提供,實驗動物質量合格證號:SCXK(新) 2018-0003。在新疆醫科大學實驗動物中心屏障實驗室飼養,飼養環境溫度(23±2)℃,相對濕度20%～45%。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 大蒜辣素對照溶液的配置 取蒜氨酸對照品溶液和蒜酶溶液混勻,室溫反應后超濾離心,取上清液,即得濃度為0.107 4 mg/mL的大蒜辣素對照溶液。

2.1.2 羥苯乙酯對照品溶液的配置 取羥苯乙酯對照品適量,用50%甲醇溶解并稀釋,搖勻即得濃度為0.200 7 mg/mL的羥苯乙酯對照品溶液。

2.2 色譜與質譜條件色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱溫30℃,進樣量8 μL,流速0.25 mL/min,流動相A為0.1%甲酸,流動相B為甲醇,梯度洗脫,梯度洗脫程序見表1。質譜條件:電噴霧離子化(ESI),正離子,毛細管電壓為3.00 KV,離子源溫度為150℃,脫溶溫度為350℃,氬氣流速為150 L/h,氮氣流速為900 L/h,掃描模式為MRM 模式(多反應離子掃描),定量離子選擇見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 大蒜辣素和羥苯乙酯一級、二級質譜電離碎片離子的分子量

2.3 UPLC-MS-MS方法學驗證

2.3.1 對照溶液的制備 取適量“2.1.1”項下的大蒜辣素對照液和“2.1.2”項下羥苯乙酯對照品溶液,搖勻即得對照溶液。

2.3.2 空白基質軟膏接收液的制備 取空白軟膏適量,均勻涂布于固定在Franz擴散池的大鼠皮膚上,5 h后得空白基質軟膏接收液。

2.3.3 樣品溶液的制備 取大蒜辣素軟膏適量,均勻涂布于固定在Franz擴散池的大鼠皮膚上,5 h后得樣品溶液。

2.3.4 樣品前處理 制備的溶液中加入乙腈500 μL,渦旋混勻2 min,再加入羥苯乙酯對照品溶液50 μL,12 000 r/min離心15 min,取上清液。

2.3.5 專屬性實驗 分別取“2.3.1”、“2.3.2”和“2.3.3”項下的液體經樣品前處理按“2.2”項下色譜質譜條件進樣,采用二級譜,分別對163.00→73.00及167.07→138.88定量離子對進行MRM掃描(圖1)。結果表明,在該色譜質譜條件下空白基質軟膏在兩個通道163.00→73.00大蒜辣素主峰及167.07→138.88內標峰處不出峰,被測物的色譜峰形良好,基線平穩,無雜峰干擾,具有良好的專屬性。

圖1 專屬性考察的MRM色譜圖(注: 1.大蒜辣素 2.羥苯乙酯)

2.3.6 標準曲線的制作 取空白基質軟膏接收液0.5 mL,分別加入不同濃度大蒜辣素溶液50 μL,得到濃度分別為:47.54、475.40、950.80、1 426.00、4 754.00 ng/mL的系列濃度溶液,經樣品前處理后按“2.2”項下色譜質譜條件進樣測定。以大蒜辣素溶液質量濃度為橫坐標(X),大蒜辣素與羥苯乙酯峰面積比值為縱坐標(Y)進行線性回歸,得回歸方程:Y=0.005 2X-0.094 9,r=0.999 8,大蒜辣素在47.54 ～ 4 754.00 ng/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.3.7 定量限與檢測限 取大蒜辣素對照品溶液適量,加入一定量的空白基質軟膏接收液,經樣品前處理后按“2.2”項下色譜質譜條件進樣測定,以S/N≥10,測得大蒜辣素定量限為40.15 ng/mL;S/N≥3,測得大蒜辣素檢測限為18.06 ng/mL。

2.3.8 精密度實驗 取空白基質軟膏接收液0.5 mL,分別加入不同濃度大蒜辣素溶液50 μL,得低、中、高濃度樣品溶液(335.6、657.1、986.1 ng/mL),每種濃度平行制備4份,按“2.2”項色譜質譜條件進樣測定,計算不同濃度的日內RSD值分別2.6%、1.1%、1.6%;每天測定1個分析批,連續測定5 d,計算不同濃度的日間RSD值分別4.1%、2.8%、2.9%,表明儀器的精密度良好。

2.3.9 重復性實驗 取“2.3.4”項下樣品溶液,按“2.2”項色譜質譜條件對每個濃度連續測定6次,計算不同濃度的重復性,RSD值分別2.3%、1.7%、0.99%,表明重復性良好。

2.3.10 樣品穩定性實驗 取“2.3.4”項下樣品溶液,分別置于室溫及0～4℃環境下,于0、2、4、6、8 h按“2.3.1”項下方法處理進樣分析;0～4℃條件下RSD值分別為2.9%、1.5%、1.1%;室溫條件下RSD值分別為8.6%、6.0%、4.9%,表明大蒜辣素樣品溶液在0～4℃條件下較穩定,在室溫下放置8 h后,大蒜辣素樣品溶液RSD值未超過3.0%,表明在8 h內樣品穩定性良好。

2.3.11 加樣回收率實驗 精密量取已知測定含量的樣品9份,分為3組,每組3份,分別加入低、中、高濃度(630.6、432.0、215.7 ng/mL)的大蒜辣素溶液,經樣品前處理后,按“2.2”項下色譜質譜條件進樣,計算回收率。低、中、高3種濃度大蒜辣素的平均回收率分別為90.36%、94.03%、94.54%,RSD分別為1.7%、1.7%、1.4%。

2.4 體外透皮試驗

2.4.1 離體皮膚的制備 (1)完整皮膚的制備:大鼠腹腔注射10%水合氯醛2 mL致死,剔除背部皮膚的鼠毛,剪凈絨毛,剪下大鼠背部皮膚,剝離皮下粘連和脂肪組織,用生理鹽水反復沖洗,剪成適當大小,置于加生理鹽水的密封袋中,-20℃保存,7 d內使用。(2)去角質層皮膚的制備:同法處理皮膚,再用膠帶條將表皮的角質層粘去,得到去角質層的大鼠背部皮膚。

2.4.2 供試品溶液的檢測 取處理好的離體皮膚,自然解凍,用生理鹽水清洗干凈,用濾紙吸干表面水分。將皮膚(完整皮膚、去角質層皮膚)固定于Franz擴散池中。在接收池中加入接收液溶液(生理鹽水)16 mL,池內溫度為 37℃,300 r/min恒溫磁力攪拌,平衡30 min,使皮膚與液面緊密接觸。取大蒜辣素軟膏,精密稱定,均勻涂抹在皮膚表面,分別于0.5、 1、 2、 3、 4、 5 h取出0.5 mL接收液,同時向接收池中補加等體積同溫度的生理鹽水,取出的接收液經樣品前處理后按照“2.2”項下色譜質譜條件進樣分析,計算單位面積累積透皮量(Q)。

圖2 大蒜辣素軟膏的透皮曲線

表3 體外釋藥模型擬合結果

表4 完整皮膚和去角質層皮膚的體外透皮特性(n=5,

3 討論

外用制劑具有不受肝臟首過效應和腸胃道破壞影響、可直達病灶部位的獨特優點,藥物透皮吸收效果直接決定藥效[9]。皮膚是藥物吸收的主要屏障,藥物需透過皮膚屏障到達靶組織發揮藥效。皮膚表面的角質層是親脂性很強的生物膜,藥物的理化性質對經皮吸收能力至關重要。理想的經皮吸收候選藥物要求分子量<600,熔點<200℃,油水分配系數logP在1～3之間[10]。大蒜辣素純品為無色油狀液體,分子量為162.3,油水分配系數logP為1.09,是較理想的候選藥物[11]。

通過對大蒜辣素軟膏在大鼠完整皮膚與去角質層皮膚的透皮特性研究表明,大蒜辣素軟膏具有良好的透皮性能,兩種皮膚性質的透皮吸收規律相似,累計釋藥量與時間線性關系良好,均符合 Higuchi方程,大蒜辣素軟膏在皮膚的吸收機制主要為被動擴散。去角質層皮膚的J遠高于完整皮膚,是完整皮膚的4.74倍,說明藥物經皮吸收速率被皮膚的屏障作用所限制,角質層是影響大蒜辣素透過皮膚的重要因素。本實驗結果表明軟膏的有效成分大蒜辣素以原型形式透過皮膚,發揮藥效作用。課題組對大蒜辣素改善銀屑病樣皮損的研究已取得良好實驗結果[4],而銀屑病、濕疹、特異性皮炎和潰瘍等本身具有皮膚屏障功能損傷,當使用藥物時可能會增加皮膚的吸收能力[12]。

本研究建立 UPLC-MS-MS測定透皮吸收液中大蒜辣素的分析方法,采用多反應離子監測(MRM)模式,經過母離子和子離子的雙重篩選,降低了基質干擾。方法專屬性強,靈敏度高,與課題組前期建立的大蒜辣素含量測定方法相比[13],檢出限提高100倍,為后續生物樣品中大蒜辣素定量分析提供了參考方法。