去氫駱駝蓬堿對細粒棘球蚴中EgTP53蛋白生物信息學表達的影響

林玉霞, 鞏月紅, 朱莉娜, 趙美玲, 潘美馳, 趙一聰, 王建華

(1新疆醫科大學藥學院, 烏魯木齊 830011; 2新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部,3省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室, 烏魯木齊 830054)

囊型包蟲病(Cystic Echinococcosis, CE)是由細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)引起的人畜共患寄生蟲疾病,在我國新疆、青海、寧夏等地為囊型包蟲病高發區,該病流行區人群平均患病率為1.08%[1]。目前WHO推薦的治療CE的藥物為阿苯達唑,但該藥物吸收性差、治愈率低、復發率較高[2]。本課題組前期研究發現多年生草本蒺藜科植物駱駝蓬種子提取物中的去氫駱駝蓬堿(Harmine, HM)具有良好的抗包蟲療效,但因其具有神經系統毒性一直未應用于臨床[3]。因此明確HM及其衍生物的抗囊型包蟲作用機制和作用靶點是提高藥物療效的關鍵。TP53為核糖核酸結合蛋白家族中一種腫瘤抑制蛋白,在大多數人體腫瘤組織中都能觀察到TP53突變或失活[4-5]。TP53是一個巨大蛋白質網絡中心,允許多種信號整合,當細胞受到DNA損傷時,會導致該網絡的激活,激活后TP53結合啟動子區域的特定DNA共識序列,刺激相應靶基因的轉錄,這些基因產物負責誘導DNA修復機制,如果修復不成功,則誘導程序性細胞死亡[6-8]。TP53在DNA損傷通路中的關鍵作用,成為藥物和疫苗開發的熱點。本研究利用生物信息學技術對細粒棘球蚴中TP53(EgTP53)的蛋白結構和功能進行分析,檢測HM對EgTP53蛋白表達的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細粒棘球蚴收集從綿羊的肝臟包囊中采集細粒棘球蚴原頭節,用含有2%青鏈霉素(雙抗)的無菌生理鹽水進行沖洗,添加RPMI1640培養基,得到含有原頭蚴的混懸液,其中原頭蚴的活性維持在95%以上。

1.2 儀器與試劑胎牛血清(美國Gibco公司),青鏈霉素(美國 Hyclone公司),總RNA提取試劑和反轉錄試劑盒(Takara生物技術有限公司),Trizol試劑(美國Invitrogen公司),PCR反應試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司),HM(新疆華世丹藥物研究所),實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher scientific公司),細胞培養箱(Thermo Fisher scientific公司)。

1.3 HM與EgTP53蛋白分子對接驗證采用TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) 數據庫獲取HM的MOL2格式文件,從PDB( https://www.rcsb.org/)數據庫中檢索EgTP53蛋白的3D結構,使用AutoDock Vina軟件進行分子對接,獲得相互作用中結合能最低的模型,將其模型經Pymol軟件進行可視化處理。當對接能量小于0時,認為配體與受體之間具有強烈的結合活性。

1.4 EgTP53蛋白的生物信息學分析

1.4.1 EgTP53蛋白理化性質預測及親疏水性分析 從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得登錄號Gene ID:3633851,通過Protparam蛋白分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)對EgTP53蛋白理化性質進行預測。當不穩定指數大于40時,蛋白質被認為是相對不穩定的[8]。通過生信在線軟件工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)評估EgTP53蛋白親疏水性,平均疏水指數正值表示相對疏水性,負值表示相對親水性。

1.4.2 EgTP53蛋白跨膜區結構預測與信號肽分析 采用SignalP5.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對EgTP53蛋白進行信號肽預測,以確定其是否含有信號肽序列。通過生物學在線軟件工具TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析EgTP53蛋白存在的跨膜區域。

1.4.3 EgTP53蛋白二級結構和三級結構分析 使用SOPMA在線軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析EgTP53蛋白二級結構和可溶性區域預測。使用SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/)對EgTP53蛋白進行同源建模,預測EgTP53蛋白三級結構。

1.4.4 預測EgTP53蛋白磷酸化位點及結構域 使用在線軟件NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預測EgTP53蛋白存在的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點。通過Conserved Domain Database(CDD)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)分析EgTP53蛋白結構域。

1.4.5 EgTP53B細胞抗原表位的測定 使用IEDB在線軟件(https://www.iedb.org/)分析EgTP53蛋白B細胞抗原表位,得出易形成抗原表位的區域。

1.4.6 EgTP53蛋白系統進化關系 登錄NCBI的蛋白質數據庫,獲得不同種屬EgTP53蛋白的氨基酸序列,使用MEGA6.0軟件對EgTP53蛋白和其他物種的TP53蛋白序列構建系統發育樹并進行分析。

1.5 去氫駱駝蓬堿對EgTP53蛋白表達檢測取“1.1”項下的細粒棘球蚴,隨機分為3組,每組3份,按照密度3 000頭/孔分別加入24孔培養板中,分別加PBS緩沖液,1% DMSO,100 μmol/L HM干預24 h,收集細粒棘球蚴樣本,用PBS清洗,采用Trizol溶液提取各樣本總RNA,將RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,按Takara試劑盒說明書方法將RNA逆轉錄成cDNA,引物信息見表1。準備模板DNA、配置PCR反應液、進行PCR反應,測定各組的EgTP53蛋白mRNA 表達水平。以β-actin為內參。每組實驗重復3次,采用2-△△Ct方法計算各組EgTP53蛋白的相對表達水平。

表1 EgTP53蛋白及內參引物信息

2 結果

2.1 EgTP53蛋白與HM的對接結果使用AutoDock Vina 軟件對EgTP53蛋白與HM進行分子對接,結果顯示結合能為-4.44 kcal/mol。對接結果模型運用Pymol軟件進行可視化,對接結果顯示HM與EgTP53蛋白有較好的結合,見圖1。

圖1 EgTP53蛋白與HM的分子對接位點圖

2.2 EgTP53蛋白的理化性質及親疏水性分析EgTP53蛋白的相對分子量:121 799.11,等電點:9.29,氨基酸數量1 108,帶正電殘基:139,帶負電殘基:118,原子總數:17 183。不穩定指數:59.19,表明EgTP53蛋白為不穩定蛋白。脂肪族氨基酸指數:82.17。含有多個親水性較高的區域,其平均疏水指數為-0.347,判斷EgTP53g蛋白屬于親水性蛋白,見圖2。

(注: 正值表示疏水性,負值表示親水性)

2.3 EgTP53蛋白信號肽與跨膜區域經Netphos3.1在線軟件預測EgTP53蛋白的信號肽Sec/SPI:0.000 6,無信號肽裂解位點和跨膜區域,見圖3。表明EgTP53蛋白為非分泌性、非膜質的蛋白,在細胞內部發揮調控基因表達或者參與信號傳導等重要功能。

圖3 EgTP53蛋白的跨膜區域預測圖

2.4 EgTP53蛋白的磷酸化位點及結合域EgTP53蛋白有105個絲氨酸磷酸化位點, 63個蘇氨酸磷酸化位點,7個酪氨酸磷酸化位點,見圖4。通過CDD數據庫分析EgTP53蛋白的結構域中存在TUDOR蛋白結構域,位于第391至441個氨基酸之間;存在2個BRCT保守蛋白結構域,一個位于第824至907個氨基酸之間,另一個位于第1 037至1 095個氨基酸之間,見圖5。

圖4 EgTP53蛋白磷酸化位點預測圖

圖5 EgTP53蛋白結構域圖

2.5 EgTP53蛋白的二級結構及三級結構預測分析采用SOMPA平臺分析 EgTP53蛋白二級結構:α螺旋占30.05%,β折疊占17.51%,β轉角占4.69%,無規則卷曲占47.75%,見圖6。運用SWISSMODEL在線程序構建的EgTP53蛋白三級結構見圖7,與模板序列同源性為99.91%,GMQE 得分為0.50。

圖6 EgTP53蛋白的二級結構圖

圖7 EgTP53蛋白三級結構圖

2.6 EgTP53蛋白的B細胞抗原表位預測IEDB在線預測軟件預測EgTP53蛋白主要的細胞抗原表位在:5-36、42-61、67-99、101-124、133-146、151-224、227-227、229-251、261-295、320-387、401-417、423-432、442-484、494-499、505-667、682-787、797-823、838-868、891-896、912-921、931-936、949-969、975-981、988-991、1003-1008、1021-1055、1064-1080、1096-1105位置存在氨基酸。

2.7 EgTP53的系統進化通過MEGA6.0軟件構建TP53系統進化樹,分析不同種屬TP53之間的系統發育關系,見圖8。EgTP53蛋白具有多個分支,EgTP53蛋白與亞洲帶絳蟲病(VDK41028.1:28-1014)、帶狀泡尾絳蟲(VDM33434.1:1-1099)同屬一個分支,相似性接近83%,與長膜帶絳蟲(VUZ428752.1:95-732)、矮小齒殼絳蟲(VDN96517.1:131-750)、微口膜殼絳蟲(CDS26543.1:788-1424)同屬絳蟲綱,進化關系較近,相似性接近78%,與人親緣性較遠。

圖8 EgTP53蛋白和其他物種TP53蛋白系統進化樹圖

2.8 去氫駱駝蓬堿對EgTP53 蛋白表達的影響用構建的qRT-PCR反應體系檢測EgTP53蛋白的表達量,與空白對照組和1%DMSO組相比,HM組EgTP53蛋白表達量顯著上升,見圖9。

圖9 EgTP53蛋白的表達結果圖

3 討論

TP53蛋白是一種核糖核酸結合蛋白,通常位于細胞核內,與DNA發生直接的相互作用[9]。它在細胞中以單體形式存在,但在響應特定信號或損傷時,可以形成二聚體或四聚體,以激活或抑制其調控作用[10]。研究表明,細粒棘球蚴感染可導致宿主肝細胞中TP53的活性增加,提示TP53 在Eg的生長發育過程中起到重要作用[11]。EgTP53的磷酸化位點比較多,多個磷酸化位點反映了蛋白質在細胞信號傳導途徑中的重要性,有助于EgTP53蛋白在不同的細胞狀態和環境中進行適應性調整。

EgTP53蛋白的N末端區域缺少傳統的轉錄激活域,這一區域是哺乳動物p53在調控轉錄和介導DNA損傷反應中非常重要的結構域[12]。EgTP53蛋白主要由β轉角和無規則卷曲構成,表明它具有一定的柔性和可塑性,在多個生物過程中發揮作用,具有多功能性,容易改變細粒棘球蚴在寄生過程中的不同環境和生物學要求。EgTP53蛋白含有多個B細胞抗原表位,表明EgTP53蛋白在細粒棘球蚴的免疫系統中引起免疫應答的潛力較高。這些抗原位點通常是蛋白質上的特定區域,可以與免疫系統中的B細胞受體相互作用,引發抗體產生[13]。這對細粒棘球蟲的寄生能力和繁殖產生一定的影響,同時也為開發相關的診斷和治療方法提供一定的線索和參考。多重序列比對分析提示EgTP53蛋白與人親緣性較遠,根據其特征設計藥物更容易成為治療靶點[14-15]。

本研究通過實時熒光定量PCR技術檢測EgTP53蛋白在HM處理后的表達水平升高,這表明EgTP53蛋白的活性得到了增強。通常情況下,TP53蛋白在細胞受到損傷或壓力時會被激活,從而協調細胞的應激響應,包括但不限于DNA修復、細胞周期控制以及凋亡等細胞保護機制的調控[16-17]。TP53通常是對DNA損傷的響應者,本研究提示HM通過引發一系列細胞應激響應,導致EgTP53蛋白活性增強。

EgTP53蛋白結構域中存在TUDOR蛋白結合域和兩個BRCT蛋白結合域。在DNA損傷修復過程中,TUDOR蛋白通常與甲基化的組蛋白或其他染色質結構相關蛋白發生相互作用并且通過與甲基化的DNA結合來調控DNA損傷信號的傳遞[18]。TDRD3是一種TUDOR蛋白,可以與甲基化的組蛋白H3K9me3結合,參與DNA單鏈斷裂的修復。此外,TUDOR蛋白還可以與DNA損傷響應信號途徑中的其他關鍵蛋白,如ATM、ATR和53BP1等發生相互作用,調節DNA損傷信號的傳遞和DNA損傷修復過程[19]。TUDOR蛋白還可以通過參與非同源末端連接途徑來進行DNA損傷修復。Tudor-SN蛋白是一種TUDOR蛋白,在非同源末端連接途徑過程中發揮作用,調節DNA損傷修復酶DNA-PKcs的磷酸化狀態,促進DNA損傷修復的進行[20]。BRCT結構域是一種常見的蛋白結構域,與DNA損傷修復和細胞周期調控等生物學過程密切相關。BRCA1蛋白可以與DNA雙鏈斷裂修復途徑的其他蛋白如BRCA2、RAD51和PALB2等發生相互作用,形成蛋白復合物,參與DNA損傷的修復和同源重組的過程[21-22]。BRCA1蛋白可以與核孔復合物發生相互作用,使DNA雙鏈斷裂的修復可以進行到核內,有效地維持基因組的穩定性。BRCA1蛋白可以調控細胞周期及進行DNA信號的傳導。當細胞受到DNA損傷后,BRCA1蛋白可以激活ATM和ATR等激酶,進而激活CHK1和CHK2等效應蛋白,抑制細胞周期的進程,使細胞有足夠的時間進行DNA損傷的修復。有研究表明,BRCA1蛋白在治療乳腺癌等腫瘤中具有一定的作用[23-25]。因此,基于TUDOR蛋白和BRCA1蛋白在DNA損傷修復和細胞周期調控中的作用,可以考慮使用TUDOR蛋白和BRCA1蛋白作為治療細粒棘球蚴相關疾病的新策略,開發針對EgTP53-BRCT-BRCT結構域的靶向藥物或基因治療方法,以達到更好的治療效果。

綜上所述,EgTP53在細粒棘球蚴的生長中扮演著重要的調控角色,DNA損傷通路參與了HM及其衍生物誘導細粒棘球蚴死亡的過程,為深入了解Eg的致病機制,發現新的治療包蟲病藥物靶點奠定了基礎。