基于HPLC指紋圖譜結合化學模式識別對葡萄醋的質量評價

戴麗莉, 李曉娟, 趙翡翠

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部, 烏魯木齊 830002; 2新疆維吾爾自治區中藥炮制重點實驗室, 烏魯木齊 830000)

葡萄醋是一種以葡萄為主要原料,利用傳統壓榨發酵技術釀造、富有新疆地域特色的民族藥和傳統炮制輔料[1-2],具有清熱燥濕、退燒、消炎、止瀉、解毒、化淤血、止痛、驅蟲等功效[3-4],主要用于制備蜜膏劑、合劑、糖漿劑等。新疆地區葡萄資源豐富,但目前為止葡萄醋還沒有法定質量標準,其中的特征成分研究基礎薄弱,基于葡萄醋方面的藥用開發利用受限。因此,本研究收集不同產地15批葡萄醋樣品,通過高效液相測定葡萄醋中有機酸成分的含量,建立葡萄醋中有機酸成分指紋圖譜[5-7],并結合化學模式識別[8-9]篩選葡萄醋質量差異的標志物,對不同產地葡萄醋的質量進行評價,為臨床應用提供參考,同時為制定葡萄醋合理質量控制方法提供研究數據,為后續進一步研究其葡萄醋炮制發酵機制奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器1525型高效液相色譜儀(含2489 型PAD 檢測器,Empower Pro 工作站,美國Waters 公司), Centra-20 型紫外-可見分光光度計(GBC 科學儀器有限公司), AG-135 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫療儀器有限公司),電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)。

1.2 試藥酒石酸對照品(批號B25642, 質量分數≥98%)、蘋果酸對照品(批號B20524, 質量分數≥98%)、琥珀酸對照品(批號B20534, 質量分數≥98%)、富馬酸對照品(批號B20937, 質量分數≥98%)、綠原酸對照品(批號B20132, 質量分數≥98%)、乙酸對照品(批號B20236, 質量分數≥98%)均購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。15批不同產地的葡萄醋樣品,來源于新疆不同地區,見表1。

表1 15批葡萄醋來源信息

2 方法與結果

2.1 葡萄醋中有機酸含量測定方法學考察

2.1.1 色譜條件[10-11]XTerra C18色譜柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm);填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相: 甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99, 選擇紫外光檢測器, 檢測波長為210 nm, 進樣量: 10 μL,理論塔板數不少于5 000。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸、乙酸對照品0.1 g,加入超純水配置成每1 mL含1 mg混合對照品溶液。見圖1。

注: 橫坐標, 出峰時間; 縱坐標, 峰面積。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流動相置于分液漏斗中,搖勻,靜置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,搖勻萃取,靜置分層,反復5次,收集上層濾液約75 mL,將濾液旋轉蒸發置干,再于蒸干的圓底燒瓶中加入10mL已經濾過的超純水,靜置10 min,再通過0.22 μm的微孔濾膜,即可得到供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取葡萄醋供試品溶液,對照混合對照品溶液,按色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的相對標準偏差(RSD)分別為1.31%、1.80%、0.81%、2.65%、3.43%和2.44%(n=6),結果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重現性試驗 精密量取葡萄醋供試品溶液6份,按制備方法進行制備后進樣,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的RSD分別為1.38%、 0.28%、 0.39%、 0.17%、 0.85%和0.30%(n=6),結果表明本方法的重現性較好。

2.1.6 穩定性試驗 取葡萄醋供試品溶液,按制備方法進行制備,分別在0,4,8,14,20,24 h進樣分析,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的RSD分別為2.86%、1.10%、0.97%、1.13%、0.48%和3.77%(n=6),結果表明供試品溶液在24小時內穩定性良好。

2.1.7 加樣回收試驗 采用加樣回收法,精密量取葡萄醋供試品溶液10 mL,共6份,精密加入每1 mL含酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸、乙酸0.5 mg的對照品的溶液10 mL,按供試品制備方法制備溶液,按色譜條件進行測定,計算加樣回收率,結果混合對照品平均回收率分別為100.91%,99.61%,101.72%,100.33%,100.86%,98.74%,RSD分別為0.99%、1.77%、1.56%、1.10%、1.27%、1.67%,表明回收率良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價取15批葡萄醋樣品,按“2.1.1”項下的色譜條件分別進行測定,記錄峰面積并計算各共有峰的保留時間和峰面積。將測出的15個圖譜數據全部導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版)[12-13],以R色譜圖作為參照圖譜,經多點校正后,生成葡萄醋的色譜疊加圖和對照指紋圖譜,并進行相似度評價。15批葡萄醋樣品的指紋圖譜[14-16]共有峰有11個,通過與混合對照品色譜峰進行比對,指認出6個共有峰[17-18],分別是酒石酸(1號峰),蘋果酸(2號峰),琥珀酸(3號峰),富馬酸(4號峰),綠原酸(9號峰),乙酸(11號峰)。研究發現葡萄醋中琥珀酸的含量較高,出峰時間相對適中,且峰型穩定,差異較小,分離度較好,故將琥珀酸作為對照峰,計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為1.31%～2.00% (n=15)和 83.78%～225.71%(n=15),15批葡萄醋樣品中各成分之間含量差異較大。相似度評價[19]結果表明新疆新綠寶藥業、新疆麥迪森藥業等飲片生產企業出售的葡萄醋相似度均大于0.900,其余自制葡萄醋樣品的相似度均小于0.900,且不同批次葡萄醋樣品之間相似度相差較大,表明不同地方生產的不同批次葡萄醋中化合物含量存在差異。疊加指紋圖譜見圖2,對照指紋圖譜見圖3。

注: 橫坐標, 出峰時間; 縱坐標, 峰面積。

圖3 樣品的 HPLC對照指紋圖譜

2.3 基于化學模式識別對葡萄醋的分析

2.3.1 聚類分析 以15批葡萄醋樣品的共有峰峰面積為變量,用SPSS 26.0統計軟件,以組間平方歐氏距離為測度進行聚類分析[20-21]:當類間距離為25時,15批葡萄醋樣品可聚為2類,S1-S5、S7-S12、S14、S15聚為Ⅰ類,Ⅰ類又可聚為2類,S2、S8和S11聚為Ⅰa類,S1、S3-S5、S7、S9、S10、S12、S14、S15聚為Ⅰb類;S6、S13聚為Ⅱ類,結果表明15批葡萄醋樣品中各個化合物之間含量差異較大,即使是同一飲片生產企業生產的不同批次葡萄醋其含量差異也較大,與相似度評價結果一致。見圖4。

圖4 15批葡萄醋樣品聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析 將15批葡萄醋樣品中11個共有峰對峰面積作折線圖,結果顯示葡萄醋樣品共有峰的峰面積數據擬合度較小,樣本組間差異較大,故采用無監督的主成分分析方法[22-25],使用的分析軟件為 SPSS 26.0。見圖5。

圖5 15批葡萄醋樣品峰面積折線圖

利用 SPSS 26.0 軟件,對15 批葡萄醋樣品指紋圖譜中 11 個共有峰峰面積進行標準化處理,再通過主成分分析法進行因子分析,以特征值>1 為提取標準,總方差結果顯示,共提取到4個主成分,前4種主成分的累積方差貢獻率為90.968% ,表明這4種主成分能較好地揭示葡萄醋來源與11種共有成分的相關性,反映出葡萄醋指紋圖譜中共有峰的大部分信息,見表2。

表2 葡萄醋樣品的主成分結果

由主成分矩陣可知,第1主成分中,峰 2(蘋果酸)、3(琥珀酸)、5、6、9(綠原酸)有較大載荷值;第2主成分中,峰8、10、11(乙酸)有較大載荷值;第3主成分中,峰 4(富馬酸)有較大載荷值。峰的載荷值與峰對主成分的貢獻成正比,結果顯示葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種主成分共同的影響。見表3。

表3 15 批葡萄醋樣品主成分矩陣

結合碎石圖可知,當折線由陡峭突然變得平穩時,陡峭到平穩對應的因子個數即為參考提取因子個數,從第4個主成分開始,主成分的特征分值開始緩慢地下降,且前4種主成分的累積方差貢獻率達到 90%以上,因此,再次證明葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種主成分共同的影響。見圖6。

圖6 15批葡萄醋樣品PCA碎石圖

2.3.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 運用SIMCA14. 0 統計學軟件,以11個共有峰的峰面積為變量,繪制 PLS-DA 得分圖[26-28],可以看出,S13、S7分布于得分圖的左上側,S3、S9、S11分布于得分圖的左下側,S4、S10、S14、S15分布于得分圖的右上側,S1、S2、S5、S6、S8、S12分布于得分圖的右下側,表明15批葡萄醋樣品中共有峰化合物之間含量存在差異。見圖7。

圖7 15 批葡萄醋樣品PLS-DA得分圖

根據變量權重要性排序(VIP)可知,7號峰的VIP 值為1.422 68、3號峰(琥珀酸)的VIP 值為1.348 91、9號峰的VIP值為1.120 09 、4號峰(富馬酸)的VIP值為1.042 15,表明篩選出的7、3、9、4號峰可作為鑒別和區分葡萄醋質量差異的標志物,其中包括共有峰3號峰(琥珀酸)、4號峰(富馬酸),因琥珀酸較穩定,故將琥珀酸作為葡萄醋的特征鑒別成分,并對琥珀酸進行含量測定。見圖8。

圖8 PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 葡萄醋樣品中琥珀酸含量測定

3.1 色譜條件同“2.1.1”色譜條件。

3.2 供試品溶液的制備精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流動相置于分液漏斗中,搖勻,靜置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,搖勻萃取,靜置分層,反復5次,收集上層濾液約75 mL,將濾液旋轉蒸發置干,再于蒸干的圓底燒瓶中加入10 mL已經濾過的超純水,靜置10 min,通過0.22 μm的微孔濾膜,即得到供試品溶液。

3.3 對照品溶液的制備精密稱取琥珀酸對照品10.05 mg,加入超純水配置成每1 mL含1 mg對照品的溶液。

3.4 線性關系考察精密稱量0.016 g琥珀酸于10 mL量瓶中,超純水溶解,定容至刻度線,作為儲備液。精密提取琥珀酸儲備液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mL,超純水定容至刻度線,測定峰面積。以琥珀酸進樣量(X)為橫坐標。以峰面積積分值(Y)為縱坐標,繪制標準曲線得到琥珀酸標品的回歸方程Y=560 965X+7 334.8,R2=0.999 7;結果表明琥珀酸濃度在0.05～1.6 mg/mL,呈良好的線性關系[29-30]。

3.5 精密度試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液,按色譜條件重復進樣6次,計算琥珀酸峰面積的RSD為1.82%,表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液6份,按色譜條件進樣,計算琥珀酸峰面積的RSD為1.88%,表明本方法重復性良好。

3.7 穩定性試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液,分別在0、6、12、18、24、48 h進樣,按色譜條件進樣,計算琥珀酸峰面積的RSD值為2.27%,說明樣品溶液在48 h內保持穩定[31]。

3.8 回收率試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液6份,每份10 mL,加入琥珀酸0.35 mg,按色譜條件測定,計算加樣回收率[32]得到RSD值為1.14%,見表4。

表4 琥珀酸加樣回收率結果

3.9 含量測定取15批葡萄醋樣品按“3.2”項下方法制備葡萄醋供試品溶液,按色譜條件進樣,測得不同批次樣品的峰面積,計算含量,見表5。

表5 15批葡萄醋樣品中琥珀酸含量

4 討論

4.1 色譜條件的考察葡萄生長環境、品種、采收時間及釀制時間影響著葡萄醋的質量。據查閱大量參考文獻[33-35]發現,葡萄醋主要含有多種有機酸,有機酸不僅影響著葡萄醋的感官特性和穩定性,還決定著葡萄醋的酸味質量,所以是葡萄醋中一類重要的有機化合物。

通過前期研究對流動相(乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-磷酸氫二鈉緩沖溶液),柱溫(20℃、25℃、30℃),供試品前處理的提取溶劑考察(甲醇、50%甲醇、石油醚(60～90℃),流速(0.8、1.0、1.2 mL/min ),以琥珀酸的峰面積、分離度、峰性狀為衡量標準,篩選最優條件,最終確定流動相為甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99,檢測波長為210 nm,柱溫為25℃,流速為1.0 mL/min 。

4.2 建立葡萄醋中有機酸成分的HPLC特征圖譜前期預試驗發現葡萄醋成品中以有機酸為主,故采用高效液相法,以有機酸含量為主要測定指標,建立了15批葡萄醋中有機酸含量成分的HPLC指紋圖譜,標定了11個共有峰;通過與對照品溶液峰面積進行比對,確認了6個共有峰,分別是酒石酸(1號峰),蘋果酸(2號峰),琥珀酸(3號峰),富馬酸(4號峰),綠原酸(9號峰),乙酸(11號峰),以琥珀酸為對照峰計算共有峰相對保留時間和相對峰面積,通過計算相似度表明不同地方生產的葡萄醋中共有峰成分含量存在一定差異。

4.3 葡萄醋含量差異分析通過聚類分析將不同產地的15批葡萄醋可以聚為2大類,與主成分分析結果一致,主成分分析表明結果顯示造成葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種成分共同影響的,且15批葡萄醋中共有化合物含量差異大。葡萄醋在全疆作為維吾爾藥、炮制輔料和發酵食品均在使用,但是沒有明確的質量標準和炮制工藝,其發酵機制中參數沒有統一標準。

因此,通過建立葡萄醋中有機酸成分指紋圖譜,并結合化學模式識別篩選葡萄醋質量差異的標志物,對不同產地葡萄醋的質量進行評價,為臨床應用提供參考,同時為制定葡萄醋合理質量控制方法提供研究數據,為后續進一步研究其葡萄醋炮制發酵機制奠定基礎。