基于PD-1/PD-L1 信號通路探討麥門冬湯對特發性肺纖維化小鼠的影響

徐夢真，劉傳國，鞏麗麗，陳海紅，王 棟，朱慶均，3?

（1.山東中醫藥大學中醫藥創新研究院，山東 濟南 250355； 2.山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355； 3.教育部中醫藥經典理論研究重點實驗室，山東 濟南 250355； 4.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355）

肺纖維化是以彌漫性非特異性肺泡炎癥伴間質性纖維化為基本病變的一類疾病，以特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF） 發病率最高，預后最差，確診患者中位生存期僅3 ～5 年［1］。流行病學調查顯示，全球IPF 發病率和流行率呈逐年上升趨勢［2］。吡非尼酮（Pirfenidone） 和尼達尼布（Nintedanib） 作為特異性治療IPF 的藥物，不能完全阻止或逆轉IPF［3-4］。肺移植是徹底治療IPF的有效方法，但移植后中位生存期僅為4.5 年［5］。程序性死亡受體1 （programmed death 1，PD-1） 作為重要的免疫檢查點，與IPF 的發生發展密切相關［6-7］。研究表明，IPF 患者CD4＋T 細胞的PD-1表達顯著增加，過表達PD-1 的CD4＋T 細胞通過影響信號傳導與轉錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 的活性而增加白細胞介素-17A （interleukin-17A，IL-17A） 與轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 的釋放，導致IPF 癥狀加重［7-8］。

中醫學通常將肺纖維化歸屬于肺痿［9］。對現代名老中醫治療肺痿方藥規律進行研究，結果表明麥門冬湯使用頻率排在首位［10］。麥門冬湯有抗炎、改善呼吸道過敏、氣道清除和抑制其分泌作用［11］。除此之外，麥門冬湯還可以減輕IPF 模型動物肺泡炎和肺纖維化程度，改善模型動物肺功能指標［12-13］。本研究選擇麥門冬湯干預博來霉素（bleomycin，BLM） 誘導的C57BL/6J 小鼠IPF 模型，通過HE 和Masson 染色、ELISA、流式細胞術和免疫組織化學等方法，基于STAT3/PD-1/PD-L1信號通路探討麥門冬湯對IPF 的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，體質重（20±2） g，6 ～8 周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （魯）2019-0003］，飼養于山東中醫藥大學，12 h/12 h晝夜交替，普通標準小鼠飼料喂養，自由進水攝食，適應性飼養1 周。本研究符合山東中醫藥大學動物倫理委員會要求 （ 倫理號 SDUTCM 20200529001）。

1.2 藥物 麥門冬湯由麥冬（批號1901060383）、半夏（批號190501）、甘草（1903110042）、人參（批號181217）、粳米、大棗組成，藥材購自山東省中醫院，經山東中醫藥大學李峰教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典》 標準。鹽酸博來霉素由日本化藥株式會社生產，批號650472； 吡非尼酮由北京康蒂尼藥業股份有限公司生產，批號150617。

1.3 試劑 小鼠I 型膠原蛋白（collagen type I，Collagen I）、羥脯氨酸 （hydroxyproline，HYP）、TGF-β1 ELISA 試劑盒（批號CSB-E08083m、CSBE08839m、CSB-E04726m） 購自武漢華美生物工程有限公司； FITC anti-mouse CD3、APC anti-mouse CD279、PE anti-mouse CD4 （ 批號 B303301、B330786、B307558） 購自深圳市達科為生物技術股份有限公司； PD-1/CD279、PD-L1/CD274 多克隆抗體（批號18106-1-AP、17952-1-AP） 購自美國Proteintech 公司； Anti-IL-17A Rabbit pAb （批號GB11110） 購自武漢賽維爾生物科技有限公司；phospho-STAT3 （Ser727） 抗體 （批號bs-3429R）購自北京博奧森生物技術有限公司。

2 方法

2.1 麥門冬湯制備 取麥冬420 g、半夏60 g、甘草60 g、人參90 g、粳米100 g、大棗120 枚，加1.5 倍量蒸餾水浸潤藥材30 min，加5 倍量蒸餾水先用武火煮沸后改用文火保持微沸30 min，過濾，濾渣加6 倍量蒸餾水武火煎煮至沸騰，文火保持微沸30 min，過濾，合并濾液，濃縮至生藥量0.9 g/mL，即得。

2.2 造模、分組及給藥 手術切開胸腔，氣管內注射鹽酸博來霉素溶液（3.5 mg/kg） 構建IPF 小鼠模型，對照組氣管內注射生理鹽水。將造模小鼠隨機分為模型組、吡非尼酮組和麥門冬湯高、中、低劑量組，每組6 只，并隨機選取同一批次的正常小鼠6 只作為對照組。依據《藥理學實驗方法學（第三版） 》 中人與實驗用小鼠（20 g） 體表面積比例為0.002 6 計算，則每只小鼠的灌胃等效劑量為9 g/kg。造模成功后第2 天開始灌胃給藥，對照組和模型組給予生理鹽水，吡非尼酮組給予0.3 g/kg吡非尼酮，麥門冬湯低、中、高劑量組給予4.5、9、18 g/kg 麥門冬湯，每天1 次。在給藥第28 天，處死小鼠并取材，進行指標檢測。

2.3 小鼠體質量和肺系數變化 在灌胃給藥前對小鼠進行稱重，之后每2 d 記錄1 次小鼠體質量；記錄取材前的小鼠體質量及取材后肺組織濕重，計算肺系數，公式為肺系數＝肺組織濕重/小鼠體質量×100%。

2.4 指標檢測

2.4.1 肺組織病理學觀察 肺組織于4% 多聚甲醛中固定24 h，浸蠟包埋，切片，進行HE 和Masson 染色。在光學顯微鏡下觀察肺組織病理形態變化，依據文獻［14］ 報道方法進行纖維化評分，肺標本纖維化評分依次從 “－” 到 “＋＋＋”（即從0 分到3 分），見表1。

表1 小鼠肺組織Masson 染色纖維化分級標準Tab.1 Grading criteria for mouse lung tissue fibrosis by Masson staining

2.4.2 ELISA 法檢測小鼠肺組織中Collagen I、HYP、TGF-β1 水平 取適量肺組織，置于PBS 中勻漿（每10 μL PBS 中含肺組織樣品1 mg），收集上清液。按照ELISA 試劑盒說明檢測Collagen I、HYP 和TGF-β1 的水平。

2.4.3 流式細胞術檢測小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T細胞的數量 腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，取下腔靜脈血，收集100 μL，加入FITC antimouse CD3、APC anti-mouse CD279、PE anti-mouse CD4 孵育30 min，紅細胞裂解液裂解20 min，PBS沖洗、固定細胞，流式細胞儀檢測。使用FlowJo 10 軟件對實驗結果進行分析。

2.4.4 免疫組織化學染色法檢測pSTAT3/PD-1、PD-L1 和IL-17A 的表達 肺組織石蠟切片常規脫蠟，抗原滅活，檸檬酸緩沖液進行抗原修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。一抗4 ℃過夜孵育，第2 天PBS 沖洗后加入二抗孵育，DAB 染色，蘇木精復染，透明，封片。通過Image J 軟件計算陽性染色面積比，比較各組pSTAT3、PD-1、PD-L1和IL-17A 的表達。

2.5 統計學分析 通過SPSS 26 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 麥門冬湯對IPF 小鼠肺系數的影響 與對照組比較，模型組小鼠肺系數增加（P＜0.01）； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯各劑量組小鼠肺系數均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 各組小鼠肺系數比較（±s，n＝6）Tab.2 Comparison of coefficients of mouse lung in each group （±s，n＝6）

表2 各組小鼠肺系數比較（±s，n＝6）Tab.2 Comparison of coefficients of mouse lung in each group （±s，n＝6）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）肺系數/（mg·g－1）對照組—6.80±0.93模型組—19.75±1.02??吡非尼酮組0.313.88±2.07＃＃麥門冬湯低劑量組4.515.55±2.16＃＃麥門冬湯中劑量組914.50±2.23＃麥門冬湯高劑量組1812.76±2.43＃

3.2 麥門冬湯對IPF 小鼠肺組織病理變化的影響 HE染色結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織中肺泡和肺間隙有大量炎性細胞浸潤，肺組織廣泛轉化，肺泡結構紊亂或塌陷，支氣管平滑肌厚度增加； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯各劑量組小鼠肺組織結構較清晰，支氣管平滑肌厚度有不同程度減小，纖維化程度減輕，見圖1。Masson 染色結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織中肺泡間隔厚，藍色膠原纖維在增厚的肺間隔內大量增加，彌漫性肺纖維化生成，纖維化評分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯中、高劑量組小鼠肺組織藍色膠原纖維減少，肺纖維化區域減小，纖維化評分降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2、表3。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of mouse lung tissue in each group （×200）

圖2 各組小鼠肺組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining for mouse lung tissue in each group （×200）

表3 各組小鼠肺組織Masson 染色纖維化評分比較（±s，n＝6）Tab.3 Comparison of fibrosis scores for mouse lung tissue of each group by Masson staining （±s，n＝6）

表3 各組小鼠肺組織Masson 染色纖維化評分比較（±s，n＝6）Tab.3 Comparison of fibrosis scores for mouse lung tissue of each group by Masson staining （±s，n＝6）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1） Masson 染色纖維化評分/分對照組—0.32±0.21模型組—2.88±0.31??吡非尼酮組0.31.73±0.56＃＃麥門冬湯低劑量組4.52.26±0.65麥門冬湯中劑量組92.01±0.58＃麥門冬湯高劑量組181.84±0.48＃

3.3 麥門冬湯對IPF 小鼠肺組織Collagen I、HYP和TGF-β1 水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠肺組織Collagen I、HYP 和TGF-β1 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯中、高劑量組小鼠肺組織Collagen I、HYP 和TGF-β1 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），麥門冬湯低劑量組小鼠肺組織HYP 和TGF-β1 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠肺組織Collagen I、HYP 和TGF-β1 水平比較（±s，n＝6）Tab.4 Comparison of Collagen I，HYP and TGF-β1 levels in mouse lung tissue of each group （±s，n＝6）

表4 各組小鼠肺組織Collagen I、HYP 和TGF-β1 水平比較（±s，n＝6）Tab.4 Comparison of Collagen I，HYP and TGF-β1 levels in mouse lung tissue of each group （±s，n＝6）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）Collagen I/（ng·mg－1）HYP/（ng·mg－1）TGF-β1/（pg·mg－1）對照組—0.43±0.0311.06±0.9542.56±3.73模型組—0.82±0.06??35.57±4.51??78.43±6.81??吡非尼酮組0.30.64±0.08＃＃17.53±2.29＃＃55.75±7.36＃＃麥門冬湯低劑量組4.50.71±0.1027.59±4.45＃63.32±8.99＃麥門冬湯中劑量組90.68±0.05＃＃24.33±3.39＃＃59.17±5.84＃＃麥門冬湯高劑量組180.55±0.07＃＃18.45±1.36＃＃46.83±3.41＃＃

3.4 麥門冬湯對IPF 小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T 細胞比例的影響 與對照組比較，模型組小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T 細胞比例升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯各劑量組小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T 細胞比例降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖3、表5。

圖3 各組小鼠血漿流式細胞術結果Fig.3 Results of plasma flow cytometry for mice of each group

表5 各組小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T 細胞比例比較（±s，n＝6）Tab.5 Comparison of proportion of PD-1＋CD4＋T cells in mouse plasma of each group （±s，n＝6）

表5 各組小鼠血漿中PD-1＋CD4＋T 細胞比例比較（±s，n＝6）Tab.5 Comparison of proportion of PD-1＋CD4＋T cells in mouse plasma of each group （±s，n＝6）

注： 與對照組比較，??P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）PD-1＋CD4＋T 細胞比例/%對照組—2.22±0.37模型組—21.36±2.69??吡非尼酮組0.39.23±0.86＃＃麥門冬湯低劑量組4.512.96±2.15＃麥門冬湯中劑量組98.31±1.35＃＃麥門冬湯高劑量組185.85±1.77＃＃

3.5 麥門冬湯對IPF 小鼠肺組織中p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡非尼酮組和麥門冬湯各劑量組小鼠肺組織中p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 表達降低 （P＜0.01），見圖4、表6。

圖4 各組小鼠肺組織p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 免疫組織化學染色結果（×200）Fig.4 Results of p-STAT3，PD-1，PD-L1 and IL-17A in mouse lung tissue of each group by immunohistochemical staining （×200）

表6 各組小鼠肺組織中p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 表達比較（±s，n＝6）Tab.6 Comparison of pSTAT3，PD-1，PD-L1 and IL-17A expressions in mouse lung tissue of each group （±s，n＝6）

表6 各組小鼠肺組織中p-STAT3、PD-1、PD-L1 和IL-17A 表達比較（±s，n＝6）Tab.6 Comparison of pSTAT3，PD-1，PD-L1 and IL-17A expressions in mouse lung tissue of each group （±s，n＝6）

注： 與對照組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）p-STAT3PD-1PD-L1IL-17A對照組—0.45±0.030.45±0.030.45±0.010.45±0.03模型組—1.46±0.06??1.62±0.20??1.56±0.11??2.00±0.05??吡非尼酮組0.30.60±0.05＃＃0.84±0.08＃＃0.78±0.04＃＃1.01±0.05＃＃麥門冬湯低劑量組4.50.98±0.03＃＃1.25±0.12＃＃1.21±0.12＃＃1.25±0.18＃＃麥門冬湯中劑量組90.87±0.06＃＃1.21±0.06＃＃1.03±0.03＃＃1.10±0.08＃＃麥門冬湯高劑量組180.51±0.01＃＃0.72±0.09＃＃0.72±0.09＃＃0.77±0.04＃＃

4 討論

近年來，隨著對IPF 發病機制認識的不斷加深，研究表明SARS-CoV-2、流感病毒、禽流感病毒、中東呼吸綜合征-冠狀病毒、嚴重急性呼吸綜合征-冠狀病毒等種病毒感染后均可導致肺纖維病變［15］。目前治療IPF 的手段有限，Pirfenidone 和Nintedanib 這2 種特異性治療IPF 的藥物雖能夠減緩病情發展，但價格昂貴且具有一定的副作用［4，16］。STAT3、PD-1、TGF-β1 和IL-17A 是治療IPF 的潛在靶標，在IPF 患者肺組織中，過量表達PD-1 的CD4＋T 細胞中信號傳導及STAT3 的活性升高，并增加IL-17A 的表達，進而激活了細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 沉積及TGF-β1 的表達，最終造成肺組織損傷［7］。

麥門冬湯出自《金匱要略》，是治療肺痿的主方［17］，由麥冬、半夏、人參、甘草、粳米、大棗組成，主治肺胃氣陰兩虧，虛火上逆，舌光脈虛數而無實邪者。麥門冬湯治療肺纖維化的機制復雜，目前的研究主要集中在其對疾病發展過程中相關的炎癥因子和細胞因子表達、氧化應激反應和自噬反應的調控等方面［18-19］。

本研究采用氣管注射BLM 法構建C57BL/6J 小鼠IPF 模型。與對照組比較，模型組小鼠肺組織結構紊亂或塌陷，肺泡和肺間隙有大量炎性細胞浸潤，藍色膠原纖維大量增加，彌漫性肺纖維化生成； 與模型組比較，麥門冬湯組小鼠肺組織結構較清晰，藍色膠原纖維減少，肺纖維化癥狀減弱。與對照組比較，模型組小鼠中PD-1 和PD-L1 表達增加，與文獻［7］ 報道一致； 與模型組比較，麥門冬湯組小鼠肺組織中PD-1 和PD-L1 表達降低，上述結果提示，降低肺纖維化小鼠體內PD-1 和PDL1 的表達將有助于肺纖維化病情的減輕，麥門冬湯抗肺纖維化的作用可能與其阻斷PD-1 和PD-L1的表達有關。與對照組比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3、TGF-β1 和IL-17A 表達升高，Collagen I和HYP 水平增加； 與模型組比較，麥門冬湯組小鼠體內p-STAT3、TGF-β1 和IL-17A 表達降低，Collagen I 和HYP 水平減少。上述結果提示，麥門冬湯抗肺纖維化的作用可能與抑制STAT3 活性，降低TGF-β1 和IL-17A 的表達，減少ECM 沉積密切相關。

綜上所述，本研究發現麥門冬湯可以降低IPF模型小鼠CD4＋T 細胞的STAT3 活性，抑制PD-1 表達，降低肺組織中促纖維細胞因子TGF-β1 和IL-17A 水平，進而減少ECM 沉積，這可能是麥門冬湯減輕IPF 的重要機制，闡釋了麥門冬湯治療肺纖維化的免疫調控新機理。這一新機理的闡明將為進一步明確麥門冬湯治療肺纖維化的物質基礎和基于麥門冬湯治療肺纖維化的中藥新藥研發奠定基礎。