解淀粉芽孢桿菌SQ-2 對水稻的促生作用

李雪 李容歐 孔美懿 黃磊

（天津理工大學化學化工學院，天津 300384）

磷作為植物生長的必要元素之一，對植物細胞分裂與分生組織發育均具有重要的作用［1-2］。雖然土壤中磷元素的有機和無機形態豐富，但它主要以不溶性的形態存在。而且由于固定化作用和降水，可溶性磷往往不能從土壤中正常分解出來。在酸性土壤中，磷被鋁和鐵的游離氧化物和氫氧化物固定，而在堿性土壤中則被鈣固定。這會使得土壤中可溶性磷含量低下，影響作物發育［3］。目前我國氮肥施用量較高，流失率卻高達40%左右，易導致土壤受到硝酸鹽的污染，并累積大量的鹽分，進而造成作物減產［4］。而鉀是植物重要的營養元素，在植物的生長和代謝中起關鍵作用。鉀離子（K+）可以幫助植物實現生理調節，例如調節水分狀態、膨壓、光合產物的運輸或移動、細胞代謝、對生物和非生物脅迫的耐受性等［5］。因此，提高土壤中氮、磷與鉀元素的利用率是亟待解決的問題。

植物根際土壤是土壤微生物種類較為豐富的一塊區域，在其中具有促生抗病作用的細菌被稱為植物促生根際細菌（plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）。促生菌通過合成吲哚乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）、分泌鐵載體、溶磷固氮、抑制有害真菌生長等方式，起到促進植物生長、提高土壤肥力的作用［6］。植物根際促生細菌種類繁多，主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp.）、固氮菌屬（Azotobacter spp.）等［7］。賈崢嶸等［8］研究表明枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、膠凍樣芽孢桿菌（jelly-like Bacillus）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）和甲基營養型芽孢桿菌（methylotrophic Bacillus）可以增加甘薯淀粉積累量，提高甘薯產量及品質。周童暉等［9］研究結果顯示，枯草芽孢桿菌（B.subtilis PJS-18）具有高效解磷能力，添加低濃度菌懸液對小麥（Triticum aestivum L.）具有較強的促生作用。細菌接種可能會重塑土壤群落，因為當外源性因素改變土壤中的礦質養分與pH 后，會導致微生物群落結構的變化［10］。接種溶磷菌Pantoea aglumans V8R67 能降低土壤pH，并且改變土壤細菌群落結構，群落中提升的厚壁菌門（Bacillota）能夠分解土壤不溶性磷源，提高土壤有效磷含量［11］。

促生菌劑的使用能促進作物生長發育，但有關解淀粉芽孢桿菌在水培、土培水稻（Oryza sativa L.）中應用濃度方面的研究報道相對較少。之前實驗室從豆瓣醬中分離篩選得到了一株解淀粉芽孢桿菌SQ-2，試驗將對其溶磷固氮解鉀的功能進行研究。并以水稻為研究對象，擬利用水培、盆栽試驗研究該菌株在不同濃度下對水稻的促生作用，探究土壤中各類酶、營養元素與菌株濃度之間的關系，為提高菌肥利用效率及未來微生物肥料研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細菌 實驗室前期篩選得到的一株解淀粉芽孢桿菌SQ-2，放置甘油管中于-80℃冷凍保存［12］。

1.1.2 培養基 培養基配方均為液體培養基，固體培養基需在此基礎上添加20 g/L 瓊脂粉。pH 均為7.0-7.2（氫氧化鈉溶液調節），121℃滅菌30 min。其中蔗糖、葡萄糖為分裝單獨滅菌后加入培養基。金屬離子溶液使用濾器過濾滅菌后加入培養基。

解鉀培養基：蔗糖5 g，葡萄糖5 g，硫酸銨0.5 g，酵母0.5 g，七水合硫酸鎂0.3 g，磷酸氫二鈉2 g，硫酸亞鐵0.02 g，硫酸錳0.03 g，鉀長石4 g，蒸餾水1 000 mL。

無機磷Pikovskaya 培養基：磷酸三鈣5 g，蔗糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.2 g，七水合硫酸鎂0.1 g，氯化鉀0.2 g，酵母0.5 g，七水合硫酸錳0.03 g，七水合硫酸亞鐵0.03 g，蒸餾水1 000 mL。

盆栽實驗土壤采自天津理工大學明理農場，土壤基本理化性質為pH 7.83，總磷446 mg/kg，總氮521 mg/kg，總鉀1.03%，速效磷18.39 mg/kg，速效氮 16.33 mg/kg，速效鉀62.52 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 菌株固氮能力檢測 利用北京迪信泰公司細菌固氮酶ELISA 試劑盒進行檢測，采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附實驗。最后實驗結果顏色的深淺與樣品中固氮酶的濃度呈現正相關。利用酶標儀在450 nm 條件下測定吸光度，計算出固氮酶濃度。

1.2.2 菌株溶磷能力測試

（1）定性測試。用接種針挑取菌株SQ-2 單菌至無機磷固體培養基中央，共接種3 個平皿。在25℃恒溫箱中培養6-9 d，觀察是否有溶磷現象產生。

（2）定量測定。先挑取單菌在LB 培養基中培養3 d，離心后，將菌體用無菌水制備成OD 值為1的菌懸液，以2%的接種率接入上述無機磷液體培養基中。于25℃，120 r/min 的搖床內培養，培養1 d 后，吸取培養液離心取上清，使用無磷濾紙過濾，采用鉬藍比色法測定其溶磷量［13］，并使用pH 計測定無機磷液體培養基pH 值，每組進行3 次重復。

1.2.3 接種菌株后鉀長石的表面形態分析 將菌株以2%的接種率接種到解鉀液體培養基中，并在25℃，120 r/min 的搖床內培養。8 d 后收集樣品，通過濾紙過濾回收發酵液中的鉀長石粉末，并在60℃烘箱內完全干燥。使用掃描電子顯微鏡觀察鉀長石接種菌株前后的表面形態。

1.2.4 菌株對水培與土培水稻的促生實驗 使用質量體積分數為1%的次氯酸鈉溶液對合格水稻種子進行消毒，時長5 min，然后用無菌水洗滌5 遍。之后使用體積分數為75%的酒精對其進行消毒5 min，再用無菌水洗滌5 遍，并對最后一遍洗滌后的無菌水進行涂板實驗，來檢驗水稻是否已完全滅菌。將菌株SQ-2 發酵液10 000 r/min 離心10 min，使用無菌水反復清洗離心兩次，制成102、104、106、108和3×108CFU/mL 的菌懸液進行浸種。水稻浸種溫度為27℃，時長72 h，光照度3 000 lx，光暗比為16 h/8 h。

選用口徑8 cm，底徑6.5 cm，高11 cm 的塑料花盆，每盆添加400 g 土壤、放置15 顆相應浸種濃度的露白水稻種子。分別在第1 天與第10 天取102、104、106、108和3×108CFU/mL 菌懸液 各25 mL 接種至花盆中，并且每組處理澆水溶性肥料50 mL（購于河南省雙惠農業科技發展有限公司），同時設置對照組，置于 25℃ 溫室中培養。在20 d 后，每個花盆3 個點取樣，土樣混合均勻后風干，過篩（100 目）后測定相應指標［14］。取102、104、106、108和3×108CFU/mL 菌懸液各25 mL，每個濃度組分浸泡20 粒消毒過未浸種水稻種子，同時設置對照組。培養14 d 后測定根莖干重、鮮重以及莖粗、莖高，以上重復3 次作為平行試驗。

水稻根莖干重的測定方法：將水稻根莖在烘箱105℃下殺青1-2 h 后，再在60℃烘干至恒重，用電子天平稱量得到。根莖鮮重用電子天平來測定。水稻高度、根長用卷尺測量，莖粗用游標卡尺測量。

其中土壤脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；蛋白酶采用茚三酮檢測法測定；蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定［15］。實驗土壤總鉀、總氮、總磷和速效氮委托江蘇中園科技有限公司檢測。土壤速效磷、速效鉀、銨態氮、硝態氮以及土壤酸性磷酸酶，均使用合肥萊爾生物試劑盒進行檢測。土壤pH 采用pH 計電位法檢測［16］。

1.2.5 根際土壤收集 對接種3×108CFU/mL 菌懸液的土壤及對照組進行細菌豐度分析，共計兩組，每組3 個平行試驗。每組15 株水稻，在其生長20 d后，將水稻連土整根挖起，去除大塊土壤，并采用抖根法收集根際附近土壤［17］。收集3 g 根際土壤放置于5 mL 凍存管，用液氮冷凍10 min，放置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.6 DNA 提取、PCR 擴增以及 Illumina Miseq 測序 將土壤樣品放置于干冰內，送樣至上海美吉生物醫藥公司檢測，委托美吉生物進行文庫構建及高通量測序。

1.2.7 數據分析 利用獨立樣本t 檢驗方法，對接種菌株3×108CFU/mL 組和對照組土壤的α 多樣性進行分析。不同處理間的各項指標差異性采用單因素方差分析中的 Duncan 法進行分析，接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2 后土壤營養成分、土壤酶活性與pH 的相關性分析采用Pearson 相關分析方法，使用Excel 2016 與SPSS 25.0 對數據進行分析，用Origin 2021和Adobe Photoshop 2021 制圖。

2 結果

2.1 解淀粉芽孢桿菌SQ-2的解磷能力

將菌株SQ-2 在無機磷液體培養基中振蕩培養，從第1 天開始，檢測上清液中可溶性磷含量，結果（圖1-B）表明，菌株SQ-2 在無機磷培養基中上清液磷含量最高值出現在第6 天，約為229.63 mg/L，與此同時pH 值呈現先快速降低再緩慢回升的趨勢。前3 d 的溶磷量沒有明顯變化，第3 天時約為72.22 mg/L，之后呈現穩步上升的趨勢，在第6 天開始趨于穩定。無機磷培養基的初始pH 值為7.36，接種后第1 天迅速降至5.28，后續最低pH 值在4.3-4.5左右，第6 天之后pH 值開始緩慢回升。接種菌株后0-2 d 為對數生長期，第3 天菌體數量達最高值3.26×107CFU/mL，隨后菌體數量迅速下降。圖1-A為菌株SQ-2 在無機磷固體培養基中培養至第7 天的溶磷情況。

圖1 解淀粉芽孢桿菌SQ-2 在無機磷培養基中的溶磷作用Fig.1 Phosphorus dissolution of Bacillus amyloliquefaciens SQ-2 in inorganic phosphorus medium

2.2 解淀粉芽孢桿菌SQ-2 的解鉀以及固氮能力

通過SEM 來觀察鉀長石與菌株SQ-2 相互作用后的形態。對照組中（圖2-A,C），鉀長石的表面光滑且有棱角；而在接種菌株SQ-2 的組中（圖2-B），鉀長石表面被腐蝕，能觀察到模糊的棱角和粗糙的紋理，還有部分菌體附著在鉀長石表面（圖2-D）。

圖2 接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2 后鉀長石的掃描電子顯微照片Fig.2 Scanning electron micrograph of potassium feldspar after inoculation with B.amyloliquefaciens SQ-2

使用固氮酶試劑盒進行檢測，利用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度值。根據標準品制備的標準曲線計算出菌株固氮酶活性為55.07 U/L。

2.3 水培與土培條件下菌株SQ-2 對水稻的促生能力

在水培條件下，S2 組中水稻根干重、鮮重與莖干重變化最顯著，分別增加了69.7%、59.6%以及38.7%。但不同組對于水稻株高、莖粗與莖鮮重的影響并不顯著（表1）。

表1 不同濃度的解淀粉芽孢桿菌SQ-2 對水培水稻根莖干鮮重、莖長與莖粗的影響Table 1 Effects of B.amyloliquefaciens SQ-2 at different inoculum concentrations on the dry and fresh weight,stem length,and stem diameter of hydroponic rice

土培條件下，S4 與S5 組中水稻根的干、鮮重增長效果顯著，根鮮重分別為1.11 g 與1.16 g，比對照組提高了37%與43.2%；根干重分別為95 mg 與102 mg，較對照提高了35.7%與45%。S5 組中莖的干鮮重提升顯著，莖鮮重分別為0.51 g 與0.58 g，較對照提高了16.7%與38%；莖干重分別為36 mg 與45.7 mg，較對照提高了20%與33.3%。莖粗也在S5組提升最顯著，較對照提高了30.5%（表2，圖3）。

表2 不同濃度的解淀粉芽孢桿菌SQ-2 對土培水稻根莖干鮮重、莖長與莖粗的影響Table 2 Effects of B.amyloliquefaciens SQ-2 at different inoculum concentrations on the dry and fresh weight,stem length,and stem thickness of soil cultured rice

圖3 解淀粉芽孢桿菌SQ-2 在不同濃度下對土培水稻生長的影響Fig.3 Effects of B.amyloliquefaciens SQ-2 on soil cultured rice under different bacterial inoculum concentrations

在土培條件下，當菌液濃度在108及3×108CFU/mL 時，對植物的促生效果較好；而在水培條件下，菌液濃度在104CFU/mL 時促生效果較好。

2.4 解淀粉芽孢桿菌SQ-2對土壤中速效氮磷鉀、土壤酶活性以及土壤pH的影響

接種菌株SQ-2 20 d 后，土壤中上述4 種酶的活性均得到了提升。其中蔗糖酶、蛋白酶與脲酶的活性只有在S5 組較對照組提升顯著，分別提高了89.1%、44.94%、127.2%；酸性磷酸酶活性從S2 組開始，與對照組相比有顯著提升，S2-S5 組分別提升了原來的1.28、1.62、1.66 與1.79 倍（圖4）。

圖4 解淀粉芽孢桿菌SQ-2 在不同濃度下對土壤中速效氮磷鉀、pH 與酶活性的影響Fig.4 Effects of B.amyloliquefaciens SQ-2 at different concentrations on nitrogen,phosphorus,potassium,pH and enzyme activity in soil

土壤中的速效磷與硝態氮在S5 組與對照相比效果顯著，分別增加了22.7%與13.9%。土壤速效鉀在S4、S5 組顯著高于對照組，增加了22.2%與29.5%。土壤銨態氮從S3 組開始與對照組相比有顯著提升，S3-S5 組分別提升了1.53、2.05 與2.06 倍。從S2 組開始，土壤pH 顯著降低。對照組pH 為 7.83，而S5 組的pH 降至7.26（圖4）。

土壤pH 與所有的指標都呈顯著負相關，并且與蛋白酶、脲酶、酸性磷酸酶、速效鉀、硝態氮與銨態氮呈極顯著負相關（圖5）。

圖5 接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2 后土壤營養成分、土壤酶活性與pH 的相關性Fig.5 Correlation between soil nutrient composition,soil enzyme activity,and pH after inoculation with B.amyloliquefaciens SQ-2（n=18）

2.5 接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2對土壤細菌生態結構的影響

2.5.1 香農指數稀釋曲線與群落Venn 圖 根據樣品中最小序列數進行抽平，S5 組取檢測3 次的平均值，其OUT 數量為685，特有的OUT 數為85。CK 對照組同樣為檢測3 次的均值，其OUT 數量為625，特有的OUT 數為25，可以看出S5 組的細菌OUT 數要高于對照組（圖6-B）。

圖6 解淀粉芽孢桿菌SQ-2 的香農稀釋曲線與Venn 圖Fig.6 Shannon dilution curve and Venn plot of B.amyloliquefaciens SQ-2

解淀粉芽孢桿菌SQ-2 的接種使得土壤群落數增多，豐富了土壤環境中的細菌種類。香農指數表示物種的均勻度與數目，S5 組與對照組的香農指數稀釋曲線慢慢趨近平緩（圖6-A），說明測試可以基本涵蓋微生物的數目。

2.5.2 土壤α 多樣性 綜合水培與土培的實驗結果，對接種菌株濃度為S5（3×108CFU/mL）與CK（水）的組分別進行細菌α 多樣性統計。

其中Ace、Chao、Sobs、Shannon 指數均存在顯著差異，且S5 組要顯著高于CK 對照組。而Simpson 指數則是CK 對照組顯著高于S5 組。Coverage指數則沒有顯著變化。說明接種菌株后提高了群落的α 多樣性，且群落中微生物數目變多（圖7）。

圖7 土壤細菌多樣性分析Fig.7 Diversity analysis of soil bacteria

2.5.3 接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2 對土壤細菌群落組成的影響 S5 組在門分類水平的優勢微生物為（相對豐度≥10%）：放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）與擬桿菌門（Bacteroidota）。變形菌門的相對豐度由對照組的50%降低至29%；擬桿菌門的相對豐度由20.5%降低至1.5%；而放線菌門的相對豐度由13.45%提升至44%（圖8-A）。

圖8 水稻根際土壤細菌群落組成分析Fig.8 Analysis of bacterial community composition in rice rhizosphere soil

S5 組在綱分類水平的優勢微生物為（相對豐度≥10%）：α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）與放線菌綱（Actinobacteria）。α-變形菌綱的相對豐度由對照組的26%降低至19%；放線菌綱的相對豐度由12%提升至26%（圖8-B）。

3 討論

植物根際促生菌（PGPR）可以分泌植物激素、釋放揮發性物質、抑制病原菌以及礦化土壤中的養分，為植物生長發育創造條件。由于促生菌生化特性不同，其促生機制存在差異，這常導致同一種菌具備多種促生能力。目前為止，芽孢桿菌屬的大部分菌株都是制備優質生物制劑的首選［18］。解淀粉芽孢桿菌SQ-2 是從市售豆瓣醬中分離篩選出的一株具備解鉀、溶磷與固氮作用的多功能菌株，為生物菌劑開發提供了重要的資源。

對菌株進行溶磷能力定性檢測時，本研究采用了磷酸三鈣作為磷源的固體培養基來檢測細菌的溶磷能力，然后根據溶磷圈的大小來初步判斷其溶磷情況。試驗中培養基并沒有出現明顯的透明圈，而在溶磷的定量實驗中，菌株SQ-2 對磷酸三鈣的溶解量為229.63 mg/L。朱培淼等［19］實驗證明，透明圈直徑的大小并不能準確反映菌株的解磷能力。推測菌株產生溶磷圈直徑的大小與菌株分泌的酶、小分子酸的類型以及其釋放速率有關［20］。因此在實驗中，應該以實際搖瓶中檢測到的溶磷量為準。而pH 值與對照相比顯著下降，推測菌株 SQ-2 能產生有機酸，進而通過酸化、螯合等方式提升培養基中可溶性磷的含量。溶磷菌通過分泌有機酸，一方面降低介質pH 值，直接溶解不溶性無機磷酸鹽；同時，有機酸的羧基與陽離子（如鐵、鋁等）螯合，從鐵鋁磷酸鹽中釋放正磷酸鹽［21-22］。有報道顯示復合接種B.japonicum 5038 和 P.mucilaginosus 3016 能提高大豆（Glycine max）根際有機酸合成基因（pflAD、ackA、ldhA、ppc、gltA）的豐度進而提高溶磷效果［23］。有溶鉀功能的促生菌除了產酸幫助鉀增溶外，還可能使其分泌高分子有機配體，這些物質與礦物表面的離子形成絡合物，從而削弱金屬氧鍵；或是利用自身產生的胞外多糖與有機酸相互吸附，共同附著在礦物表面，實現對含鉀礦物的溶解［24］。

生物固氮是植物利用氮素的主要方式［25］，在整個生物固氮過程參與的主要酶為固氮酶［26］。菌體中的固氮酶能將空氣中的氮氣（N2）還原成氨（NH3），從而為植物提供氮源。固氮微生物主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和聯合固氮菌3 種。自生固氮菌的固氮效率比其他兩種低，但它對環境適應能力強，能自主從空氣中吸收氮氣。例如固氮菌屬（Azotobacter）、紅螺菌屬（Rhodospirillum）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等均屬于自生固氮菌［27］。王振龍等［28］將固氮菌Acinetobacter NCRS21與Pseudomonas baetica NCHP9 接種至燕麥（Avena sativa L.）根際，發現這兩種菌株對燕麥生長具有顯著的促進作用，較對照分別增加了11.05%、7.45%。經過Pearson 相關性分析表明，NCRS21 與NCHP9的固氮酶活性與燕麥的地上干重呈正相關性，說明固氮菌具有一定的研究潛力。經過試驗后發現菌株SQ-2 有固氮酶活性，但菌株SQ-2 的固氮能力需要進一步探索。未來可以利用多組學知識，找到更多與有機酸合成或是固氮相關的調控基因來提高對促生機制的認識［22］。

接種解淀粉芽孢桿菌SQ-2 后水稻的生物量得到了提高，且水稻土壤中速效氮磷鉀的含量與酶活性高于對照。土壤酶是有機質和養分循環的中間載體，可以用來評估土壤肥沃度與健康情況［29］。土壤中營養元素與酶活性的變化，并非是由于外源性接種細菌的單獨作用，因土壤有著極其復雜的微生物環境，外源性細菌也會對群落豐度產生影響，從而改變土壤的整體結構。土壤微生物能維持土壤健康，并可以抵御部分病原體［30-31］。溶磷菌的接種使土壤中各類有機物質溶解，這些物質釋放出的營養元素可能會改變部分土壤群落結構，并增加土壤的α 多樣性［32］。接種菌株SQ-2 提升了土壤中芽孢桿菌屬的比例，推測原因應為該菌株定殖在根部所導致。目前的研究中，土壤pH 值是細菌豐度的重要驅動因素，pH 值對土壤類型和土壤細菌群落的組成有很大的影響［33］。酸桿菌門在較低pH 值的土壤中豐度更高［34］，這與本實驗研究結果一致，這也間接證明解淀粉芽孢桿菌SQ-2 可以釋放酸性物質降低土壤pH。前人研究結果已證實根際微生物與土壤營養指標高度相關，因此研究細菌群落結構與土壤養分之間的關系可為植物促生找到微生物學機制［35］。解淀粉芽孢桿菌SQ-2 可作為微生物復合菌肥的原料，但還需進一步探究菌株在大田試驗中的定殖與促生能力。

4 結論

本研究證明了解淀粉芽孢桿菌SQ-2 有溶磷固氮解鉀的作用，且菌株對土培水稻的促生效果優于水培。接種菌株后，土壤中的酶活性與速效氮磷鉀的含量均得到提高，還能夠增加土壤α 多樣性，改變土壤中細菌群落結構，提升土壤中益生菌群比例。菌株SQ-2 有較好的水稻促生作用，具有一定的應用潛力。