紫檀芪調控微小RNA-340-5p/髓細胞白血病-1軸對膽囊癌SD細胞生物學行為的影響實驗研究

王京京,李全福,張立廣,邵青龍

(保定市第二醫院肝膽外科,河北 保定 071000)

膽囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是最常見的膽道癌癥,因其侵襲性行為和早期缺乏有效的篩查手段,導致多數患者在診斷時已處于晚期且預后較差[1-2]。盡管少數患者可以進行根治性切除,但5年生存率仍然很低[3]。因此,尋找有效治療藥物有助于改善GBC患者預后。紫檀芪(Pterostilbene,PTS)是白藜蘆醇的衍生物,從花生、葡萄、桑葚、蔓越莓、藍莓中提取,具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[4-5]。PTS可調控多種信號通路,抑制細胞增殖[6-8]。既往研究[9]表明,PTS可減弱GBC細胞增殖、遷移和侵襲,抑制GBC進展,其作用機制仍需更深入研究。有研究[10]顯示,微小RNA(microRNA,miRNA)可調控腫瘤的發展。據報道[11],微小RNA-340-5p(microRNA-340-5p,miR-340-5p)在GBC中低表達,促進miR-340-5p表達可抑制GBC細胞增殖和侵襲并誘導細胞凋亡。髓細胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,MCL-1)是B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoblastoma-2,Bcl-2)蛋白家族的抗凋亡蛋白,其過表達與腫瘤分級、低存活率和化療耐藥性相關[12]。研究[13]發現,在GBC中環狀RNA漿細胞瘤變體易位1通過miR-339-3p上調MCL-1表達,促進GBC生長。推測PTS和miR-340-5p/MCL-1是治療GBC的潛在藥物或靶點,然而PTS對GBC細胞遷移和侵襲的影響機制是否是通過調控miR-340-5p/MCL-1軸實現尚不可知。因此,本研究基于GBC細胞系GBC-SD,探討PTS對GBC細胞遷移和侵襲及miR-340-5p/MCL-1軸的影響,以期了解GBC的發展機制,為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物 人GBC細胞系GBC-SD細胞(批號:TP-3915K)購自上海通派生物科技公司。6周齡雄性無胸腺裸鼠(體重14～16 g,SPF級)購自江蘇艾菱菲生物公司,生產許可證號SCXK(蘇)2022-0014,在無病原體實驗室中飼養。裸鼠實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 PTS(批號:SP9570,原料藥,純度≥99.15%)購自陜西慈緣生物技術公司;空載質粒、miR-340-5p小干擾RNA(siRNA)質粒、MCL-1-野生型(WT)、MCL-1-突變型(MUT)、miR-340-5p模擬物(mimics)、miR-340-5p陰性對照(miR-340-5p-NC)質粒均由上海吉瑪公司合成;DMEM培養基(批號:JKR-D027)、Lipofectamine 3000試劑(批號:JKR-D016)、CCK-8試劑盒(批號:JKR-A011)、TRIzol試劑(批號:JKR-D009)、辣根過氧化物酶偶聯的二抗(批號:JKR-K013)購自武漢金開瑞生物公司;膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染試劑盒(批號:L10164)、Matrigel基質膠(批號:L19134)、PCR試劑盒(批號:L21573)、RIPA裂解液(批號:K19242)、MCL-1(批號:K25116)、Ki67(批號:K29157)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1,批號:K31548)、Bcl-2(批號:K36229)、Bcl-2相關X蛋白(Bax,批號:K70191)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,批號:K71264)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,批號:K10135)一抗購自蘇州亞凡生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PTS濃度篩選:GBC-SD細胞置于10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中進行傳代培養。待GBC-SD細胞生長至對數生長期,接種于96孔板中,加入不同濃度PTS(0、5、10、20、40、80 μmol/L)孵育48 h后,加入CCK-8溶液15 μl,4 h后酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD),計算細胞存活率(各濃度PTS的OD450與0 μmol/L的OD450的比值×100%)。各濃度PTS均設8個平行樣。計算PTS對GBC-SD細胞的半數抑制濃度(IC50),將接近IC50的PTS用于后續實驗。

1.3.2 細胞分組與干預:在6孔板中接種對數生長期的GBC-SD細胞(2×105個/孔),將細胞分為對照組(DMEM培養基常規培養GBC-SD細胞)、PTS組(加入80 μmol/L的PTS培養GBC-SD細胞)、PTS+空載質粒組(加入80 μmol/L的PTS培養GBC-SD細胞,并轉染空載質粒)、PTS+miR-340-5p沉默組(加入80 μmol/L的PTS培養GBC-SD細胞,并轉染miR-340-5p siRNA質粒)。使用Lipofectamine 3000試劑轉染對應的質粒。各組均設8個平行樣。

1.3.3 細胞增殖檢測:將各組細胞置于96孔板中,培養48 h后加入15 μl的CCK-8溶液,4 h后酶標儀檢測OD450,計算細胞存活率(各干預組OD450與對照組OD450比值×100%)。

1.3.4 集落形成檢測:用多聚甲醛固定在6孔板中培養2周的各組GBC-SD細胞,然后0.1%結晶紫染色,顯微鏡觀察計數集落形成數(>50個細胞的集落)。

1.3.5 細胞凋亡檢測:各組GBC-SD細胞進行48 h的培養,然后制備成細胞懸浮液。將懸浮液與10 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI在37 ℃下培養15 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 細胞劃痕實驗:收集各組細胞并接種在6孔板中,待細胞融合度≥80%,用微量移液器槍頭垂直劃線。PBS洗滌,在DMEM培養基中繼續培養48 h,顯微鏡下測量劃痕距離并拍照,計算遷移率[(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%]。

1.3.7 細胞侵襲實驗:Transwell預先涂上Matrigel基質膠,將細胞接種于Transwell小室上室,下室加完全培養基。48 h后將上室細胞去除,4%多聚甲醛固定下室侵襲細胞10 min,然后0.1%結晶紫染色5 min,顯微鏡下計數染色細胞數量(細胞侵襲數)。

1.3.8 miR-340-5p和MCL-1 mRNA表達檢測:使用TRIzol試劑從培養48 h的各組細胞中提取RNA,并反轉錄合成cDNA,行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應。反應條件:在93 ℃變性12 min,然后循環34次(93 ℃ 16 s,61 ℃ 21 s,79 ℃ 27 s),67 ℃延伸4 min。擴增體系(總共30 μl)根據PCR試劑盒進行分配。引物由北京陽科華科技公司合成,序列見表1。以2-ΔΔCt法計算miR-340-5p(內參U6)和MCL-1 mRNA(內參GAPDH)的相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.3.9 MCL-1及增殖凋亡相關蛋白檢測:將培養48 h的各組細胞用預冷的RIPA進行裂解,蛋白濃度采用BCA法定量后,進行電泳分離蛋白質并轉膜,室溫用5%脫脂牛奶封閉1 h,將膜與MCL-1(1∶1160)、Ki67(1∶1090)、Cyclin D1(1∶1640)、Bcl-2(1∶950)、Bax(1∶950)、Cleaved caspase-3(1∶1400)、GAPDH(1∶1550)一抗孵育,4 ℃過夜,然后加二抗(1∶3100)一起孵育2.5 h,使用ECL檢測試劑盒可視化,根據條帶灰度值計算蛋白表達量。

1.3.10 雙熒光素酶報告基因實驗:將MCL-1-WT、MCL-1-MUT連接到pmir-GLO雙熒光素酶載體,將構建的熒光素酶報告質粒MCL-1-WT、MCL-1-MUT在GBC-SD細胞中與miR-340-5p-NC或miR-340-5p mimics共轉染48 h,熒光素酶活性采用雙熒光素酶報告檢測系統測定。

1.3.11 體內腫瘤移植實驗:使用6周齡雄性無胸腺裸鼠進行體內研究。取100 μl含有GBC-SD細胞(1×104個)的細胞液經皮下注射所有裸鼠體內。7 d后,將裸鼠分為模型組和PTS組,每組10只。模型組裸鼠灌胃40 mg/kg 0.9%氯化鈉溶液,PTS組裸鼠灌胃40 mg/kg的PTS[14],每天1次,連續4周。分別于造模成功后(GBC-SD細胞液100 μl皮下注射裸鼠體內7 d后)、給藥4周后測量裸鼠腫瘤體積。給藥4周后處死裸鼠分離腫瘤并測量腫瘤重量。取腫瘤組織將其勻漿化,參照上述RT-qPCR和蛋白印跡實驗檢測腫瘤組織中miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白表達。

2 結 果

2.1 PTS濃度篩選結果 0、5、10、20、40、80 μmol/L PTS濃度下的GBC-SD細胞存活率依次為(100.00±0.00)%、(91.37±5.12)%、(79.51±8.09)%、(70.23±6.18)%、(61.49±7.38)%、(50.78±6.77)%。隨著PTS濃度的升高,GBC-SD細胞存活率逐漸降低(均P<0.05)。經計算,IC50為74.31,因此本研究選擇80 μmol/L的PTS進行后續實驗。

2.2 各組GBC-SD細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力比較 見表2。與對照組比較,PTS組細胞存活率、集落形成數、遷移率、細胞侵襲數降低,細胞凋亡率升高(均P<0.05);與PTS組和PTS+空載質粒組比較,PTS+miR-340-5p沉默組細胞存活率、集落形成數、遷移率、細胞侵襲數升高,細胞凋亡率降低(均P<0.05)。

表2 各組GBC-SD細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力比較

2.3 各組GBC-SD細胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相關蛋白表達比較 見表3。與對照組比較,PTS組miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達升高,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達降低(均P<0.05)。與PTS組和PTS+空載質粒組比較,PTS+miR-340-5p沉默組miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達降低,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達升高(均P<0.05)。

表3 各組GBC-SD細胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相關蛋白表達比較

2.4 miR-340-5p與MCL-1的靶向關系 見表4。Star Base數據庫預測顯示,miR-340-5p與MCL-1存在結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,miR-340-5p mimics和MCL-1-WT共轉染的細胞熒光素酶活性較miR-340-5p-NC和MCL-1-WT共轉染降低(P<0.05)。

表4 熒光素酶活性比較

2.5 PTS干預后對裸鼠腫瘤生長及miR-340-5p/MCL-1軸的影響 見表5。模型組和PTS組造模成功后腫瘤體積比較差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較,PTS組給藥4周后腫瘤體積、給藥4周后腫瘤重量、MCL-1 mRNA和蛋白表達降低,miR-340-5p表達升高(均P<0.05)。

表5 PTS干預后對裸鼠腫瘤生長及miR-340-5p/MCL-1軸的影響

3 討 論

PTS是白藜蘆醇的二甲基衍生物,是一種具有潛在化學預防活性的植物多酚化合物。PTS已被證明在多種癌癥如前列腺癌[15]、胃癌[16]等中具有抗癌的作用。研究[17]表明,PTS能促進腫瘤細胞凋亡,導致S期阻滯,抑制細胞增殖、遷移和過度侵襲。此外,PTS可通過增強自然殺傷細胞活性,從而殺死前列腺癌細胞[18]。PTS在GBC中的抗癌作用已有報道[9],其潛在的機制還需進一步探索。在本研究中,我們分析了PTS對體外GBC細胞的影響,結果顯示,與對照組比較,PTS組細胞存活率、集落形成數、遷移率、細胞侵襲數、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達降低,細胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達升高,與HOJO等[16]和WAWSZCZYK等[17]研究結果一致,表明PTS可抑制GBC-SD細胞增殖、遷移、侵襲并促進GBC-SD細胞凋亡,提示PTS能抑制GBC-SD細胞的惡性生物學行為,進而減弱其惡性進展。

miRNA是基因表達的重要轉錄調控因子,在癌癥中發揮重要功能[19-20]。miR-340-5p作為一種miRNA,在多種腫瘤中下調并可作為腫瘤抑制基因[21]。在結直腸癌組織和細胞系中,miR-340-5p表達明顯下調,過表達miR-340-5p可提高結直腸癌患者總生存期,并抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[22]。在GBC中,下調miR-340-5p使得GBC患者的存活率降低,促進GBC細胞生長[11]。本研究結果顯示,與PTS組比較,PTS+miR-340-5p沉默組細胞存活率、集落形成數、遷移率、細胞侵襲數、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達升高,細胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達降低,表明在PTS干預的基礎上沉默miR-340-5p可使PTS對GBC-SD細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力及增殖凋亡相關蛋白表達的作用效果減弱,PTS可能通過上調miR-340-5p表達影響GBC-SD細胞生物學行為。

MCL-1是腫瘤中高表達的抗凋亡蛋白,通過與Bcl-2家族的促凋亡成員Bax和Bcl-2相關K蛋白結合,阻斷線粒體外膜通透性、細胞色素C釋放和Caspase級聯激活,從而保護細胞免于凋亡。在癌癥細胞中,MCL-1過表達有助于致癌[23]。HSIEH等[24]研究顯示,下調MCL-1表達有利于促進人前列腺癌細胞凋亡,抑制前列腺癌生長。在乳腺癌中,高表達MCL-1與預后不良有關,抑制MCL-1表達能抑制乳腺癌移植瘤在體內的生長[25]。本研究發現,PTS干預后可升高GBC-SD細胞中miR-340-5p表達,降低MCL-1 mRNA和蛋白表達;與PTS單獨干預GBC-SD細胞比較,PTS和沉默miR-340-5p聯合干預會降低GBC-SD細胞中miR-340-5p表達,升高MCL-1 mRNA和蛋白表達;且miR-340-5p和MCL-1存在靶向調控關系,MCL-1是miR-340-5p的下游靶點。這些都說明PTS可通過上調miR-340-5p表達進而抑制MCL-1表達。體內裸鼠移植瘤實驗顯示,PTS能抑制裸鼠腫瘤生長和MCL-1 mRNA和蛋白表達,促進miR-340-5p表達。以上結果表明,PTS能通過促進miR-340-5p表達進而抑制MCL-1表達,抑制GBC-SD細胞增殖、遷移和侵襲,促進GBC-SD細胞凋亡。

綜上所述,PTS可通過上調miR-340-5p表達下調MCL-1表達,抑制GBC-SD細胞增殖、遷移和侵襲,促進GBC-SD細胞凋亡。本研究為GBC的新藥研發和靶向治療提供了理論前景。本研究不足之處在于涉及影響GBC細胞的生物學行為的基因較多,PTS是否可通過其他通路調控GBC惡性進展有待進一步研究。