負載3-甲基腺嘌呤介孔二氧化硅的制備與釋藥性能研究

韓卓越，王秀，巫業振，胡浩然，邢亞群（1.蚌埠醫學院第二附屬醫院藥劑科，安徽 蚌埠 33000；.蚌埠醫學院藥學院，安徽 蚌埠 33000）

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性的細胞降解途徑，是機體內存在的一種自我修復和維持生命的過程。自噬可以表現出多種功能形式，包括發揮促生存作用的細胞保護形式、促進腫瘤細胞死亡的細胞毒性形式和不具有保護作用的非保護形式[1]。3-甲基腺嘌呤（3-MA）是一種非特異性磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑，通常在體外用于抑制自噬[2]，可與抗腫瘤藥物聯合發揮協同作用。研究表明早期自噬抑制劑 3-MA的使用可保護心肌細胞免受阿霉素誘導的心臟毒性[3]。3-MA 可增強順鉑耐藥下咽鱗狀癌細胞的化療敏感性[4]，還可促進埃索美拉唑在胃癌細胞中的抗增殖活性[5]。廣泛使用3-MA可通過自噬激活顯著降低氯仿對小鼠的肝毒性[6]。此外，3-MA抑制自噬能夠在體外增強缺氧誘導的人結直腸癌細胞凋亡[7]。有研究已證明3-MA在體外和體內均可抑制骨肉瘤的生長[8]?？梢?-MA在自噬相關的疾病中發揮了重要作用，盡管用途廣泛，但 3-MA只有在高濃度時才有效，并且在室溫下的溶解度很差[9]。因此，更有效、更特異性的遞送自噬抑制劑對于開發基于抑制自噬協同抗腫瘤的輔助治療方法至關重要。

在納米技術領域中已經報道了許多納米載體，其中，介孔二氧化硅（MSN）納米粒子是現階段非常理想的新型藥物載體，其具有獨特的多孔結構，良好的化學穩定性、表面功能性和生物相容性，能確保多種藥物分子的可控釋放和藥物靶向性傳遞[10-11]。在納米載體基礎上通過靶向修飾可以改善藥物利用率，提高治療效果，并減少全身毒性相關的不良反應。骨靶向藥物唑來膦酸（ZOL）是雙膦酸鹽的成員之一，對骨組織表現出良好的親和力，具有與焦磷酸鹽類似的調節骨骼礦化的能力，且比焦磷酸鹽更穩定，其主鏈存在兩個膦酸基，可以與羥基磷灰石表面雙齒結構中的二價鈣離子進行螯合[12-13]。因此，ZOL是治療骨相關疾病靶向配體的最佳選擇。本研究設計了一種將ZOL連接在聚多巴胺（PDA）包覆的MSN納米粒上，并裝載3-MA，通過性質表征及藥物在不同條件下的釋放行為研究，初步評價其基本性能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器 ZNCL-GS智能磁力攪拌器（上海予申儀器有限公司）；5424R離心機（艾本德生命科學公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-3600紫外分光光譜儀（島津公司）；JEM-2100F透射電子顯微鏡（日本電子公司）；IS50紅外分光光譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

3-MA（批號：C13979809）、ZOL（批號：C134-76263）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC，批號：C12197343）、正硅酸乙酯（TEOS，批號：C12561839）、三乙醇胺（TEA，批號：20210507）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF，批號：P2136663）、無水乙醇（批號：2211073501）、鹽酸多巴胺（批號：C12659279）、二甲基亞砜（DMSO，批號：P2087852）（上海麥克林）。N，N'-羰基二咪唑（CDI，批號：K00220563）、NH2-PEG-SH（批號：K00220819）（西安凱新生物）。

2 方法與結果

2.1 納米制劑的制備

2.1.1 MSN的制備 按照文獻[14]的方法，并進行相應優化，簡要方法如下：取適量CTAC置量瓶中加入去離子水（20 mL）混合均勻，加入TEA（0.06 g），在95℃油浴，攪拌1 h后逐滴加入TEOS（1.5 mL），滴加完畢后繼續攪拌1 h，冷卻至室溫，離心收集，沉淀醇洗3次。然后在酸性乙醇溶液中60℃冷凝回流4 h，去除致孔模板劑CTAC，離心收集，乙醇洗滌兩次。同樣的提取工藝重復兩次。離心后的沉淀冷凍干燥24 h，最終得到白色粉末MSN。

2.1.2 PDA的包覆 參考文獻[15]已有的方法：將100 mg MSN完全溶解在50 mL Tris-HCl緩沖液中（pH 8.5），加入50 mg鹽酸多巴胺，室溫有氧條件下攪拌（200 r·min－1）4～6 h后，離心 10 min，沉淀用去離子水洗滌兩次，最終產物冷凍干燥，記為MSN@PDA。

2.1.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的制備

① 活化ZOL：將ZOL（100 mg）與適量TEA溶解在DMF中，加入CDI（90 mg，無水），密閉氮氣保護，60℃油浴，攪拌反應24 h。用旋轉蒸發儀蒸發未反應完的TEA。沉淀物用乙腈洗滌兩次以去除多余的CDI，旋轉蒸發干燥，得到純活性沉淀物 ZOL[16]。

② 活化ZOL與NH2-PEG-SH連接：將純活性沉淀物ZOL（22.6 mg）溶解在適量DMSO和TEA中，將分子量為2000的NH2-PEG-SH（質量濃度為2 mg·mL－1）滴加到溶液中，在密閉的氮氣下反應12 h。反應混合物在蒸餾水中透析48 h以去除多余的活性ZOL，得到ZOL-PEG-SH[17]。

③ MSN@PDA-PEG-ZOL的制備：將上述所得化合物溶解在20 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）中，加入100 mg MSN@PDA，室溫攪拌過夜。然后，將溶液在4℃下以12 000 r·min－1離心10 min，得到MSN@PDA-PEG-ZOL，用去離子水洗滌三次后，冷凍干燥。

2.2 3-MA的包封率（EE）及載藥量（DL）的測定

2.2.1 3-MA標準曲線的建立 稱取5 mg 3-MA于25 mL量瓶中，加去離子水配制200 μg·mL－1的標準溶液，取標準溶液稀釋成1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL－1的系列工作液，使用紫外檢測，波長為273 nm。以3-MA濃度（C）設為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，建立標準曲線。結果表明3-MA在1～50 μg·mL－1與峰面積線性關系良好，回歸方程為A＝0.0841C＋0.0159（R2＝0.9995）。

2.2.2EE和DL的測定 取3-MA對照品溶解在去離子水中，分別配制50、100、200、500、1000μg·mL－1的標準溶液。取20 mg MSN 分別放在20 mL的離心管中，依次加入10 mL不同濃度的3-MA標準溶液，水浴超聲至MSN完全分散，室溫下攪拌24 h后，離心收集上清液，用去離子水洗滌沉淀兩次。洗滌液與上清液的合并液用于載藥量和包封率的測定[18]；沉淀冷凍干燥后備用，記為MSN@3-MA。

取合并液適量，0.45 μm微孔濾膜過濾，用去離子水稀釋至適宜濃度，測定其吸光度，代入標準曲線方程計算3-MA濃度，EE和DL分別按公式（1）、（2）計算。

式中3-MA的含量記為W1（g），MSN@3-MA稱重記為W2（g），初始3-MA投入量記為W3（g）。

結果如圖1和表1所示，3-MA在273 nm處存在特征峰，而MSN@3-MA的UV曲線中存在3-MA的特征峰，證明3-MA加載在納米粒子中。不同3-MA濃度的DL和EE如表1所示，在50～1000μg·mL－1范圍內，DL隨濃度的增加而增加，濃度在1000 μg·mL－1時，EE為（90.87±0.05）%，DL為（37.55±0.02）%。

表1 不同濃度3-MA的EE及DLTab 1 Encapsulation rate and drug loading amount of different mass ratios of 3-MA

圖1 3-MA、MSN、MSN@3-MA的UV圖譜Fig 1 UV spectrum of 3-MA，MSN，and MSN@3-MA

2.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的表征分析

2.3.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）分析 取制得的產物適量，在DMSO中檢測，檢測條件為 500 MHz，利用核磁共振氫譜儀對樣品進行測定。結果如圖2 所示，ZOL結構中相應氫的位置見圖2A，羥基活潑氫在譜圖中未出峰，圖2B中ZOLPEG-SH氫譜圖出現與ZOL結構中相應氫的位置一致，證實兩藥合成成功。

圖2 ZOL（A）與ZOL-PEG-SH（B）的1H-NMR 譜圖Fig 2 1H-NMR of ZOL（A）and ZOL-PEG-SH（B）

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR） ZOL與NH2-PEG-SH、ZOL-PEG-SH的紅外吸收光譜如圖3所示。ZOL-PEG-SH在3143 cm－1、1580 cm－1、1545 cm－1、629 cm－1出現了與ZOL結構中咪唑環化學基團的吸收峰一致的峰。在1635 cm－1出現了吸收峰與酰胺（C＝O）的伸縮振動有關的吸收峰，表明形成了新的酰胺鍵，證實了兩藥成功合成。MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖如圖4所示，納米粒子均在1054 cm－1和965 cm－1處出現吸收峰，分別為Si-O-Si伸縮振動和硅醇基振動。包覆PDA后，在1633 cm－1處的峰歸屬于芳環骨架的伸縮振動，3385 cm－1處的寬吸收峰歸屬于N-H/O-H的伸縮振動，證明PDA包覆在MSN表面。而MSN@PDA-PEG-ZOL在1457 cm－1和1349 cm－1處出現的峰表明目標配體ZOL存在于納米粒子表面上。

圖3 ZOL、NH2-PEG-SH和ZOL-PEG-SH的FT-IR光譜圖Fig 3 FT-IR spectra of ZOL，NH2-PEG-SH and ZOL-PEG-SH

圖4 MSN、MSN@PDA和MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of MSN，MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

2.3.3 透射電子顯微鏡（TEM）分析 取適量納米粒子進行了TEM分析，觀察其納米粒子形態、尺寸大小。從圖5A中可以看到 MSN 表面清晰的介孔結構，其形態為分散均勻的球體，圖5B中可以看到PDA包覆后MSN的表面覆蓋了一層薄膜，介孔結構被掩蓋，表明PDA成功包覆。

圖5 MSN（A）和MSN @PDA（B）的TEM照片Fig 5 TEM diagram of MSN（A）and MSN@PDA（B）

2.3.4 馬爾文粒度電位儀分析納米粒子的粒徑及Zeta電位 結果如圖6所示，MSN的粒徑為118 nm，電位為－（24.2±0.4）mV，MSN@PDA粒徑為148 nm，電位為－（10.8±0.2）mV，MSN@PDA-PEG-ZOL粒徑為（229.1±8.8） nm，電位為－（30.3±0.6）mV，這是由于ZOL在溶液中呈負電性，也說明ZOL成功修飾在納米粒子表面，納米粒子的多分散性指數（PDI）在0.21～0.42（在可接受的大小范圍內）。

圖6 MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的粒徑（A）和電位（B）Fig 6 Particle size（A）and potential（B）of MSN，MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

2.3.5 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的穩定性 連續7 d觀察納米粒子MSN@PDA-PEG-ZOL在37℃的水中及PBS中的穩定性，結果如圖7所示，結果表明在兩種介質中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL均能保持良好的粒徑大小，說明納米顆粒在體內及體外環境下都較穩定。

圖7 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的粒徑Fig 7 Particle size of MSN@PDA-PEG-ZOL in water and PBS

2.4 體外藥物釋放考察

考察MSN@3-MA-PDA與MSN@3-MA-PDAPEG-ZOL在不同pH緩沖液中的釋藥性。分別取三組樣品適量，每組平行三份，每份8 mg，精密稱定。于2 mL PBS中超聲至完全溶解，放入透析袋（截斷分子量3500）。透析袋浸泡在18 mL的PBS（pH為5.0、6.0、7.4）中，調整轉速為200 r·min－1。于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 取樣 1 mL，同時迅速補加同等體積溶出介質。使用紫外分光光度法測定3-MA含量，并使用公式（3）計算出不同時間累計釋放率（CRP）。

式中，Ve為每次所取出的PBS溶液體積（L）；V0為緩沖溶液總體積（L）；Ci為第i次取出溶液的3-MA濃度（mg·mL－1）；n為取液次數；m3-MA為藥物載體所負載的3-MA總質量（mg）。

如圖8所示，圖8B中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL在pH 7.4的PBS溶液中釋藥緩慢，平均釋放率僅為（16.99±0.15）%，而在酸性條件下，3-MA的釋放度增加，在pH 5.0的PBS溶液中釋放率達到（65.11±1.64）%。說明MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL有利于藥物在腫瘤微環境中的釋放。

圖8 MSN@3-MA-PDA（A）與MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL（B）在pH 5.0、6.0、7.4條件下的藥物釋放曲線Fig 8 Release curves of MSN@3-MA-PDA（A）and MSN@3-MAPDA-PEG-ZOL（B）in PBS（pH 5.0，6.0，and 7.4）

3 討論

本文使用模板劑法制備了MSN，將PDA包覆MSN納米粒子后，在其表面修飾ZOL與NH2-PEGSH的連接物，制得具有骨靶向性與pH響應性的載藥納米顆粒MSN@PDA-PEG-ZOL。通過1H-NMR、FT-IR證實ZOL與NH2-PEG-SH連接成功。采用TEM、FT-IR、動態光散射粒徑分布儀（DLS）等表征手段對MSN@PDA-PEG-ZOL合成產物進行結構與性能分析。結果表明該納米顆粒的粒徑及Zeta電位分別為（229.1±8.8）nm、－（30.3±0.6）mV；通過浸漬離心法負載3-MA，結果表明，這種多功能MSN納米顆粒具有高包封率和高載藥量，并在體內外具有較好的穩定性。

MSN表面包覆的PDA具有pH響應性，在酸性條件下溶解釋放藥物，而本試驗的體外釋藥結果也初步證實了在腫瘤微環境中釋藥量明顯高于在正常生理環境下的釋藥量，這在生物醫藥領域具有潛在的應用價值。后續將繼續深入研究該納米顆粒在小鼠體內藥效學及體內外靶向性，進一步證實納米粒子對腫瘤的靶向性，為后續骨相關疾病的治療與自噬抑制劑的遞送奠定研究基礎。