維胺酯原料藥的有關物質分析

李鈺鑫，蘭文*，劉雁鳴（1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001；2.國家藥品監督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 410001）

維胺酯，化學名為N-（4-乙氧碳基苯基）維甲酰胺，因結構與全反式維A 酸類似，其作用機制與13-順維A 酸及芳香維A 酸較相似，但刺激性低于維A酸，不良反應比維A酸少，治療指數為維A酸的10倍[1-2]。維胺酯能夠調節和控制上皮細胞分化與生長，減少皮脂分泌，抑制角質形成細胞的角化過程，使角化異?；謴驼?，發揮抗雄激素、抗炎、調節免疫及預防瘢痕形成等作用，用于治療各種痤瘡、角化異常性皮膚病等，同時對魚鱗病、銀屑?。ㄅＦぐ_）、苔蘚類皮膚病、黏膜病及結締組織等疾病也有一定療效[3-5]。維胺酯為我國自行研制的維A酸類藥物，維A酸作為起始原料與三氯化磷反應轉化為維A酰氯，再與苯佐卡因反應生成維胺酯，反應路線如圖1所示。目前國內僅3家維胺酯原料生產企業，國內外藥典均未收載該品種[6-7]，現行標準為《國家藥品標準》化學藥品地標升國標第二冊[WS-10001-（HD-0164）-2002]和原國家食品藥品監督管理總局標準YBH14602008，與《國家藥品標準》化學藥品地標升國標第二冊標準比較，原國家食品藥品監督管理總局標準YBH14602008增訂了有關物質及殘留溶劑檢查，有關物質方法僅對雜質總量進行控制。本文在現行標準基礎上，結合《中國藥典》2020年版四部指導原則[8]，首次建立了同時測定維胺酯中維A酸和其他雜質的HPLC方法；并采用液質聯用技術[9-10]結合強制降解試驗，對主要未知雜質峰進行定性分析并推測雜質來源。采用ADMET Predictor 軟件[11]對維胺酯及其主要雜質進行毒性預測，為制訂維胺酯原料藥的質量標準提供參考。

1 材料

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；十萬分之一MS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；1290-6550型高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（美國安捷倫公司）。

維胺酯對照品（純度：99.03%，批號：190303，C公司，湖南省藥品檢驗研究院標定）；維A酸對照品（純度：99.4%，批號：100307-200902，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，Burdick ＆Jackson）；水為純化水；其他試劑均為分析純；15批維胺酯原料藥（A公司，批號分別為170101、170102、170103、181002；B公司，批號分別為161205、161206、190303、190304、190305；C公司，批號分別為V2A20160501、V2A20160502、V2A20160503、VIA-20190401、VIA-20190402、VIA-20190403）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（93∶7）；流速：1.0 mL·min－1，檢測波長：370 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取維胺酯約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取維A酸對照品約12.5 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統適用性溶液的制備 取維胺酯對照品適量，加甲醇超聲溶解并稀釋成每1 mL中約0.5 mg的溶液，取溶液適量，于（2500±500）lx光照強度下照射30 min，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 取“2.2”項下系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液及稀釋劑（甲醇）各20 μL進樣測定，結果顯示維胺酯的出峰時間約15.6 min，維A酸的出峰時間約6.363 min，峰形對稱性較好，維A酸理論塔板數在11 000以上，主峰與已知雜質維A酸及其他未知雜質峰均有效分離?？瞻兹軇y定無干擾，結果見圖2。

2.3.2 強制降解試驗 采用光照、酸、堿、氧化、高溫等劇烈條件對本品（批號：170101）進行破壞性降解處理。取本品25 mg，平行5份，分置50 mL量瓶中，經以下條件進行破壞處理：① 光照破壞[于照度（2500±500）lx下放置5 d]；② 酸破壞（1 mol·L－1鹽酸溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1氫氧化鈉溶液調至中性）；③ 堿破壞（1 mol·L－1氫氧化鈉溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1鹽酸溶液調至中性）；④ 氧化破壞（3%過氧化氫溶液1 mL，放置4 h）；⑤ 高溫破壞（置150℃烤箱中放置4 h，放冷）。結果表明：光照破壞試驗中，在主峰相對保留時間0.9處的未知雜質峰面積明顯增加，命名該雜質為雜質A，說明本品易被光破壞，后期試驗均采用避光操作；其他破壞試驗產生了少量雜質，各雜質均能與主峰完全分離，表明本色譜系統專屬性良好。在各破壞試驗記錄的色譜圖中，主峰保留時間2倍以后的基線平穩且沒有檢測出其他雜質峰，故供試品溶液的采集時間擬定為主峰保留時間的2倍，見圖3。

圖3 維胺酯強制降解試驗色譜圖Fig 3 HPLC chormatogram for forced degradation test of viaminate

2.3.3 維A酸的線性關系考察 取維A酸對照品20.43 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對照品儲備液。分別精密量取維A酸對照品儲備液適量，用甲醇依次稀釋配成質量濃度約為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、50.0 μg·mL－1的系列對照品溶液。精密量取上述溶液各20 μL，依法測定，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝136.34X－15.255，r＝1.000，結果表明，維A酸在0.1015～50.76 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.3.4 進樣精密度試驗 取“2.3.3”項下第4份溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖，結果RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 回收試驗 精密稱取已知維A酸雜質量（0.052%）的樣品（批號：170101）約25 mg 6份，分別置50 mL棕色量瓶中，各精密加入維A酸對照品溶液（質量濃度為0.1244 mg·mL－1）1 mL，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算回收率，平均回收率為98.12%，RSD為0.53%。

2.3.6 定量限及檢測限考察 取維胺酯和維A酸對照品各適量，逐級稀釋，各取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。設定量限S/N＝10，檢測限S/N＝3，得維胺酯和維A酸的定量限依次為0.058 μg·mL－1和0.074 μg·mL－1，檢測限依次為0.020 μg·mL－1和0.039 μg·mL－1，

2.3.7 重復性試驗 取“2.3.5”項下6份供試品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得維A酸的量為0.59%，RSD為1.0%；其他單個雜質量為0.28%，RSD為1.0%；各雜質總量為1.0%，RSD為1.2%。

2.3.8 穩定性試驗 取“2.2”項下供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，進樣測定，結果供試品溶液中維A酸、其他單個雜質及各雜質的總峰面積的RSD分別為1.3%、0.88%及0.60%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.9 耐用性試驗 使用3個品牌色譜柱[Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch Ultimate X C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL TYPE MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）]調整柱溫、流速、流動相比例等色譜條件進行耐用性考察，結果峰形和分離均較好，精密稱取維胺酯（批號：170101）約25 mg 依法測定有關物質，結果見表1。

表1 維A酸的耐用性試驗結果Tab 1 Durability of retinoic acid

2.4 樣品含量的測定

取3家公司的15批樣品依法測定有關物質，維A酸含量以外標法按峰面積計算，其他雜質含量采用主成分自身對照法計算，結果見表2。

表2 樣品有關物質測定結果(%)Tab 2 Related substances of samples (%)

2.5 未知雜質質譜分析

樣品的測定結果表明，3家公司的15批樣品均檢出降解雜質A，且含量達0.1%，可能存在安全隱患，有必要對未知雜質進行歸屬。本文采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間液質聯用儀[10]，在ESI負離子模式下，得到該未知雜質的一、二級質譜信息，結果顯示雜質A與維胺酯的分子離子峰和離子碎片幾乎相同，結果見圖4。

2.6 雜質毒性預測和評價

使用Chemdraw軟件畫出維胺酯及雜質的結構式并保存為“.mol”格式，導入ADMET Predictor軟件，對維胺酯及維A酸、雜質A的毒理性質參數進行全面預測。結果顯示三者主要毒性為肝臟毒性，另外還有潛在致敏性和生殖毒性，維A酸的預測毒性低于維胺酯，雜質A與維胺酯的毒性預測結果基本一致，結果見表3。

表3 ADMET Predictor 軟件預測結果Tab 3 Predict outcomes by ADMET Predictor software

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

維胺酯脂溶性較強，且遇光易變質，產生的降解雜質與主峰較難達到基線分離，故選擇光破壞溶液作為系統適用性溶液?，F行標準YBH14602008有關物質檢查方法采用C18柱，采用不同品牌、不同型號的C18柱，適當調整流動相比例，均能將維胺酯與光降解雜質有效分離。

3.2 溶劑的選擇

分別考察用流動相、甲醇及水作為溶劑時對有關物質測定的影響，結果顯示當使用水為溶劑時，樣品幾乎不溶解；當使用流動相為溶劑時，樣品很難溶解。最終選擇甲醇作為稀釋劑，供試品溶解完全，且稀釋劑與主成分維胺酯對待測組分無干擾。

3.3 波長的選擇

截取系統適用性溶液DAD圖中維胺酯的紫外光譜圖、對照品溶液DAD圖中維A酸的紫外光譜圖、供試品溶液DAD圖中主要雜質的紫外光譜圖及破壞試驗DAD圖中主要降解雜質的紫外光譜圖，結果顯示：維胺酯在370 nm波長處有最大吸收，特殊雜質維A酸、雜質A及其他主要雜質在該波長處都有一定的吸收，故選擇370 nm作為有關物質的檢測波長。

3.4 雜質A的來源分析

強制降解試驗表明，維胺酯光照敏感，在強光條件下降解產物雜質A的峰面積明顯增加，進一步對該雜質進行質譜分析，其質譜圖與維胺酯質譜圖一致，經企業調研和文獻查閱，維胺酯為全反式維A酸的衍生物，其為全反式維A酸的酸根經?；?，與氨基反應生成的衍生物，因此也為全反式結構，且維A酸見光易轉化為其順式異構體異維A酸，推斷其為維胺酯的同分異構體（或順式維胺酯）。雜質A來源分析見圖5。

圖5 雜質A可能來源Fig 5 Formation mechanism of impurity A

3.5 限度擬訂

維A酸為維胺酯合成的起始原料，直接反映維胺酯生產工藝的優劣；雜質A為維胺酯的主要降解雜質，反映其儲存條件下質量的優劣，故對雜質維A酸及雜質A進行質量控制?，F行標準有關物質項中僅對總雜質量進行控制，限度為2.0%；參考ADMET Predictor軟件毒性分析結果：維A酸、雜質A同維胺酯的毒性相當；同時考慮維胺酯相關制劑的治療周期為4～6周，非長期用藥；結合各企業近效期樣品的試驗考察結果以及工藝控制情況，暫擬訂限度為維A酸不得過0.5%，雜質A不得過0.5%，其他單雜不得過0.5%，各雜質總和不得過2.0%。

3.6 維胺酯的質量現狀

根據對國產3家主要生產企業產品的有關物質檢查結果，工藝雜質維A酸含量均小于0.1%，說明國內企業對該雜質控制均較好；各企業均檢出光降解雜質A，說明在樣品儲存過程中，企業應嚴格控制儲存條件，避免其光照降解。

4 結論

本文建立了一種有效檢測維胺酯原料藥中有關物質的高效液相色譜法?；谫|譜數據，結合強制降解試驗結果以及維胺酯的處方和生產工藝，推測維胺酯中主要雜質的結構與來源，并用計算機軟件預測雜質的毒性，為維胺酯的質量控制奠定了基礎，為該品種的處方和生產工藝、質量控制及儲存條件提供了參考依據。