基于微透析結合UPLC的弩藥微乳經皮給藥后多成分皮膚藥動學研究

謝歡,宋選飛,周斌,劉耀,2,3,楊芳芳,2,3,陳迎龍,朱艷,張永萍,2,3

(1.貴州中醫藥大學藥學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術研究中心,貴州 貴陽 550025;3.國家苗藥工程技術研究中心,貴州 貴陽 550025;4.貴州中醫藥大學針灸推拿學院,貴州 貴陽 550025;5.貴州健康職業學院中醫藥系,貴州 銅仁 554300)

微透析是一種動態監測活體組織或器官中內源性物質和外源性物質的細胞外含量變化的技術[1],具有多位點實時采樣、采樣量小且所得樣品純凈等諸多優點[2]。但由于微透析實驗中采樣量較少,待測物含量較低,為滿足檢測限要求,微透析常與各種靈敏度高的分析方法如UPLC、LC-MS/MS、HPLC-MS/MS、GC-MS等聯用,這樣不僅可以監測組織或器官的細胞外液中游離分子的水平,還可以闡明藥物的體內過程及其組織或器官靶向性[3-4]。微透析技術最初旨在研究動物大腦中的內源性物質[5],但后來也逐漸應用于關節[6]、肝臟[7]、皮膚[8]、血液[9]等部位。

苗醫弩藥針療法是苗醫外治法中的經典療法[10],常用配方由生草烏、白龍須、黑骨藤、透骨香、大血藤5味藥材組成。其中以熱藥為主,冷藥為輔,五藥合用共奏祛風除濕、散寒止痛、舒筋活絡之功,用于治療各種風濕疾病[11]。傳統的弩藥針制法粗獷,易造成交叉感染,且使用時患者疼痛感明顯,順應性較差;經改良后的弩藥也有使用劑量不準確,可控性較差等缺點,極大地阻礙了其臨床應用及推廣。課題組前期已成功將弩藥液制備成弩藥微乳,可解決弩藥針療法易交叉感染、依從性差等缺點[12];同時,本課題組前期研究表明,弩藥微乳經皮給藥治療膝骨關節炎模型大鼠具有較好的療效,但其經皮給藥后的藥動學特征目前尚無研究。因此,本研究擬采用微透析實時采樣技術結合UPLC,考察弩藥微乳經皮給藥后多種有效成分的皮膚藥動學特征,以期為該制劑后續研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC儀(Waters公司);瑞典CMA4004微透析系統(康森特生物科技有限公司);RYJ-12B透皮擴散儀(上海圣科儀器設備有限公司);DJ-A恒溫磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司);DZF-6210真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);HY-2雷磁渦旋儀(上海儀電科學股份有限公司);AUW1200型電子天平(SHIMADZU公司)。

1.2 試藥

綠原酸對照品(批號:DSTDL002103)、苯甲酰新烏頭原堿對照品(批號:DST230227-056)、杠柳毒苷對照品(批號:DSTDG004101)、新烏頭堿對照品(批號:DSTDX002502),均購于成都德思特生物技術有限公司;黑骨藤、生草烏、大血藤、透骨香、白龍須均購于貴州省貴陽市花果園太升藥材市場(批號:20220619,原產地均為貴州),由貴州中醫藥大學孫慶文教授對藥材進行鑒定;肉豆蔻酸異丙酯(上海麥克林生化科技有限公司,批號:14114475);蓖麻油聚乙烯醚-35(羅恩試劑,批號:61791-12-6);乙腈(安徽天地高純溶劑有限公司,批號:22055173)。

1.3 動物

新西蘭兔,雄性,體質量為2.0～2.5 kg,購于貴陽經濟技術開發區鵬程農業科技公司,許可證號為SCXK(黔)2018-0001,實驗經貴州中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審查編號:20230007)。

2 方法與結果

2.1 微透析分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫:35 ℃,流速:0.2 mL·min-1,檢測波長:235 nm;流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)。梯度洗脫程序為0～1 min,10%B,1～3 min,10%～35%B,3～4 min,35%～40%B,4～9.5 min,40%～42%B,9.5～14 min,42%～10%B,進樣量為1 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸4.83 mg,苯甲酰新烏頭原堿4.89 mg,新烏頭堿4.43 mg,杠柳毒苷5.29 mg,選用乙腈定容至10 mL,得質量濃度分別為0.483、0.489、0.443、0.529 mg·mL-1的混合對照品儲備液,置4 ℃冰箱保存。

2.1.3 空白灌流液的制備 稱取磷酸氫二鈉1.195 g,磷酸二氫鈉4.67 g,氯化鈉2.395 g,加水定容至500 mL,過0.22 μm的濾膜,即得。

2.1.4 弩藥微乳的制備 稱取處方量藥材,即黑骨藤30 g,生草烏20 g,大血藤50 g,透骨香50 g,白龍須15 g,共165 g,在80 ℃下,8倍量70%乙醇回流提取1 h,共提取2次,60 ℃減壓濃縮回收乙醇,40 ℃真空干燥,得干浸膏約21.45 g(生藥含量為7.69 g·g-1);精密稱取質量分數為3%的油相(肉豆蔻酸異丙酯)、24%的混合乳化劑(蓖麻油聚乙烯醚-35∶無水乙醇=2∶1),于旋渦震蕩儀上混勻后,加入3%的弩藥干浸膏(即空白微乳總組分質量的3%),繼續旋渦混勻,最后緩慢滴加73%的水,即得。

2.1.5 標準曲線的建立 分別精密吸取混合對照品儲備液0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,用灌流液稀釋定容至10 mL,得不同質量濃度的混合對照品溶液。以峰面積(Y)為縱坐標,質量濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程和相關系數(r)。結果如表1所示,弩藥微乳中4種成分線性關系良好。

表1 4種成分線性回歸方程及線性范圍Table 1 4 Linear regression equations and linear range

2.1.6 專屬性 取空白灌流液、含混合對照品的灌流液及體內微透析樣品分別進樣分析。結果見圖1。結果表明,其專屬性良好,空白灌流液對待測成分無干擾。

注:1.綠原酸;2.苯甲酰新烏頭原堿;3.杠柳毒苷;4.新烏頭堿

2.1.7 精密度 取混合對照品,連續進樣6次,結果顯示,綠原酸、苯甲酰新烏頭原堿、杠柳毒苷、新烏頭堿各峰峰面積的RSD值分別為0.654 3%、0.832 1%、0.306 4%、0.607 6%,均符合要求。

2.1.8 穩定性 取混合對照品,分別于2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析,計算各成分的RSD值,結果表明綠原酸、苯甲酰新烏頭原堿、杠柳毒苷及新烏頭堿各峰峰面積的RSD值分別為2.069 5%、1.212 5%、1.142 3%、1.097 3%,均符合要求,表明各對照品在室溫下放置24 h穩定性良好。

2.2 微透析探針回收率的測定

2.2.1 線性探針前處理 探針在使用前,需以蒸餾水灌流過夜,充分洗凈黏附在探針上的雜質;植入體內時,需先置于0.1%的肝素鈉溶液中,以蒸餾水為灌流液,灌流30 min以上,以防植入體內后發生凝血,影響實驗的進行。微透析試驗過程中所涉及的所有溶液均需經0.22 μm濾膜過濾后方可使用。

2.2.2 回收率的計算 微透析實驗中,半透膜的擴散具有雙向性。在實際在體實驗中,藥物的相對回收率無法計算,當藥物相對回收率與相對損失率近似相等時,即可選用反透析法(即減量法)來校正體內回收率。

增量法:將探針浸入含一定混合對照品的灌流液中,以空白灌流液灌流,此時,藥物從膜外向膜內擴散,所得的溶液為透析液,其相對回收率(RR)=C透析液/C灌流液×100%。

減量法:將探針浸入空白灌流液中,以含一定對照品的灌流液灌流,此時,藥物從膜內向膜外擴散,所得溶液為透析液,其相對損失率(RL)=(C灌流液-C透析液)/C灌流液×100%。

2.2.4 探針回收率影響因素考察

2.2.4.1 溫度對探針回收率的影響 將微透析探針浸沒在裝有含混合對照品灌流液的反應瓶中,控制轉速為300 r·min-1,流速為1.0 μL·min-1,以空白灌流液進行灌流。分別于25、32、37 ℃收集3份透析液,每更換1次溫度需平衡1 h后再收集透析液,每份透析液30 μL。按照色譜條件進樣分析,按公式計算RR。結果表明探針回收率與溫度有關,見圖2。提示我們在體內實驗中,應盡量保持動物體溫的恒定,以防溫度的波動影響探針回收率。

圖2 不同溫度下4種成分RRFig.2 RR of 4 components at different temperatures

2.2.4.2 流速對探針回收率的影響 采用增量法及減量法探究流速對微透析探針回收率的影響。流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 μL·min-1平行收集3份透析液,每更換1次流速需平衡1 h后再收集透析液,每份透析液30 μL。按照色譜條件進樣分析,按公式計算RR及RL。結果見圖3。隨著流速的升高,各成分的回收率均逐漸降低,綜合考慮各成分回收率,最終選擇流速為0.5 μL·min-1進行后續的在體試驗研究。

圖3 不同流速下4種成分RR及RLFig.3 RR and RL of 4 components at different flow velocities

2.2.4.3 藥物的質量濃度對探針回收率的影響 配制3種不同質量濃度(C1、C2、C3)的混合對照品,其中綠原酸、苯甲酰新烏頭原堿、杠柳毒苷、新烏頭堿的質量濃度分別為C1(22.99、13.77、18.10、18.59 μg·mL-1)、C2(39.81、24.42、34.28、32.96 μg·mL-1)、C3(53.39、44.20、60.89、75.42 μg·mL-1)。采用增量法及減量法進行實驗,增量法以空白灌流液進行灌流,探針浸沒在3種不同質量濃度(C1、C2、C3)的混合對照品中。減量法以含3種不同質量濃度(C1、C2、C3)的混合對照品灌流液進行灌流。均收集3份透析液,每更換1次質量濃度需平衡1 h后再收集透析液,每份透析液30 μL。按照色譜條件進樣分析,按公式計算RR及RL,見圖4。結果發現,4種成分在不同質量濃度下的回收率相差不大,表明探針的回收率不會因周圍藥物質量濃度的變化而發生劇烈波動,且各質量濃度下,探針的RR與相對損失率基本一致,表明選用反透析法來校正探針在體回收率是具有可行性的。

圖4 不同質量濃度下4種成分RR及RLFig.4 RR and RL of 4 components in different concentrations

2.2.5 體內回收率 選用新西蘭兔3只,禁食不禁水12 h,用脫毛膏將背部毛發除去,20%烏拉坦(5 mL·kg-1)耳緣靜脈麻醉,固定在加熱板上,植入探針,連接微量注射泵進樣端及出樣端,先采用生理鹽水灌流1 h,再換用PBS緩沖液進行灌流,平衡30 min。采用減量法測定自制探針回收率及在體11 h回收率的穩定性,即選用含混合對照品的灌流液進行灌流,其中綠原酸、苯甲酰新烏頭原堿、杠柳毒苷、新烏頭堿的質量濃度分別為23.35、13.85、19.89、19.31 μg·mL-1。實驗過程中保持動物體溫恒定,流速為0.5 μL·min-1,每隔1 h收集1次樣品,共收集11 h,按公式計算在體回收率。結果顯示,各成分在體回收率在11 h內未出現劇烈波動,見圖5。綠原酸在體回收率為(34.70±12.99)%,苯甲酰新烏頭原堿在體回收率為(20.76±6.18)%,杠柳毒苷在體回收率為(15.60±8.61)%,新烏頭堿在體回收率為(25.49±7.98)%。

圖5 探針在體回收率Fig.5 In vivo recovery rate of the probe

2.3 弩藥微乳經皮給藥后皮膚藥動學研究

2.3.1 色譜條件 除進樣量為10 μL以外,其余色譜條件同體外回收率含量測定相同。

2.3.2 線性關系 分別精密吸取混合對照品儲備液0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、2、5 mL,用灌流液稀釋定容至10 mL,得不同質量濃度的混合對照品。分別進樣10 μL,以峰面積(Y)為縱坐標,質量濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程和r,見表2。

表2 4種成分線性回歸方程及線性范圍Table 2 4 Linear regression equations and linear range

2.3.3 在體微透析實驗 按“2.2.5”項下處理方法操作后,弩藥微乳皮膚涂抹給藥2 mL,給藥面積為4 cm×2 cm,給藥后開始收集樣品,流速為0.5 μL·min-1,分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 h收集透析液。采用UPLC測定各成分含量。然后按“2.2.5”項下測得的探針體內回收率(D,%)進行校正,求得皮膚組織中實際成分的質量濃度,C實際藥物的質量濃度=C透析液藥物的質量濃度/D×100%。采用Graph Pad 8.0軟件,以各時間點下的藥物的質量濃度對時間作圖,得到各成分的藥-時曲線圖,見圖6。采用DAS 2.0軟件對數據進行處理,獲得tmax、Cmax、AUC0-11 h、AUC0-∞、MRT0-11 h、MRT0-∞等藥動學參數,見表3。

圖6 弩藥微乳經皮給藥后皮下組織中4種成分藥-時曲線圖Fig.6 Drug-time curve of 4 components in subcutaneous tissue after transdermal administration of crossbow

表3 各成分藥動學具體參數Table 3 Specific pharmacokinetic parameters of each component

弩藥微乳經皮膚給藥后,各成分皮下質量濃度在3～6 h內達到峰值,平均滯留時間MRT0-∞在7～23 h內,各藥物質量濃度達到峰值后,緩慢下降并維持在一個相對穩定的水平,且一次給藥后,11 h內仍然能在皮下組織中檢測到各成分,表明弩藥微乳中多成分能在皮膚內有一定的濃度蓄積,可在較長時間內持續釋放藥物。

3 討論

微透析是一種在體、實時、動態取樣技術,能夠直接實時地反映靶組織中外源性或內源性物質隨時間變化的趨勢[13]。傳統藥代學、藥動-藥效學研究方法局限性較多,采用微透析進行取樣,所得樣品純凈,無需對樣品進行前處理等繁瑣操作,同時所得透析液中藥物濃度為游離藥物濃度,更能真實、準確地反映藥物在機體內的吸收、分布、代謝、排泄規律及藥-時等規律[14]。

弩藥中最主要的化學成分為生物堿類、酚酸類成分?，F代藥理學研究表明,生草烏中的生物堿類成分具有較好的生理活性[15];杠柳毒苷為黑骨藤所特有的成分,具有抗炎、鎮痛等作用[16];黑骨藤、大血藤等藤類植物富含酚酸類成分,具有抗炎、抗病毒等作用[17]。同時,烏頭類生物堿及杠柳毒苷既為有效成分又是毒性成分,如何合理把握劑量尤為關鍵。因此,本研究選用生物堿類、強心苷類及酚酸類成分為指標性成分,探究其經皮滲透性能,為后續制劑的開發應用提供基礎。

目前皮膚微透析探針常用的有瑞典CMA公司生產的CMA 30探針[18],價格昂貴且多為一次性消耗品?？紤]到所測成分分子量較大,試驗成本等問題,最終選用自制探針[19]進行試驗,其分子截留量為12 kDa,有效透析膜長度為15 mm。經本研究表明,該探針可用于弩藥微乳多成分皮膚藥動學研究。自制探針在體回收率低于體外回收率,可能是因為探針處于環境錯綜復雜的體內,周圍組織液量少,皮膚中的一些蛋白質、多糖等物質,黏附在探針表面,阻礙了藥物在探針內外的交換。鑒于在體取樣時間較長,動物中途蘇醒后發生掙扎易損壞探針,影響實驗進程,且在9 h后各成分下降程度趨于穩定,綜合考慮各因素,最終選擇采樣時間為11 h。

除綠原酸外,其余成分均為脂溶性成分,故優先選用對脂溶性成分具有較好回收率的無水乙醇-PEG400-生理鹽水(5∶2∶3)作為灌流液[20],但與預期結果相反,各成分在該灌流液中回收率均較低。后選用50%無水乙醇為灌流液,5種成分回收率得到一定提高,但仍然低于30%。結合烏頭類成分的性質,選用pH值為5.44的PBS緩沖液為灌流液時,4種成分回收率均大于30%,且在該灌流液中相對穩定。因此,本實驗最終選擇PBS緩沖液為4種成分的灌流液。

本研究建立的UPLC含量測定方法,在14 min內即可對透析液中4種成分進行分離,可滿足在體微透析檢測方法的需求。通過微透析在體實時采樣技術,有效避免內源性物質的干擾及動物種屬差異等問題,所得結果更接近真實情況。