基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 的經典名方溫膽湯化學成分分析

張奎斌，邢斌，宋紋，王仁興，張青青，劉志東，皮佳鑫

（1.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學現代中藥發現與制劑技術教育部工程中心，天津 301617；3.天津宏仁堂藥業有限公司，天津 301617）

溫膽湯源于北周名醫姚僧垣所撰《集驗方》，始見于唐代孫思邈《急備千金要方》，謂：“治大病后，虛煩不得眠，此膽寒故也，宜服溫膽湯?！薄豆糯浀涿侥夸洠ǖ谝慌分校簻啬憸砂胂亩?、竹茹二兩、枳實各二兩，橘皮三兩，生姜四兩，甘草一兩組成?，F代臨床在該方基礎上進行加減裁化以用于治療失眠、高血壓、冠心病、抑郁、精神失常等疾病，效果顯著[1-4]。目前關于溫膽湯的作用機制研究報道較多[5-6]，但其物質基礎并不明確，且多從單味藥入手，未考慮到復方煎煮過程的損失與新成分的生成，缺乏復方系統性研究。此外溫膽湯成分復雜，給其質量控制帶來一定困難。因此，明確溫膽湯化學成分對其藥效物質基礎研究及進一步對其作用機制的闡明、質量控制尤為必要。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法（UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）具有“三高”（高效率、高靈敏度、高分辨率）的特點，通過化合物精確的分子量、元素組成以及質譜碎片等信息，可快速確定化合物的結構。本文采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術對溫膽湯的成分進行分析。根據精確的分子量信息及質譜裂解規律進行解析，并與對照品對照或參考相關文獻數據與質譜數據庫，從而對溫膽湯中化合物進行鑒定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀，美國Thermo 公司；Q-Exactive Orbitrap 質譜，美國Thermo公司；Xcalibur 3.0 工作站，美國Thermo 公司；AX224ZH 萬分之一電子天平，天津奧豪斯儀器有限公司；AX205 十萬分之一天平，瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q 去離子水機，美國Millipore 公司；FDU-2100 冷凍干燥儀，東京理化器械株；N-10000旋轉蒸發儀，上海愛朗琴儀器有限公司。

1.2 試劑 甘草飲片（批號：202001019，產地內蒙古）、竹茹飲片（批號：202001005，產地江西）、枳實飲片（批號：202001007，產地湖南）、陳皮飲片（批號：202001011-1，產地湖北）、生姜飲片（批號：190301-3，產地河北）、半夏飲片（批號：181209，產地甘肅）。上述飲片均由天津宏仁堂藥業有限公司提供，均符合《中國藥典》2020 年版一部有關規定。甘草酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y02J11L113432，純度≥98%）；枸橘苷（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：G-019-171216，純度≥98%）；新橙皮苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：231J6L2067，純度≥98%）；柚皮苷（四川維克奇有限公司，批號：wkq20020603，純度≥98%）；圣草次苷（上海源葉生物有限公司， 批號：M17D9S77644，純度≥98%）；蕓香柚皮苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：P25J9L66554，純度≥98%）；甘草苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：213J11X108109，純度≥98%）；橘皮素（天津中新藥業有限公司，批號：W14-1-2，純度≥98%）；甘草素（上海源葉生物科技有限公司，批號：C26A10Q87049，純度≥98%）；橙皮苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：K09S11L123847，純度≥98%）；辛弗林（中國食品藥品鑒定研究院，批號：110727-201107，純度≥99.4%）；腺苷（天津中新藥業有限公司，批號：W17-0-9，純度≥98%）；芹糖甘草苷（NATURE，批號：120926-46-7，純度≥98%）；野漆樹苷（中國食品藥品鑒定研究院，批號：111919-201804，純度≥95.5%）異甘草素（天津中新藥業有限公司，批號：W05-1-3，純度≥98%）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（質譜級，東京化學工業有限公司）。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），洗脫梯度（0～3 min，95%～86% A；3～7 min，86%～83% A；7 ～13 min，83%～75% A；13 ～15 min，75%～60% A；15～20 min，60%～20% A；20～22 min，20%～0%A；22.01～25 min，95%～95%A），進樣量2 μL，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min。

2.1.2 質譜條件 加熱電噴霧離子源（HESI），正、負離子模式檢測，鞘氣流速35 L/min，輔助氣流速10 L/min，噴霧電壓分別為3.00 kV，毛細管溫度320 ℃，輔助器溫度350 ℃；掃描模式為Full MS/dd-MS2，掃描范圍m/z 100～1500，碰撞能量20/30/40 eV。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 單一對照品母液的配制 精密稱取以下對照品，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度：蕓香柚皮苷5.58 mg、辛弗林5.37 mg、橘皮素5.81 mg、新橙皮苷3.02 mg、甘草酸6.14 mg、甘草素6.48 mg、甘草苷5.41 mg、香蜂草苷5.92 mg、圣草次苷5.73 mg、枸橘苷5.44 mg、柚皮苷5.04 mg、腺苷2.15mg。另精密稱取橙皮苷8.04 mg、芹糖甘草苷2 mg、野漆樹苷5.90 mg 置于25mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。

2.2.2 混合對照品溶液的配制 精密量取蕓香柚皮苷、辛弗林、橘皮素、甘草酸、甘草素、甘草苷、香蜂草苷、圣草次苷、枸橘苷、柚皮苷、橙皮苷、野漆樹苷對照品母液1 mL，新橙皮苷、腺苷、芹糖甘草苷母液對照品2 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，加甲醇定容。

2.3 樣品制備

2.3.1 溫膽湯干膏粉制備 根據《經典名方開發指引》一書劑量換算，一兩折算成3 g，一升折合200 mL。此外，根據處方考證確定溫膽湯的制備工藝為稱取半夏飲片6 g，枳實飲片6 g，竹茹飲片6 g，陳皮飲片9 g，生姜飲片12 g，甘草飲片3 g，加水1 600 mL，煎煮至約400 mL，200 目紗布過濾，以60 ℃水浴減壓濃縮至微黏稠狀態，置于-80 ℃冰箱預凍，再置于FDU-2100 冷凍干燥機干燥24 h，干燥后研磨得到溫膽湯干膏粉。溫膽湯各單味藥干膏粉均以此法制備。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱定0.25 g 溫膽湯干膏粉及各單味藥干膏粉分別置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，以320 W 功率超聲處理45 min。取1 mL 上清液加入3 mL 50%甲醇稀釋，渦旋1 min。將稀釋后的樣品以12 000 rpm離心15 min 取上清即可。

2.4 數據處理 根據一級質譜提供的精確的相對分子質量，采用Xcalibar 3.0 軟件計算可能的分子式（誤差范圍±5.0 ppm），將未知化合物的二級碎片離子與對照品、PubChem、Mass Bank、HMDB 以及相關文獻報道提供的裂解碎片進行比對，進一步確定未知化合物的分子式及結構，并根據二級質譜碎片推導化合物的質譜裂解途徑。

3 結果

3.1 色譜峰鑒定 采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 對供試品溶液進行分析，得到正、負離子模式下的TIC（總離子流圖），見圖1。通過分析準分子離子峰、碎片離子信息，結合對照品和文獻報道以及相關數據庫，共鑒別了121 個成分，包括70 個黃酮類成分，18 個香豆素類成分，9 個皂苷類成分，10 個生物堿類成分、3 個苯丙素類成分以及11 個其他類化合物。其中，15 個成分通過與對照品比對后確認。此外，對成分進行了單味藥歸屬。表1 結果見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

圖1 溫膽湯的TIC 圖

3.2 主要化合物分析鑒定

3.2.1 黃酮類成分 溫膽湯的黃酮類成分主要為游離的黃酮和黃酮苷以及少量的黃酮醇、查爾酮，且大部分來源于枳實與陳皮。其中黃酮苷類成分多為雙糖苷，多存在同分異構體，如柚皮苷與蕓香柚皮苷、橙皮苷與新橙皮苷、枸橘苷與新枸橘苷等。黃酮苷類成分多先裂解糖苷鍵，脫去糖基變成游離的黃酮。糖基可逐漸脫去，亦可整體脫去。游離的黃酮母核C 環易發生RDA（麥氏重排）裂解從而形成一系列特征性離子碎片。此外帶有甲氧基的黃酮可失去甲基，繼而再失去羰基。例如44 號峰，在正離子模式下，其準分離子峰的m/z 為611.196 9[M+H]+，誤差為-0.240 ppm，推測其分子式為C28H34O15。其準分子離子峰發生中性丟失，丟失1 分子葡萄糖得到m/z 449.1433 1 碎片離子，再丟失1 分子鼠李糖得到m/z 303.086 49 的黃酮苷元，亦可直接從準分子離子峰脫去雙糖基得到該離子碎片。該離子碎片帶有甲氧基，丟失1 分子甲基，得到m/z 286.047 76 離子碎片，從而發生RAD 裂解，C 環裂解得到m/z 195.028 96 碎片和m/z 153.018 39 碎片。m/z 195.028 96 離子碎片具有鄰二酚羥基，可脫去1 分子H2O，得到m/z 177.054 84。該峰特征碎片信息與橙皮苷對照品基本相同，且其保留時間基本一致，故可鑒定該峰為橙皮苷。見圖2。

圖2 橙皮苷的質譜裂解途徑

3.2.2 香豆素類成分 溫膽湯的香豆素類成分主要為簡單香豆素類與呋喃香豆素類。簡單香豆素易失去CO 形成苯駢呋喃離子碎片。此外，若是在6 或7 位碳原子具有甲氧基亦可失去甲基。呋喃香豆素的裂解規律亦是如此。如68 號峰，其準分子離子峰為m/z 193.049 79[M+H]，推測其分子式為C10H8O4，誤差為0.284 ppm。該準分子離子峰可先丟失1 分子甲基得到m/z 178.026 20 碎片離子，亦可先丟失1分子CO 得到m/z 165.054 76 苯駢呋喃離子，由于環內含氧可繼續丟失CO，得到m/z 133.028 63 碎片離子，再丟失1 分子甲基得到m/z 118.034 81 碎片離子。與文獻中東莨菪內酯質譜二級碎片信息基本一致，故可鑒定68 號峰為東莨菪內酯，見圖3。

圖3 東莨菪內酯質譜裂解途徑

3.2.3 皂苷類成分 溫膽湯的皂苷類成分，大多來源于甘草。以88 號峰為例闡述皂苷類成分結構鑒定過程。在正離子模式下，該化合物的準分子離子峰m/z 823.410 30[M+H]+，推測出分子式為C42H62O16，誤差為-0.950 ppm。該化合物依次脫去1 分子葡萄糖先后得到m/z 647.379 46 碎片離子與m/z 471.346 86 苷元離子，該碎片脫去1 分子H2O，得到m/z 453.336 64 碎片離子，再進行RDA 裂解，得到m/z 261.112 34 碎片離子。此外通過與甘草酸對照品比對，該峰鑒定為甘草酸，見圖4。

圖4 甘草酸的質譜裂解途徑

3.2.4 生物堿類成分 溫膽湯的生物堿類成分主要來源于枳實與陳皮。鑒于枳實和陳皮中均含有辛弗林，且辛弗林為枳實的質量控制成分，因此以辛弗林為例解析其裂解規律。在正離子模式下，生物堿類成分響應較高，其準分子離子峰為m/z 168.102 10[M+H]+，脫去1 分子H2O 得到m/z 150.091 54 碎片離子，該碎片為仲胺離子可丟失1 分子甲基或丟失1 分子C2H5N，得到m/z 135.068 10 碎片離子和m/z 107.049 58 碎片離子。m/z 135.068 10 碎片亦可發生雙鍵斷裂丟失1 分子C=NH2得到m/z 107.049 58 碎片離子。該碎片脫去1 分子H2O 發生β 裂解，經重排生成穩定的卓鎓離子m/z 91.054 80。此外m/z135.068 10 碎片也可丟去1 分子NH3得到m/z 119.049 42 碎片離子，見圖5。

圖5 辛弗林的質譜裂解途徑

4 討論

實驗前期采用不同的梯度洗脫條件，考察了不同比例的甲酸水以及不同有機相的分離效果，發現在現用的洗脫梯度下，0.1%甲酸水-乙腈作為流動相具有較好的峰形和分離度。

實驗結果表明溫膽湯主要成分為黃酮成分，其次是香豆素類成分、皂苷類成分以及生物堿。這些成分主要來源于枳實、陳皮與甘草。而半夏、生姜、竹茹鑒定出的成分較少。一則可能是藥物煎煮時間過長，導致相關成分發生降解。例如2020 版《中國藥典》規定的生姜含量測定成分6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚均未在溫膽湯中檢出，但能檢測出6-姜烯酚。有文獻報道長時間的加熱，6-姜辣素會轉化為6-姜烯酚[36]。二則存在一些未鑒定出的化合物，還有待以后深入研究。

本實驗利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術對溫膽湯進行快速分析。根據化合物的精確相對分子質量、二級碎片峰信息，通過參考相關文獻、成分質譜裂解規律以及與對照品比對，鑒定出溫膽湯中121 個成分，為溫膽湯藥效物質基礎深入研究、闡明其作用機制、質量控制奠定基礎。然而，本實驗仍有不足之處，生姜、半夏、竹茹鑒定出的成分較少，且黃酮類成分占比居多。此外，鑒定出的化合物存在同分異構體形式，僅部分通過對照品確認，需進一步借助核磁技術進行鑒別和確認。