乳酸菌CICC 6282的鑒定、生物學特性及其在發酵辣椒中的應用

高 逸，張 健，陳國輝，辛 迪，彭 蕓，戚晨晨，翟 磊，姚 粟*

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100027；2.新疆新康農業發展有限公司，新疆 烏魯木齊 830023）

發酵辣椒是指新鮮辣椒在微生物發酵作用下，形成一種具有特殊風味以及營養價值的食品[1]。傳統自然發酵辣椒通常以家庭為單位，利用辣椒自身攜帶的乳酸菌進行發酵，這種自發性發酵發酵效率低，品質參差不齊[2]。新鮮辣椒本身攜帶能夠還原硝酸鹽的微生物，使自然發酵辣椒中亞硝酸鹽富集，亞硝酸鹽在人體內消化過程中易形成強致癌物亞硝胺[3]。同時，微生物發酵辣椒會代謝產生生物胺，人體攝入生物胺后會導致頭痛、呼吸紊亂及血壓變化等不良反應[4]。

針對此現象，有研究通過控制發酵時間[5]、改變辣椒處理方式[6]或添加乳酸菌發酵[7]等方式降低亞硝酸鹽或生物胺含量[8]。其中，添加乳酸菌發酵相比其他方式能有效降低亞硝酸鹽與生物胺含量，同時還有加快發酵速度、賦予獨特風味、維持品質穩定、提高安全性等特點，被廣泛應用于辣椒發酵中[9]。王雪雅等[10]向辣椒中分別單獨接種德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）、雙發酵乳桿菌（Lactobacillusbifermentans）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis），測得接種發酵辣椒中亞硝酸鹽含量比自然發酵辣椒均有所降低，且最低為1.7 mg/kg；夏學超等[11]研究發現，酪胺和組胺是發酵辣椒中含量最多的2種生物胺，向辣椒中接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵14 d后，可以降低生物胺含量。為豐富發酵辣椒風味，部分工藝在生產發酵辣椒過程中會加入黃酒、白酒等物質，過高濃度的乙醇會影響乳酸菌生長，導致發酵效果不佳[12]。耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）最初從河北省一個蒸餾酒窖中分離得到[13]，其能夠利用葡萄糖和果糖等糖產生乳酸[14]，并能在高乙醇和低糖濃度的惡劣條件下生存[13]，同時能夠產生多種揮發性化合物特別是酯類和萜烯類，增加發酵產品的獨特風味[15]。因耐乙醇片球菌具有高乙醇耐受性，為發酵辣椒風味提供了更多的可能。LI Y等[15]在東倉泡菜辣椒中分離獲得一株可以降低發酵辣椒中亞硝酸鹽含量的耐乙醇片球菌M1117，但未對生物胺含量進行檢測。

本研究以從新疆傳統發酵辣椒中分離得到的優勢乳酸菌CICC 6282為研究對象[16]，采用形態觀察、生理生化實驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，從耐鹽耐酸能力、抑菌能力、生長狀況、產酸能力、亞硝酸鹽降解能力和氨基酸脫羧酶活性等方面全面表征其生物學特性，并將該菌株接種到辣椒發酵過程中，通過測定發酵辣椒的總酸含量、亞硝酸鹽含量和生物胺種類及含量探究該菌株在發酵辣椒過程中的作用，探討乳酸菌CICC 6282作為發酵劑的可能性，并為其作為發酵劑改良發酵辣椒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

乳酸菌菌株CICC 6282：分離于新疆傳統發酵辣椒樣品；大腸埃希氏菌（Escherichia coli）CICC 10354：中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；螺絲椒（“豬大腸”辣椒）：市售。

1.1.2 試劑

API 50 CH碳水化合物鑒定生化試劑條：生物梅里埃公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）marker、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）：天根生化科技（北京）有限公司；蛋白酶（50 U/mL）：德國Merk公司；核酸染料GoldView：北京賽百盛基因技術有限公司；溶菌酶：美國Sigma公司；細菌基因組DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；氨基酸脫羧酶生化鑒定管：青島海博生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、MRS培養基：美國Becton Dickinson公司。

1.2 儀器與設備

AC2-4S1生物安全柜：新加坡Esco公司；GHP-9050隔水式培養箱、BHG-8082型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；溫度梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；7200紫外分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；8010掃描電鏡：株式會社日立制作所；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株CICC 6282的鑒定

形態學鑒定：使用四區劃線，將菌株CICC 6282接種至MRS培養基上，37℃培養48 h，記錄菌落形態。取一環新鮮培養的菌體于1 mL 2.5%戊二醛中，4 ℃過夜固定。6 000 r/min離心2 min，收集固定后菌體，使用無菌水漂洗2次，再依次使用體積分數分別為50%、70%、85%、95%與100%的乙醇進行梯度脫水后，進行二氧化碳臨界點干燥。將干燥后的樣品放置在載物臺上進行噴金，使用掃描電鏡觀察菌體形態[17]。

生理生化鑒定[18]：使用API 50 CHL鑒定系統對菌株CICC 6282的底物利用特征進行檢測。

分子生物學鑒定[19]：使用細菌基因組提取試劑盒提取菌株CICC 6282的基因組DNA，以其為模板，利用引物27F與1492R對16S rRNA基因序列進行PCR擴增；利用引物21F和23R對pheS基因序列進行PCR擴增。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，將檢測合格的PCR擴增產物委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

使用ContigExpress軟件對測序結果進行分析，將分析后結果遞交到EzBioCloud和美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行比對分析，選取近緣種的16S rRNA基因和pheS基因序列，采用MEGA 7.0軟件中的Clustal功能進行多序列比對，并使用鄰接（neighbour joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.2 菌株CICC 6282的生物學特性研究

將菌株CICC6282接種至MRS肉湯培養基，37 ℃活化培養48h，重復活化1次，使菌懸液的活菌數達到6×108CFU/mL，作為種子液備用[20]。

耐鹽和耐酸能力的測定：將種子液按照1%（V/V）的接種量，分別接種至含2%、4%、6%、8%、10%NaCl的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養48 h，測定OD600nm值，探究NaCl含量對菌株CICC 6282生長的影響；將種子液按照1%（V/V）的接種量，分別接種至pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養48 h，測定OD600nm值，探究pH值對菌株CICC 6282生長的影響[21]。

生長曲線與產酸能力的測定：將種子液按照1%（V/V）的接種量接種至MRS肉湯培養基中，37 ℃培養48 h，每4 h測定OD600nm值，同時使用pH計測定發酵液的pH值[22-23]。

亞硝酸鹽降解能力的測定：將種子液按照1%（V/V）的接種量接種至含有125 μg/mL NaNO2的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養48 h，使用鹽酸萘乙二胺法測定培養24 h和48 h后發酵液中的NaNO2含量[24]。

氨基酸脫羧酶試驗：將活化好的菌落制備成6×106CFU/mL的菌懸液，將0.1 mL菌懸液加入氨基酸脫羧酶試驗的安瓿瓶中，37 ℃培養24 h后，記錄試驗管與對照管結果。

抑制大腸埃希氏菌生長實驗：將種子液按照1%（V/V）的接種量，接種至MRS肉湯培養基中，37 ℃培養48 h后，8 000 r/min離心2 min，取上清液。參照GB4789.43—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗微生物源酶制劑抗菌活性的測定》測定上清液對大腸埃希氏菌的抑菌效果[25]。

1.3.3 發酵辣椒的發酵工藝流程[26]

操作要點：

選料清洗：挑選出無褐變、無腐爛的新鮮螺絲椒（“豬大腸”辣椒），清洗干凈。

破碎、裝瓶：去蒂去籽后，將辣椒剁碎，稱取100 g辣椒放入滅菌后的發酵瓶中，同時加入3%白砂糖和3%食鹽。

自然發酵：擰緊發酵瓶，搖勻后，置于30 ℃下自然發酵7 d，制成發酵辣椒。

接種發酵：將菌株CICC 6282接種至MRS肉湯培養基，37 ℃活化培養48 h，重復活化1次，使菌懸液的活菌數達到6×108CFU/mL，作為種子液。將種子液按照1%的接種量接種至辣椒中。擰緊發酵瓶，搖勻后，置于30 ℃下發酵7 d，制成接種發酵辣椒。

1.3.4 發酵辣椒品質的測定

亞硝酸鹽含量的測定：采用鹽酸萘乙二胺法[24]?？偹岷康臏y定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法[27]。生物胺種類及含量的測定：參照GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》中的第一法液相色譜（LC）法[28]。

1.3.5 數據處理

每個實驗設置3次平行，使用Excel 2021軟件處理數據，結果用“平均值±標準差”表示。使用SPSS 18.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株CICC 6282的多相分類學鑒定

2.1.1 形態學鑒定

菌株CICC 6282的菌落及細胞形態見圖1。由圖1可知，菌株CICC 6282在MRS培養基上的菌落呈白色，表面濕潤，圓形且邊緣整齊；菌體呈球狀，單個、成對或成堆排列，直徑為0.6～1.1 μm。

圖1 菌株CICC 6282的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of strain CICC 6282

2.1.2 生理生化鑒定

菌株CICC 6282對不同碳源的利用情況見表1。由表1可知，菌株CICC 6282 能利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、七葉靈、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-龍膽二糖產酸，不能利用其他碳源產酸。

表1 菌株CICC 6282對不同碳源的利用情況Table 1 Utilization of different carbon sources by strain CICC 6282

2.1.3 分子生物學鑒定

基于16S rRNA基因序列構建菌株CICC 6282的系統發育樹，結果見圖2A。由圖2A可知，菌株CICC 6282與耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）DSM 22301T和酒窖片球菌（Pediococcus cellicola）DSM 17757T聚于一大分支，同源性分別達到99.93%、98.73%。因此，通過16S rRNA基因序列鑒定只能將菌株CICC 6282鑒定為片球菌屬（Pediococcus）。在此基礎上，進一步采用pheS基因確定菌株CICC 6282的分類學地位，結果見圖2B。由圖2B可知，菌株CICC 628與耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）DSM 22301T聚于一支，同源性達99.90%，親緣關系最近，與其他模式菌株的同源性均在87%以下。結合形態觀察及生理生化實驗結果，最終將菌株CICC 6282鑒定為耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）。

圖2 基于16S rRNA（A）與pheS（B）基因菌株CICC 6282的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CICC 6282 based on 16S rRNA (A)and pheS (B) gene

2.2 耐乙醇片球菌CICC 6282的生物學特性研究

2.2.1 耐鹽及耐酸試驗

隨著食品加工變得更加多樣化，對于乳酸菌對發酵環境的耐受性提出了更高的要求[29]，因此，考察耐乙醇片球菌CICC 6282的耐鹽及耐酸性，結果見圖3。由圖3可知，隨著NaCl含量的升高與pH值的下降，菌株CICC 6282的OD600nm值均呈下降趨勢，當NaCl含量為10%、pH值為3.0時，OD600nm值為0，說明菌株CICC 6282在該條件不能生長；當NaCl含量為8%時，OD600nm值為0.635，pH為4.0時，OD600nm值為0.128，說明菌株CICC 6282在8%NaCl生長良好，在pH 4.0的條件下生長雖受到了抑制，但仍能生長，說明菌株CICC 6282可耐受8%NaCl和pH 4.0的環境。谷懿寰等[30]從內蒙古奶豆腐中分離鑒定得到一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）S28，其能夠耐受6%NaCl與pH4.5的環境，在pH 4.0的培養基中OD595nm值與對照無差異，與本研究菌株CICC 6282相比具有更好的耐酸及耐鹽性。此外，IUCHI A等[31]研究發現，從發酵泡菜中分離到的耐乙醇片球菌A4-27能夠耐受10%NaCl與pH 4.0的環境。這與本研究結果一致，說明耐乙醇片球菌具有良好的耐鹽性與一定的耐酸性，具有作為發酵菌劑的潛力。

圖3 耐乙醇片球菌CICC 6282的耐鹽（A）和耐酸（B）試驗結果Fig.3 Results of salt (A) and acid (B) tolerance tests of Pediococcus ethanolidurans CICC 6282

2.2.2 生長曲線及產酸能力

耐乙醇片球菌CICC 6282的生長曲線及產酸能力見圖4。由圖4可知，菌株CICC 6282在培養過程中，0～12 h為遲滯期，12～36 h為生長對數期，36～48 h為穩定期。同樣，菌株CICC 6282在培養12～36 h產酸速率較快，36 h之后產酸速率趨于穩定，pH基本穩定在4.2保持不變。董碩等[32]研究發現，隨著發酵時間的延長，當pH值降至5.0，細菌開始受到抑制，pH＜4.0時，乳酸菌總數也開始降低。耐乙醇片球菌CICC 6282可以在26 h內將pH降至5.0以下，且維持pH在4.2，抑制了辣椒中細菌生長。

圖4 耐乙醇片球菌CICC 6282的生長曲線及產酸曲線Fig.4 Growth curve and acid production curve of Pediococcus ethanolidurans CICC 6282

2.2.3 亞硝酸鹽降解能力

耐乙醇片球菌CICC 6282對亞硝酸鹽的降解能力見圖5。由圖5可知，隨著培養時間的延長，菌株CICC 6282降解亞硝酸鹽的能力增強，培養24 h時，亞硝酸鹽降解率為90.2%；培養48 h時，亞硝酸鹽降解率達到100%。田輝等[33]對分離自甘肅省傳統泡菜中的2株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）與1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的亞硝酸鹽降解能力進行檢測，結果發現，植物乳桿菌Lp-9-1的亞硝酸鹽降解率最高為50%；趙海霞等[34]從甘肅農戶漿水中分離得到35株具有亞硝酸鹽降解能力的乳酸菌，其中植物乳桿菌通渭A7的亞硝酸鹽降解率最高，為93.81%。相比之下，耐乙醇片球菌CICC 6282具有更高的亞硝酸鹽降解能力。

圖5 耐乙醇片球菌CICC 6282的亞硝酸鹽降解能力測定結果Fig.5 Determination results of nitrite degradation capacity of Pediococcus ethanolidurans CICC 6282

2.2.4 氨基酸脫羧酶試驗

有研究發現，發酵微生物能代謝產生氨基酸脫羧酶，進而通過脫羧作用產生生物胺，生物胺被人體攝入后能夠引起心跳加速、血壓異常等中毒癥狀[35]。因此，考察耐乙醇片球菌CICC 6282的氨基酸脫羧酶活性，結果發現，菌株CICC 6282的精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶活性均為陰性。其中精氨酸在精氨酸雙水解酶作用下生產鳥氨酸，鳥氨酸經過鳥氨酸脫羧酶作用生成腐胺[36]。蛋白質腐敗時賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的作用下發生脫羧反應生成尸胺[37]。尸胺與腐胺可以用來評價食品的新鮮或腐敗程度，其含量可作為衛生質量的指標，而且食品中的尸胺被認為有潛在的危險，對人體有排斥作用，腐胺則可以引起人體各種不良反應[38-39]。結果表明，菌株CICC 6282能夠降低產品中生物胺含量，具有一定發酵安全性。

2.2.5 抑菌活性試驗

有研究發現，大腸埃希氏菌在低酸環境適應一段時間后，會對強酸環境產生耐受性，同時其耐熱性、耐低溫與耐滲透壓的能力也會有所增強[40]。因此檢測耐乙醇片球菌CICC 6282發酵上清液對大腸埃希氏菌抑制作用，結果見圖6。由圖6可知，耐乙醇片球菌CICC 6282周圍有明顯的透明抑菌圈，抑菌圈直徑為23 mm，說明菌株CICC 6282發酵上清液能夠抑制大腸埃希氏菌生長，能夠有效預防發酵蔬菜受到大腸埃希氏菌污染。

圖6 菌株CICC 6282抑制大腸埃希氏菌生長試驗結果Fig.6 Tests results of inhibition of strain CICC 6282 on Escherichia coli growth

2.3 發酵辣椒品質的分析

2.3.1 pH值及總酸含量的測定

辣椒發酵過程中pH值及總酸含量的變化見圖7。由圖7可知，隨著發酵時間的延長，自然發酵和接種發酵辣椒的pH值均呈下降趨勢，且接種發酵辣椒的pH值始終低于自然發酵。自然發酵4 d后pH值下降至4.4，發酵7 d后pH值為4.3；而接種發酵開始后，辣椒的pH迅速下降，發酵4 d后pH值下降至4.1，發酵7 d后pH值為4.0。由圖7亦可知，發酵辣椒總酸含量的變化趨勢與pH值變化趨勢正好相反，且接種發酵辣椒的pH值始終高于自然發酵，發酵7 d時，自然發酵辣椒和接種發酵辣椒的總酸含量分別為4.93 g/kg、5.53 g/kg。這與韓宏嬌等[41]的結果基本一致。結果表明，接種菌株CICC 6282后，菌株CICC 6282快速生長、產酸，導致pH值下降，總酸含量增加。

圖7 辣椒發酵過程中pH值與總酸含量的變化Fig.7 Changes of pH and total acid contents of during chili fermentation process

2.3.2 亞硝酸鹽含量的測定

辣椒發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化見圖8。由圖8可知，隨著發酵時間的延長，自然發酵和接種發酵辣椒的亞硝酸鹽含量均呈現先上升后下降的趨勢，發酵第2天出現亞硝酸鹽峰，接種菌株CICC 6282發酵辣椒中的亞硝酸鹽含量為5.26 mg/kg，自然發酵辣椒中的亞硝酸鹽含量為7.22 mg/kg，發酵7 d時，自然發酵辣椒中的亞硝酸鹽含量為3.31 mg/kg，接種菌株CICC 6282發酵辣椒中的亞硝酸鹽含量為0.71 mg/kg，說明接種菌株CICC 6282可以降低發酵辣椒中亞硝酸鹽含量，進一步提高安全性。

圖8 辣椒發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.8 Changes of nitrite contents during chili fermentation process

2.3.3 生物胺的測定

發酵辣椒中生物胺種類及含量的測定結果見表2。由表2可知，自然發酵辣椒中的生物胺總量為194.41 mg/kg，接種菌株CICC 6282發酵辣椒中的生物胺總量為84.29 mg/kg，相比自然發酵辣椒降低了57%。自然發酵辣椒中檢出尸胺、腐胺、苯乙胺、組胺、酪胺與亞精胺6種生物胺；而在接種菌株CICC 6282發酵辣椒中僅檢出組胺、酪胺與亞精胺3種生物胺，未檢出尸胺、腐胺與苯乙胺。除尸胺、腐胺能夠給人體帶來不良影響外，人體攝入過量苯乙胺也可導致偏頭痛[42]。接種發酵辣椒中未檢出尸胺、腐胺這與菌株CICC 6282氨基酸脫羧酶結果呈陰性相呼應。有研究現，發酵過程中能夠產生苯乙胺的常見細菌多為乳桿菌屬[43]，這也與本研究結果一致。結果表明，耐乙醇片球菌CICC 6282是一種更有效降低生物胺含量的發酵菌株。

表2 發酵辣椒中生物胺種類及含量的測定結果Table 2 Determination results of species and contents of biogenic amines in fermented chili

3 結論

通過形態觀察、生理生化實驗及分子生物學技術將分離自新疆傳統發酵辣椒中的乳酸菌菌株CICC 6282鑒定為耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans），該菌株具有鹽（8%NaCl）、酸（pH 4.0）耐受力強、生長速度快、降解亞硝酸鹽、抑制大腸埃希氏菌生長、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶陰性等良好的發酵特性與安全特性。接種菌株CICC 6282發酵辣椒，能提高發酵辣椒中的總酸含量（5.53 g/kg），降低亞硝酸鹽含量（0.71 mg/kg）及生物胺總量（84.29 mg/kg），且在發酵辣椒中未檢測到尸胺、腐胺、苯乙胺。本研究結果證明了利用耐乙醇片球菌CICC6282作為發酵菌劑的可行性，同時可以提高發酵辣椒安全性，為發酵辣椒工業化生產提供基礎。