高溫大曲中高產淀粉酶和蛋白酶細菌的分離、鑒定及生物學特性研究

蔣澤元，萬義芳，蒲馳中，何遠琴

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

高溫大曲作為醬香型白酒生產過程中重要的糖化劑和發酵劑[1]，含有豐富的微生物及多種酶系[2-6]，在白酒釀造中發揮著糖化、發酵、生香等關鍵作用[7-8]。大曲采用開放生產，微生物區系組成復雜，微生物種類豐富多樣[9]。大曲中的微生物主要是細菌，霉菌次之，酵母最少，大都是有益菌[10]。細菌包括己酸菌、丁酸菌、黏液菌和多種桿菌如乳酸桿菌（Lactobacillus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、醋酸桿菌（Acetobacter aceti）等，其主要優勢細菌菌群為芽孢桿菌（Bacillussp.）[11]。細菌分泌的各種水解酶類組成的酶系更加復雜多樣，產生各種豐富、復雜的代謝產物，如多元醇、呋喃酮類、乙酸乙酯、雜環化合物等，這些化合物是白酒風味及其風味前體物質，是影響醬香型白酒風味的關鍵因素[12]。

芽孢桿菌（Bacillussp.）代謝產生的生物酶酶活力強，能利用乙酸乙酯和乙醇合成丁酸乙酯，并進一步合成己酸乙酯等酯類物質，有的芽孢桿菌還會代謝產生四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、雙乙酰等風味物質[13-14]。趙群麗[15]依據透明圈法初篩和液體發酵測定粗酶液酶活力復篩，從醬香大曲中篩選得到一株產淀粉酶能力較強的枯草芽孢桿菌，并采用氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測到特征發酵產物主要為3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）、2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、愈創木酚、四甲基吡嗪、棕櫚酸；張麗杰等[16]研究表明，枯草芽孢桿菌Nr.5可合成7種烷基吡嗪；吡嗪類物質生成與醬香的形成有關[17]；王西等[18]將從高溫大曲中篩選得到的產香枯草芽孢桿菌應用到醬香型白酒生產中，能增強酒的風格特征。

目前，關于高溫大曲中同時能產淀粉酶和蛋白酶的菌株鮮有報道。因此，本研究采用稀釋涂布平板法、平板劃線法從高溫大曲中分離菌株，利用透明圈法及酶活力測定篩選高產淀粉酶及蛋白酶的菌株，通過形態學觀察及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并對其耐高溫和耐酸性進行研究，為醬香型白酒生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲：貴州省仁懷市茅臺鎮某酒廠。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mastermix：上海李記生物科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：武漢璽矩生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉、可溶性淀粉、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖、氯化鈉（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀（均為分析純）：湖南比克曼生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

瓊脂培養基、淀粉透明圈培養基、蛋白酶透明圈培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基均參考趙麗群[15]的配方，種子培養基參考曾德勇等[19]的配方，產酶培養基參考馬校衛等[20]的配方，牛肉膏蛋白胨培養基參考李桂霞等[21]的配方。

1.2 儀器與設備

UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫療科技有限公司；XS-212-202顯微鏡：常州上特儀器制造有限公司；TD5Z醫用離心機：杭州瑞析科技有限公司；S1000 PCR儀、BIO-RAD Chemi DocXRS凝膠成像系統：成都百樂科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取10 g大曲于燒杯中，加入90 mL無菌水，用玻璃棒攪拌并振蕩20 min，靜置，取上清液按10倍梯度稀釋至10-7，吸取0.1 mL稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液分別涂布于瓊脂培養基平板上，37 ℃培養24 h[15]；用接種環挑取形態不同的菌株分別接種在瓊脂培養基平板上劃線，37 ℃培養，重復上述操作，直至得到單個菌落，將其接種到瓊脂培養基斜面，37 ℃培養24 h，獲得初步純化的菌株。

1.3.2 高產淀粉酶和蛋白酶菌株的篩選

初篩：將分離得到的菌株分別點種于淀粉酶透明圈培養基和蛋白酶透明圈培養基平板上，37 ℃培養24 h；將稀碘液緩慢倒在淀粉酶透明圈培養基平板上，觀察是否有透明圈產生，蛋白酶透明圈培養基可直接觀察透明圈，使用直尺分別量取透明圈的直徑（D）和菌落直徑（d），計算D/d，每株菌進行3個平行實驗。

復篩：將初篩得到的菌株接種到裝液量為60 mL/250 mL的種子培養基中，37 ℃活化20 min后，接種到液體產酶培養基中，35 ℃、130 r/min條件下培養20 h，4 200 r/min離心15 min，取上清液，測定淀粉酶活力和蛋白酶活力。

1.3.3 酶活力測定

淀粉酶活力的測定：參考文獻[22-23]的方法。淀粉酶活力的定義為在37 ℃，pH值6.0條件下，每分鐘水解1 mg淀粉的酶量為一個活力單位（U/mL）。

蛋白酶活力測定：參考文獻[24-25]的方法。蛋白酶活力定義為在40 ℃條件下，1 min內水解酪蛋白產生相當于1 μg酪氨酸的酶量為一個酶活單位（U/mL）[25]。

1.3.4 菌株的鑒定

形態學觀察[26]：將篩選出來的菌株劃線到瓊脂培養基平板，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色，采用顯微鏡觀察細胞形態。

分子生物學鑒定：參照基因組DNA提取試劑盒說明書的操作方法提取菌株的基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物27F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）、1492R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進行PCR擴增[26]，PCR擴增體系：引物27F、1492R各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，雙蒸水（ddH2O）10.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共計35個循環；72 ℃再延伸8 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴增產物委托重慶擬南芥生物科技有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源序列檢索，選取同源性較高的菌株的16S rDNA，利用軟件MEGA 11中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，確定目標菌株的分類學地位。

1.3.5 菌株的耐受性分析

種子液制備[24]：將活化好的菌種轉接至種子培養基中，將其置于恒溫搖床30 ℃、180 r/min培養24 h，得種子液。

耐高溫試驗[20]：按10%（V/V）的接種量將種子液接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，分別置于溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃條件下處理2 h[28]，于37 ℃下培養24 h，采用紫外分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）；不經處理作為對照組；每個試驗3個平行和1個對照組。

1.3.1 弱勢群體信息貧困研究。弱勢群體分為社會性弱勢群體和生理性弱勢群體，由于其身體狀況、生產技能、經濟基礎、文化水平、年齡、社會地位及所處環境等原因在獲取和利用信息資源中處于弱勢或劣勢，成為信息弱勢群體[21]。這類群體主要包含城市下崗職工、城市農民工、生活不便的老年人、殘疾人和其他被邊緣化的群體構成[22]。信息弱勢群體在信息獲取渠道、信息化技能、信息意識、信息接收處理等方面處于劣勢。

耐酸性試驗：將種子液按10%（V/V）的接種量接種于初始pH分別為2、3、4、5、6、7的PDA液體培養基中，37 ℃、130 r/min條件下培養，分別于0 h、12 h、24 h、36 h測定培養液的OD600nm值；每個梯度3個平行和1個對照組。

1.3.6 數據處理

使用GraphPad Prism9.0軟件[29]進行統計分析，P＜0.05為差異具有統計學意義；使用GraphPad Prism9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲中菌株的分離純化

采用涂布平板稀釋法和平板劃線法從高溫大曲中分離得到15株形態不同的菌株，分別編號為KC-1～KC-15。

2.2 高產淀粉酶和蛋白酶菌株的篩選

2.2.1 初篩結果

通過透明圈法從15株分離菌株中篩選得到3株產淀粉酶透明圈的菌株（KC-6、KC-13和KC-14）和3株產蛋白酶透明圈的菌株（KC-6、KC-12和KC-13），其在平板上的透明圈直徑、菌落直徑及D/d值見表1。

表1 篩選菌株的淀粉酶和蛋白酶透明圈與菌落直徑Table 1 Transparent circle and colony diameter of amylase and protease of screened strains

由表1可知，在產淀粉酶活力方面，菌株KC-6的D/d值（1.42±0.19）最大，其次為菌株KC-13（1.28±0.03），但兩菌株的D/d值無顯著差異（P＞0.05）。在產蛋白酶活力方面，菌株KC-13的D/d值（3.52±0.16）最大，其次為菌株KC-12（3.03±0.22），兩菌株的D/d值也無顯著差異（P＞0.05）。其中菌株KC-6和KC-13既能產淀粉酶又能產蛋白酶，因此，對菌株KC-6、KC-13的產酶活力進行測定。

2.2.2 復篩結果

圖1 菌株KC-6和KC-13的淀粉酶活力（A）及蛋白酶活力（B）測定結果Fig.1 Determination results of amylase (A) and protease activities (B)of strains KC-6 and KC-13

由圖1可知，菌株KC-6和KC-13的淀粉酶活力無顯著差異（P＞0.05），分別為64.45 U/mL、63.52 U/mL。菌株KC-6的蛋白酶活力顯著高于菌株KC-13（P＜0.05），分別為0.60 U/mL、0.32 U/mL。綜上，菌株KC-6產淀粉酶和蛋白酶能力相對較強。趙華等[30]從酒曲中篩選到一株產蛋白酶活力為10.48 U/mL的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），經培養條件優化后蛋白酶活力能達到154.75 U/mL；胡曉龍等[31]從中高溫大曲篩選到一株產淀粉酶活力為552.78 U/mL的枯草芽孢桿菌（B.subtilis），經培養條件優化后淀粉酶活力能達到8 158.23 U/mL。雖然本研究菌株KC-6的產酶活力較低，但該菌株能同時產淀粉酶和蛋白酶。

2.3 菌株KC-6的鑒定

2.3.1 形態觀察

菌株KC-6的菌落形態及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株KC-6的菌落表面不光滑、有褶皺、顏色呈乳白色；細胞呈短桿狀，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌。

圖2 菌株KC-6的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of strain KC-6

2.3.2 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株KC-6的系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株KC-6與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）聚于同一分支，親緣關系最近。結合形態特征，鑒定菌株KC-6為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株KC-6的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain KC-6

2.4 菌株KC-6的耐受性分析

2.4.1 耐高溫能力測試

高溫大曲的制作過程中溫度能達到60 ℃以上，高溫培養出的微生物才能代謝獲得釀造醬香型白酒所需的各種酶和香味物質[17]。因此，考察菌株KC-6高溫耐受性，結果見圖4。由圖4可知，與對照組相比，30 ℃處理后能顯著促進菌株KC-6的生長，當培養溫度高于30 ℃后，OD600nm值逐漸下降，菌株的生長受到抑制，但當溫度達到60 ℃，KC-6菌株的OD600nm值仍接近1，表明該菌株能耐受60 ℃高溫。

圖4 不同溫度對菌株KC-6生長的影響Fig.4 Effects of different temperature on the growth of strain KC-6

2.4.2 耐酸性測試

酒醅固態發酵過程中，適應的酸度為微生物正常生長提供良好的環境[32]，菌株KC-6的耐酸性能見圖5。

圖5 不同pH對菌株KC-6生長的影響Fig.5 Effects of different pH on the growth of strain KC-6

由圖5可知，當pH為2和3時，培養36 h，菌株KC-6的OD600nm值增幅小，說明菌株能微弱生長；當pH＞4之后，培養36 h，菌株KC-6的OD600nm值增幅加快，尤其pH為5、6和7時OD600nm值增幅更快，且在培養36 h時OD600nm值接近，結果表明，菌株KC-6在強酸性條件生長緩慢，在弱酸和中性環境中生長旺盛。

3 結論

本研究采用稀釋涂布平板法、平板劃線法從高溫大曲中分離得到15株細菌，通過透明圈法及酶活力測定篩選得到1株高產淀粉酶及蛋白酶的菌株，編號為KC-6，其所產淀粉酶活力為64.45 U/mL，蛋白酶活力為0.6 U/mL；通過形態學觀察及分子生物學技術鑒定菌株KC-6為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）；其可耐受60 ℃的高溫，在強酸性條件生長緩慢，在弱酸和中性環境中生長旺盛。