釀酒專用小麥大曲中揮發性風味成分與微生物群落相關性分析

王 洋，謝 菲*，杜禮泉，范昌明，馮 波

（四川省綿陽市豐谷酒業有限責任公司，四川 綿陽 621000）

大曲是以小麥為主要原料，通過自然網羅環境中的微生物和控制生產工藝條件生產的微生態制品[1]，其中含有豐富的代謝酶和微生物類群，具有糖化、發酵、生香等功能[2]。在白酒行業一直有著“曲為酒之骨”、“好曲釀好酒”、“曲定酒型”等說法[3]，這充分說明了大曲在白酒釀造中扮演的重要角色，是釀酒發酵的原動力。大曲生產過程中本身產生的香氣成分，它們可以直接進入酒體中，成為酒體中香氣物質的直接來源，也可作為酒中香氣物質的重要前驅物來源[4]。

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法具有樣品用量少、無需有機溶劑、操作簡便、成本較低、靈敏度和準確度高等特點，能對微量的揮發性成分進行高效檢測，克服了傳統前處理方法的缺點，因而廣泛應用于環境、食品、醫藥等方面。崔新瑩等[5]利用固相微萃取結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法對中高溫大曲中香氣成分進行檢測，并基于主成分分析法（principal component analysis，PCA）構建中高溫大曲香氣品質評價模型等。趙東等[6]采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法測定大曲中的揮發性成分，由此揭開了大曲復雜香氣成分的神秘面紗。隨著檢測技術的發展和萃取條件優化，固相微萃取技術在大曲中的運用越來越成熟。孟維一等[7]考察了萃取頭、萃取時間、萃取溫度和樣品量對大曲樣品中揮發性成分分析的影響，采用頂空（headspace，HS）-固相微萃?。⊿PME）結合氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯用技術檢出17種為香氣化合物，定性出14種化合物，其中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、苯乙醛是香氣活性值（ordor activity value，OAV）較大且香氣強度較大的香氣活性化合物，貢獻了烤土豆香、蜂蜜香、甜香，綜合組成了大曲獨特的風味。而大曲中的一系列代謝物質與微生物群落具有密不可分的關系，故研究大曲中的微生物菌群多樣性就顯得極為重要。

隨著大曲制備工藝的不斷優化調整，制曲原料的選用已然成為影響大曲質量的關鍵環節。朱和琴等[8]研究了“宜麥”7號小麥（蛋白質和淀粉含量較高）和普通小麥分別制作偏高溫大曲，結果表明“宜麥”7號可明顯提高曲質和酒質。劉宇等[2]研究發現，使用軟質小麥制作蘭陵濃香大曲在感官質量和理化指標上均優于硬質小麥制曲。釀酒專用小麥為軟質小麥，具有硬度低、淀粉和蛋白質含量較高、籽粒飽滿、質地均勻等品質特征，使用釀酒專用小麥制曲，能明顯提高曲質等級，同時經過模擬發酵后，酒質得到顯著提升[9]。然而目前關于使用不同品種的小麥制曲對風味的影響研究極少，大曲是重要的釀酒生香劑，因此研究不同品種原料所制成品曲中的揮發性成分差異具有一定參考意義。本研究以普通小麥大曲為對照，分別采用頂空固相微萃取和高通量測序技術分析釀酒專用小麥大曲的揮發性成分和微生物群落組成，并基于多元統計分析方法探討二者相關性，從微生物角度分析其揮發性成分差異來源，旨在為制定大曲質量評價標準提供理論支撐，為白酒行業的高質量發展蓄勢賦能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒專用小麥：豐谷酒業釀酒原糧種植示范基地；普通小麥：市售；釀酒專用小麥大曲、普通小麥大曲：四川省綿陽市豐谷酒業有限責任公司；2-辛醇標準品（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Omega BioTek公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒、DNA Marker：北京全市金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

8890-5977B氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；57330-U手動SPME進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、15 mL專用采樣瓶：美國Supelco公司；SG-5405B-I數顯恒溫多頭磁力攪拌器：上海碩光電子科技有限公司；BX3200HP超聲波清洗儀：上海新苗醫療機械制造有限公司；Gene AmpR 9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀：北京六一儀器廠；JS-6800C凝膠成像儀：上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒專用小麥大曲和普通小麥大曲的制備

兩種小麥均按照常規中溫曲生產流程制曲，生產過程中保持場地環境、工藝參數與操作培養條件基本一致，并在同一曲房貯存，取同一時間出庫成品曲進行檢測分析。

1.3.2 揮發性風味成分的檢測

揮發性風味成分的檢測采用HS-SPME-GC-MS法。

前處理：取樣品2.0 g于15 mL采樣瓶中，加入10 μL 2-辛醇溶液（終質量濃度為8.2 mg/L）后密封，在60 ℃下超聲15 min，隨后在60 ℃水浴下吸附30 min，最后于250 ℃下解吸5 min。樣品均做3次平行，釀酒專用小麥大曲和普通小麥大曲的對應編號分別為SY1、SY2、SY3和CK1、CK2、CK3。

氣相色譜條件：CP-WAX57CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm），進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣為高純氦氣（He）（99.999%），流速為1 mL/min。升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。

質譜條件：電離方式電子電離為電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍20～500 m/z。

定性定量分析：將未知揮發性成分所提取的質譜圖與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）20.0標準譜庫比對鑒定，對匹配因子＞80的結果進行報道。以2-辛醇作為內標物，先計算出待測物峰面積與內標物峰面積的相對比值，再根據已知的內標物濃度換算出揮發性成分的含量。

1.3.3 微生物群落的檢測

微生物群落的檢測采用高通量測序技術。微生物檢測委托上海派森諾生物科技有限公司完成，包括微生物DNA提取、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增、純化以及測序，其中大曲總基因組DNA的提取參考謝菲等[10]的方法。細菌序列擴增引物：F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；測序區域：16S_V3～V4；數據庫：Silva_132；主要方法：dada2。真菌序列擴增引物F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'；測序區域：ITS_V1；數據庫：Unite_8；主要方法：dada2。

1.3.4 數據處理

利用SIMCA 14.0軟件進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），利用派森諾云平臺（https://www.genescloud.cn/home）完成群落多樣性分析，數據結果以“平均值±標準差”表示，用SPSS 20.0進行顯著性分析和Spearman相關性系數計算，使用OriginPro 2018C軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 大曲揮發性風味成分分析

2.1.1 兩種大曲揮發性風味成分分析

釀酒專用小麥大曲（SY）和普通小麥大曲（CK）揮發性風味成分HS-SPME-GC-MS檢測結果見表1。由表1可知，在兩組大曲中共鑒定出125種揮發性成分，其中SY組和CK組分別鑒定出108種和105種成分，共有88種成分在兩組大曲中均有檢出。兩組大曲差異性成分分別有20種和17種，SY組獨有成分（20種）含量由高到低為：2,6-二甲基壬烷、3-甲基己醛、正癸醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、2,5-二甲基四氫呋喃、五甲基乙醇、2-苯基-1-丙醇、二甲基乙酰胺、2（5H）-呋喃酮、乙酸苯乙酯、DELTA-杜松烯、乙二醇、馬兜鈴烯、5-甲基糠醛、芳樟醇、1-異氰基-3-甲苯、N-甲基-2-吡咯甲醛、2,2,6-三甲基-1,4-環己二酮、3-苯基吡啶。CK組獨有成分（17種）含量由高到低為：3-羥基-2-丁酮、3-丁烯基異硫氰酸酯、2-庚酮、異辛醇、異丁醇、2,6-二乙基吡嗪、丙酮酰胺、反式-2-辛烯-1-醇、環庚-4-烯醇、亞麻酸、1,2-己二醇、γ-壬內酯、3-甲基吡咯、1-苯基-2-丙醇、3,4-二甲氧基苯乙烯、2-吡啶甲醇、鄰苯三酚三甲醚。

表1 兩種大曲樣品中揮發性風味成分含量GC-MS分析結果Table 1 Results of volatile flavor compounds contents in two kinds of Daqu samples analysis by GC-MS

釀酒專用小麥大曲（SY）和普通小麥大曲（CK）各揮發性風味成分類別見圖1。由圖1a可知，SY組各揮發性風味成分類別含量高低順序為：醇類＞吡嗪類＞醛類＞酸類＞酮類，而CK組各揮發性風味成分類別含量高低順序為：吡嗪類＞醇類＞酸類＞酮類＞醛類，且兩組大曲在這幾類化合物總含量上存在顯著性差異（P＜0.05）。兩組大曲含量較高的均為四甲基吡嗪，SY組和CK組中含量分別為（533.53±43.83）ng/g和（869.45±104.25）ng/g，占各自樣品總含量的14.40%和21.93%。四甲基吡嗪香氣特征為烘烤香、甜香，可增強大曲的生香效果，在濃香型、醬香型、芝麻香型白酒中含量較高，是白酒中的重要香氣成分[11]。徐巖等[12]對中國白酒中四甲基吡嗪的來源進行深入研究，并證實其主要產生途徑為大曲中的枯草芽孢桿菌代謝反應，兩種大曲該物質差異顯著，可能與芽孢桿菌富集量有關。由圖1b可知，SY組中的醛類、萜烯類、脂肪烴類、呋喃類以及其他含氮物類等的化合物數量要高于CK組。綜合表1和圖1的分析結果來看，釀酒專用小麥和普通小麥所制大曲在風味物質的種類和含量上有差異。

圖1 兩種大曲樣品中揮發性風味成分的含量（a）及種類（b）比較Fig.1 Comparison of volatile flavor components types and contents in two kinds of Daqu samples

2.1.2 揮發性風味成分主成分分析

利用SIMCA 14.0統計學軟件對兩種大曲檢測出的125種揮發性風味化合物進行PCA，模型的特征值和方差貢獻率見表2。特征值為相應的主成分系數，數值大小代表主成分影響力的高低，一般選擇主成分特征值＞1且累計方差貢獻率在80%以上的主成分進行分析[13]，故提取前兩個主成分作為可視化分析。

表2 主成分的特征值及方差貢獻率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

由表2可知，第1主成分方差貢獻率為76.32%，第2主成分方差貢獻率為12.54%，累計方差貢獻率為88.86%，說明前兩個主成分可以解釋樣本揮發性成分的絕大部分信息。

兩種大曲PCA得分圖見圖2。由圖2可知，兩組樣品分別處于橢圓區域的兩側，各組的平行樣品較為鄰近，代表平行樣品間含量相差較小。橫坐標間的距離反應兩個樣品間的差異大小，可以看出SY組和CK組在揮發性成分種類或含量上有顯著差異。因此，通過主成分分析，能夠有效區分釀酒專用小麥和普通小麥所制大曲的樣品。

圖2 兩種大曲樣品中的揮發性風味成分主成分分析得分圖Fig.2 Score plot of principal component analysis of volatile flavor components in two kinds of Daqu samples

2.1.3 揮發性風味成分偏最小二乘法-判別分析

為了深入挖掘兩種大曲之間揮發性風味成分的差異，在PCA模型基礎上，采用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）對兩種大曲揮發性風味成分進行分析，結果見圖3。由圖3可知，兩組大曲所采集數據呈現良好的區分效果（X軸方向上對變量的解釋能力（R2X）=0.881＞0.5，Y軸方向上對變量的解釋能力（R2Y）=1.000和模型的預測能力（Q2）=0.998＞0.5），所建模型提取的兩個主成分累計方差貢獻率為88.1%，可以有效解釋樣本整體信息，其結果與PCA結果相近，都對兩種大曲樣品進行有效的鑒別和區分。此外，為了更大程度區分兩種大曲之間的差異，PLS-DA在模型擬合過程中指定了樣本的分組，往往會出現過擬合的情況。為檢驗模型可靠性，利用200次的置換檢驗，以評估所建模型是否存在過度擬合，結果見圖4。

圖3 兩種大曲樣品中揮發性風味成分偏最小二乘法-判別分析Fig.3 Partial least squares-discriminant analysis of volatile flavor components in two kinds of Daqu samples

圖4 偏最小二乘法-判別分析模型200次交叉檢驗驗證結果Fig.4 Cross-validation results of partial least squares-discriminant analysis with 200 permutation tests

由圖4可知，所有左邊的Q2和R2模擬值均比對應最右邊的原始值低，且Q2回歸線截距為-0.027 1＜0，說明該模型未有過擬合現象，模型穩定可靠，具有統計學意義。

VIP值是PLS-DA模型變量的權重值，用以衡量各組分積累差異對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，其值越大，貢獻率越大，一般以VIP值＞1作為差異性成分篩選界限。兩種大曲揮發性風味成分韋恩圖見圖5。由圖5可知，總共選出86種差異風味成分（VIP值＞1），其中49種為共有差異性風味成分，37種為兩種大曲各自的特有差異性風味成分。為了更直觀展示兩種大曲揮發性成分含量差異，對上述49種差異性風味成分進行聚類分析，結果見圖6。由圖6可知，圖A區域是CK組中相對于SY組含量較突出的揮發性成分，共計20種。B區域則是SY組大曲中相對含量較高的差異性風味成分，包含29種。結果表明，CK組差異性風味成分主要是吡嗪類，而SY組差異性風味成分主要為醇醛類?？傮w上講，SY組的揮發性風味成分較CK組豐富。馮雨[14]研究表明，硬質小麥中的晶狀淀粉不易被微生物所利用，且原料攜帶的微生物數量遠不及軟質小麥，最終導致成品大曲中的微生物代謝產物存在顯著差異。由此可見，制曲原料的品種對大曲質量有著重要影響。

圖5 兩種大曲樣品揮發性風味成分韋恩圖Fig.5 Venn diagram of volatile flavor components of two kinds of Daqu samples

圖6 兩種大曲差異風味成分聚類分析熱圖Fig.6 Heat map of clustering analysis of difference flavor components of two kinds of Daqu samples

2.2 大曲微生物群落多樣性分析

2.2.1 測序有效性分析

稀釋性曲線能夠直觀反映操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數隨測序深度變化情況[15]，OTU是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為便于分析，通過歸類操作，將序列相似性在97%以上的水平歸為同一OTU[16]。由圖7可知，兩種大曲的細菌和真菌菌群稀釋性曲線變化趨勢相近。隨著測序深度的增加，所得到的OTU數先急劇上升而后趨于平緩，往后隨著測序深度增加，新發現OTU數波動范圍小，對各自微生物群落多樣性分析影響不大，因此本實驗所測深度足以滿足后續分析。從圖7亦可知，細菌文庫內SY組OTU數目要高于CK組，而真菌文庫結果與之相反。

圖7 兩種大曲樣品細菌（a）和真菌（b）群落稀釋性曲線Fig.7 Rarefaction curves of bacterial (a) and fungal (b) communities of two kinds of Daqu samples

2.2.2 Alpha多樣性分析

多樣性指數可反映樣品中微生物群落的豐富度和多樣性。其中Chao1指數常用以估計物種總數，Chao1指數越大，表明微生物群落的豐富度越高，Shannon指數、Simpson指數用以反映樣品微生物群落多樣性[17]，微生物群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數和Simpson指數越大[18]。兩種大曲的細菌和真菌多樣性指數結果見表3。由表3可知，SY組真菌的豐富度不及CK組，但其細菌群落多樣性顯著高于CK組。所測樣品覆蓋率指數均＞0.99，表明測序結果可信度高，能有效反映樣品中的微生物情況。

表3 兩種大曲樣品微生物Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity indexes of microorganis in two kinds of Daqu samples

2.2.3 Beta多樣性分析

主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）是一種非約束排序方法，可用以衡量樣本之間的相似性和差異性[15]?；贠TU水平Bray Curtis距離的主坐標對各樣品微生物群落結構相似度進行了評價，結果見圖8。由圖8可知，細菌和真菌群落結構兩主坐標差異解釋度累計方差貢獻率分別為78.5%和84.9%（＞50%），能可靠反映樣品中絕大部分信息。兩組大曲在PCoA1軸上相隔距離較遠，說明微生物群落結構主要受主坐標PCoA1影響，SY組和CK組菌群組成具有顯著差異。

圖8 兩種大曲樣品細菌（a）和真菌（b）群落基于Bray Curtis距離的主坐標分析Fig.8 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterial (a) and fungal (b) communities of two kinds of Daqu samples based on Bray Curtis distance

2.3 基于屬水平微生物菌群組成分析

取相對豐度較高的前20個種屬進行分析，其余種屬相對豐度合并歸為Others。兩種大曲細菌群落構成見圖9。

圖9 基于屬水平兩種大曲樣品細菌（a）和真菌（b）群落結構Fig.9 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) of two kinds of Daqu samples based on genus level

由圖9a可知，兩種大曲中的優勢菌屬（平均相對豐度＞1%）有魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、泛菌屬（Pantoea）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋桿菌屬（Acetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）等。這與研究報道的川派濃香型大曲主要菌屬結果相一致[19]。兩種大曲細菌群落比較來看，其各自種屬組成存在明顯差異（P＜0.05）。SY組的絕對優勢菌屬（占比10%以上）包含乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，相對豐度分別為28.46%、24.83%；CK組的絕對優勢菌屬有魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬和片球菌屬，相對豐度分別為33.87%、17.62%、12.23%和10.06%。乳桿菌屬在兩組大曲中占比差異最為顯著（P＜0.05），乳桿菌屬在SY組樣品中為第一優勢菌屬，而CK組中的乳桿菌屬僅有6.88%。乳桿菌屬存在于制曲生產的各個環節中[20]，其差異來源可能是由于原料產地氣候不同使得所攜帶的微生物種類數量不同，亦或是開放式的生產環境導致所網羅的微生物不同。高溫放線菌屬在CK組中占比較高，比SY組高出12.08%，為CK組的第二優勢菌屬，是一類能在惡劣環境下生長代謝的微生物，該菌屬具有耐高溫的特點，可在50 ℃以上環境生長繁殖[21]，其常見于高溫大曲中，近年來研究發現其在中高溫大曲也占據不低的比例[22]。高溫放線菌在CK組中有較高的豐度，可能是由于CK組制曲原料硬度高，脆性大，粉碎后的顆粒過多，使得壓制的曲塊較緊實[14]，透氣性較差，導致大曲升溫發酵后期的曲心溫度較高，因此CK組中的耐熱菌分布高于SY組。芽孢桿菌屬能夠在極端環境下生長代謝，當制曲溫度＞55 ℃時，曲中細菌會以芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬為主要的微生物群[17]。該菌屬能分泌多種水解酶，有助于提升大曲原料的利用率，同時還是大曲中吡嗪類化合物產生的主要菌屬[23]。SY組中的芽孢桿菌屬組成豐度較CK組低，因此兩種大曲中吡嗪類化合物的含量有著顯著差異（P＜0.05），其與揮發性成分檢測結果相符。泛菌屬在SY組相對豐度較高，達9.27%，但在CK組中相對豐度僅為0.45%。研究發現，該菌屬是制曲小麥內生菌中的主要種群[24]，是一類重要的環境微生物，因此小麥原料生長環境的不同直接導致在成品曲中組成差異顯著（P＜0.05）?？傮w上來看，SY組的優勢菌屬與CK組比較，其菌群結構更豐富，組成更均衡。

由圖9b可知，真菌群落的物種豐富度遠不及細菌群落，這是因為大部分真菌的適宜生存溫度在20～30 ℃，而培曲頂溫高達50 ℃以上，因此在成品曲中真菌主要以耐熱或嗜熱真菌屬為主。兩種大曲中的優勢菌屬（平均相對豐度＞1%）主要包括嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根霉菌屬（Rhizopus）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）。這與楊陽等[25]研究產自河南的軟質小麥制成的中溫大曲中真菌優勢菌群組成有一定相似。嗜熱子囊菌屬是兩種大曲的第一優勢真菌屬，其在SY組和CK組中相對豐度分別為66.73%和62.51%（P＞0.05）。嗜熱子囊菌屬是大曲中常見的耐熱真菌，主要集中在具有較高溫度的曲心中。值得注意的是，嗜熱真菌屬與嗜熱子囊菌屬同為嗜熱真菌類，具有相似的生物特性，但嗜熱真菌屬在SY組和CK組中所占比例較低，相對豐度分別為0.06%和1.68%，具體原因有待進一步探究。兩種大曲檢測出的優勢霉菌類主要為根霉菌屬和曲霉菌屬，根霉菌屬和曲霉菌屬在SY組（5.36%、12.11%）和CK組（17.36%、7.68%）相對豐度較高，有助于增加大曲原料的利用率，提高生產效益。本研究檢測出的優勢酵母屬包括畢赤酵母屬和生絲畢赤酵母屬，其中以畢赤酵母屬為主，在SY組和CK組相對豐度分別為13.93%和8.22%（P＜0.05），其在SY組中為第二優勢菌屬。據了解，畢赤酵母屬是眾多香型曲藥中的優勢菌群之一，與大曲中的一些酯類和苯乙醇的產生有著直接關系[26-27]。生絲畢赤酵母屬在CK組（相對豐度1.01%）為優勢菌屬，在SY組中相對豐度為0.33%（P＜0.05），據唐慧芳等[28]研究發現，其與老場地大曲淀粉水解能力呈正相關，與新場地大曲呈弱負相關。其余菌屬占比較少，有根毛霉屬（Rhizomucor）（SY：0.87%，CK：0.56%）、擬青霉屬（Paecilomyces）（SY：0.23%，CK：0.06%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（SY：0.13%，CK：0.03%）、卡扎斯坦酵母屬（Kazachstania）（SY：0.01%，CK：0.05%）、其他菌屬（Others）（SY：0.24%，CK：0.83%）。盡管這些菌屬在大曲中分布較少，但對白酒品質有著潛在的風味貢獻作用。

2.4 揮發性風味成分與微生物之間的相關性分析

為研究微生物與揮發性風味成分之間潛在的相關作用，將兩種大曲篩選出的差異性成分合并歸屬至各類揮發性風味化合物，研究各種類揮發性風味化合物和大曲中優勢微生物菌屬之間的相關關系，結果見圖10。

圖10 兩種大曲樣品優勢微生物菌群與揮發性風味成分相關性分析Fig.10 Correlation analysis between dominant microbial flora and volatile flavor substances of two kinds of Daqu samples

由圖10可知，芽孢桿菌屬與吡嗪類呈高度顯著正相關（P＜0.001），與酚類、酮類和醚類呈極顯著正相關（P＜0.01），與酯類呈顯著正相關（P＜0.05），這與眾多學者研究報道結果相符合[29-30]。乳桿菌屬和曲霉菌屬與酸類和醇類物質呈顯著正相關（P＜0.05）。魏斯氏菌屬和鏈霉菌屬均對酯類和醚類物質的積累有著積極的影響，特別是對酯類的影響極為顯著（P＜0.01）。此外，糖多孢菌屬與酯類物質也呈顯著正相關（P＜0.05）。高溫放線菌屬和片球菌屬與揮發性風味成分相關性一致，均與醇類、內酯類、酸類和脂肪烴類呈明顯負相關，特別是對脂肪烴的影響是高度顯著的（P＜0.001）。泛菌屬、明串珠菌屬和葡萄球菌屬和醛類物質呈顯著正相關（P＜0.05），而根霉菌屬與醛類物質呈極顯著負相關（P＜0.01）。根霉菌屬和嗜熱真菌屬與酮類、酚類物質有著較強的正相關性（P＜0.05），有助于提高大曲的香氣成分含量。本研究中的萜烯類、呋喃類以及含硫類等化合物代謝均與曲霉菌屬、泛菌屬分別呈極顯著（P＜0.01）和顯著正相關（P＜0.05），而醋桿菌屬僅與其他含氮類呈顯著負相關（P＜0.05），生絲畢赤酵母屬僅與脂肪烴類呈顯著負相關（P＜0.05）。

3 結論

以釀酒專用小麥和普通小麥為原料制成中溫大曲，兩種大曲共檢測出125種揮發性成分，其中釀酒專用小麥中的獨有成分占20種，普通小麥大曲中獨有成分占17種，并從88種共有成分中篩選出49種差異性風味成分，且有29種差異性風味成分含量在釀酒專用小麥大曲中明顯高于普通小麥大曲。因此，相比于普通小麥，釀酒專用小麥所制大曲在揮發性風味成分上有著更加突出的表現，可一定程度上增強白酒生產中的大曲生香作用。在微生物方面，釀酒專用小麥大曲在細菌群落測序過程中，發現物種數始終高于普通小麥大曲。兩種大曲在微生物物種組成上相似，主要差異為各自物種豐度占比，其中釀酒專用小麥大曲中優勢細菌屬、真菌屬分別占11種和4種，普通小麥大曲優勢細菌屬、真菌屬分別占9種和6種。為探究微生物對差異性揮發性成分的影響，將兩種大曲差異性揮發性成分聚類后和微生物優勢菌屬作相關性分析。結果表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）是造成兩種大曲吡嗪類物質含量差異的主要來源，同時與魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈霉菌屬（Streptomyces）以及糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在酯類物質的代謝上有著促進作用。乳桿菌屬（Lactobacillus）和曲霉菌屬（Aspergillus）則與醇類、酸類物質呈顯著正相關。泛菌屬（Pantoea）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為兩種大曲的醛類物質的主要貢獻微生物。酮酚類等香氣成分的積累則主要與芽孢桿菌屬（Bacillus）、根霉菌屬（Rhizopus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）有關。