微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸品質的影響

牟 燕，賴茂佳，易宇文，范文教*

（1.四川旅游學院 食品學院，四川 成都 610100；2.四川旅游學院 烹飪科學四川省高校重點實驗室，四川 成都 610100）

牦牛系川西及藏區主要特產之一，以天然優質牧草、無公害野草為主要食物，被譽為“高原之舟”[1]；牦牛肉以其“高蛋白、低脂肪、無污染”被廣泛認為是綠色、健康、優質的蛋白來源[2]。其加工制品川味牦牛肉香腸是四川乃至西南地區的特色傳統肉制品，常使用辣椒、花椒、胡椒等作為輔料，味重麻辣[3]，廣受消費者青睞。牦牛肉自然發酵香腸主要是通過環境和原料肉中本身具有的微生物作用，這些微生物可能含有致病菌以及導致氨基酸脫羧形成生物胺，存在食用安全潛在風險，限制了川味牦牛肉香腸的產業化發展。近年來隨著消費者對發酵產品品質安全的高度重視，許多性能優良、可以提高發酵產品質量、感官品質以及產品安全性的微生物發酵劑已成為發酵香腸研究的熱點[4]。

微生物的種類和作用是發酵香腸品質特征形成的重要因素之一，在肉制品發酵過程中，微生物參與發揮水解蛋白質和分解脂質的作用，不僅可以改善產品的品質、提高營養價值，還可以提高產品的安全性[5]。功能性發酵劑是指能在香腸中發揮理想代謝活性的微生物制劑，其研究主要集中在乳酸菌、凝固酶陰性的葡萄球菌、酵母菌及霉菌等方面[6-7]。研究表明，人工接種乳酸菌發酵劑能夠加速牦牛肉香腸的產酸速率，抑制一些不耐酸有害微生物的生長，改善香腸理化特性，同時促進揮發性風味物質的生成，更好提升香腸的口感，延長產品的保質期[8]。李木子等[9]研究表明，彎曲乳桿菌在液體培養基中具有降低亞硝胺的能力；翟鈺佳[10]研究篩選出了不產生物胺且具有較強胺氧化酶活性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。目前，發酵牦牛肉香腸仍存在亞硝酸鹽含量超標、品質不穩定問題，因此，探討有助于川味牦牛肉香腸保持風味獨特、營養健康的微生物發酵劑是一項很有經濟意義的工作。

本研究以具有四川傳統特色的川味牦牛肉香腸為研究對象，分別接種彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）（LC）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）（LP）以及其復配菌（1∶1）（FP）制作川味牦牛肉香腸，以自然發酵（CK）為對照組，在3 ℃下貯藏7 d后，測定其理化及微生物指標、顏色參數、質構、揮發性香氣及感官品質，以期探究微生物發酵劑對川味牦牛肉發酵香腸品質指標的影響，為其發酵工藝的優化和產品品質的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛后腿肉、豬肥膘、食鹽、辣椒粉、料酒、花椒粉等：市售；彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）Y15、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CM25：烹飪科學四川省高校重點實驗室；菌落總數測試片：廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司；丙二醛檢測試劑盒：江蘇艾迪生生物科技有限公司；硼砂、鹽酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FOX 4000電子鼻：法國Alpha MOS公司；TMS-PRO型食品物性分析儀：美國FTC公司；UV BlueStar A紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；DC-P3新型全自動測色色差計：北京興光測色儀器有限公司；S470 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 川味牦牛肉發酵香腸的制作工藝流程及操作要點

操作要點：

預處理：將牦牛肉清洗除去筋膜、筋腱，切成大小一致的肉塊（1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm），瀝干表面的水分。

腌制：將牦牛肉與豬肥膘按照質量比8∶2混合，添加2%食鹽、3%辣椒粉、1%花椒粉、0.1%五香粉、0.1%姜粉、1%蔗糖、0.1%味精、2%料酒（均以肉質量計），充分混勻后放置于（3±1）℃的冰箱腌制24 h。

活化、接種：準確稱取10.0 g脫脂奶粉和1.50 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中，加入2.0 g菌粉攪拌，在（25±1）℃活化2 h；對腌制完成的原料進行接種，接種量為107CFU/g。實驗分為4組，未添加菌自然發酵對照組（CK）、添加彎曲乳桿菌組（LC）、添加植物乳桿菌組（LP）、添加彎曲乳桿菌組與植物乳桿菌組復配菌組（質量比1∶1）（FP）。

灌腸：將肉餡灌于豬小腸衣內，使每節腸長度在10 cm左右，用線繩結扎并用排氣針有規律的扎眼，排除腸體內部的空氣。

發酵、干燥成熟：發酵溫度為（25±1）℃，相對濕度為80%，發酵5 d，然后將香腸移至陰涼通風的環境下（15～20 ℃）繼續風干發酵5 d。

成品：真空包裝后的成品置于3 ℃下保藏7 d后即得川味牦牛肉發酵香腸成品。

1.3.2 分析檢測

pH值的測定：參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》；亞硝酸鹽含量的測定：參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法；丙二醛的測定：參照試劑盒說明操作，結果表示為每毫克肉樣所含丙二醛含量（nmol/mg）；菌落總數的測定：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。

1.3.3 顏色參數的測定

將香腸切成2 cm厚的切片，通過白板進行儀器校準，使用校正后的色差儀測定其L*值、a*值和b*值。

1.3.4 質構的測定

參考趙改名等[11]的方法略作修改。將川味牦牛肉發酵香腸去除腸衣后切成3 cm厚的柱狀，使用P50探頭對香腸質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）。測定指標為硬度、內聚性、彈性、膠粘性、咀嚼性。設定測定參數為：初始力5 N，壓縮比50%，測試速度：60 mm/min，深度20 mm，最小感應力0.38 N，停頓5 s。

1.3.5 揮發性香氣的測定

參照楊長平等[12]的方法稍作修改，將川味牦牛肉香腸去除腸衣并充分剁碎，準確稱量1.0 g均勻的肉糜于15 mL頂空瓶中，用硅膠隔墊密封，于室溫靜置30 min后采用頂空吸氣法進行分析。參數為：間隔時間1 s，傳感器自動清洗時間80 s，歸零時間10 s，進樣準備時間5 s，采樣測定時間100 s，進樣流量300 mL/min。為確保試驗數據可靠性，選取較為平穩的3組數據進行分析。電子鼻傳感器性能特點見表1。

表1 電子鼻傳感器性能特點Table 1 Performance characteristics of electronic nose sensors

1.3.6 感官評價

參考李一鳴等[13]的方法稍作修改，邀請10名（男女各5名）經感官評分學習的專業人員組成評定小組。分別從外觀、滋味、質地、氣味4個方面進行評價，滿分80分，具體評定標準見表2。

表2 川味牦牛肉發酵香腸感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented sausages of Sichuan yak sausage

1.3.7 數據處理

對以上實驗測得的數據使用Excel 2019統計處理，每個樣品重復測定3次，結果表示為“平均值±標準差”；應用IBM SPSS Statistics 26進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著；應用Origin 2021繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 發酵劑對川味牦牛肉香腸pH值的影響

在川味牦牛肉香腸發酵過程中，pH值的高低會影響發酵肉的顏色、嫩度、感官以及風味。乳酸菌作為發酵劑在適宜溫度和濕度條件通過代謝作用會分解碳水化合物產生乳酸、乙酸等有機酸類物質[14]，使pH值降低。由圖1可知，四組香腸的pH值均在適宜范圍內（5.117～5.345），pH值過高或過低均會對香腸的風味產生不良影響[15]。CK組pH值顯著高于接種發酵劑的處理組（P＜0.05）；LC、LP組pH值接近，而復配菌組（FP組）pH值最低，為5.117。兩種菌在發酵階段適宜溫、濕度條件下具有快速產酸的能力，使pH值保持在較低范圍內，有效防止因雜菌過度增殖造成的產品腐敗變質現象，延長發酵產品的貨架期[17]，這與馮美琴等[16]的研究結果一致。

圖1 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸pH值的影響Fig.1 Effect of microbial starter culture on pH value of Sichuan yak sausage

2.2 發酵劑對川味牦牛肉香腸亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽是發酵香腸中常用的發色劑，在肉制品加工中占據“統治”地位，但其易生成具有致癌性的亞硝基化合物危害人體健康[18]。

由圖2可知，4組川味牦牛肉香腸的亞硝酸鹽含量均不超過食品中亞硝酸鹽殘留量的安全標準限值（30 mg/kg）。CK組亞硝酸鹽殘留量為5.55 mg/kg，顯著高于其他3組（P＜0.05），LC組、LP組、FP組的亞硝酸鹽殘留量分別為3.86mg/kg、3.80 mg/kg、2.50 mg/kg，這可能是因為CK組沒有接種發酵劑，乳酸菌數量相對較少，對形成亞硝酸鹽的抑制能力較弱。而FP組接種了彎曲乳桿菌和植物乳桿菌，產酸較多，pH值較低，pH值同亞硝酸鹽的降低值具有相關性，pH值越小，發酵后亞硝酸鹽降低值越大[19]，因此FP組亞硝酸鹽殘留量處于最低水平，該結果與王德寶等[20]報道的接種清酒乳桿菌、木糖葡萄球菌及肉葡萄球菌復合發酵劑香腸的結果相似。上述結果表明，微生物發酵劑有助于抑制亞硝酸鹽的形成[21]，提高川味牦牛肉發酵香腸食用的安全性，且彎曲乳桿菌和植物乳桿菌兩種菌復配使用效果更理想。

圖2 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of microbial starter culture on nitrite content of Sichuan yak sausage

2.3 發酵劑對川味牦牛肉香腸丙二醛含量的影響

丙二醛是脂肪的氧化終產物之一，它與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）在一定條件下發生反應產生紅色物質，因此TBA值是評價肉制品脂肪氧化程度最常用的指標之一，丙二醛含量越高，脂肪氧化程度越深[22]。由圖3可知，CK組脂肪氧化程度始終顯著高于其他3組（P＜0.05），丙二醛含量高達1.22 nmol/mg，是復配菌組含量（0.52 nmol/mg）的2.35倍，LC組、LP組丙二醛含量分別為0.79 nmol/mg、0.74 nmol/mg。通力嘎[23]利用植物乳桿菌與木糖葡萄球菌混合制作發酵香腸，混合菌種組TBA值顯著下降，與本實驗結果相同?？赡苁怯捎谌樗峋谌忸惏l酵過程中能夠產生超氧化物歧化酶、過氧化氫酶分解過氧化物，從而抑制脂肪氧化酸敗[24]，有利于防止發酵肉制品脂肪因過度氧化產生酸敗味和哈喇味等不愉快氣味。該結果說明彎曲乳桿菌和植物乳桿菌的添加降低了丙二醛的生成，減緩了香腸的脂肪氧化程度，且兩種發酵劑混合使用效果更佳。

圖3 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of microbial starter culture on malondialdehyde content of Sichuan yak sausage

2.4 發酵劑對川味牦牛肉香腸顏色參數的影響

發酵香腸的顏色與其品質密切相關[25]。L*值代表香腸肉樣的亮度，該值越高說明產品光澤度越好；a*值代表紅度值，b*值代表黃度值，a*值越大說明產品色澤越好，新鮮度越高，而b*值相反[26]。4組川味牦牛肉香腸的顏色參數見表3。由表3可知，FP組L*值、a*值均最大，分別為58.52和19.93，LP組次之，這與HWANG K E等[27]的研究結果類似。各處理組的顏色參數與空白對照組差異顯著（P＜0.05），LC組和LP組的b*值差異不顯著（P＞0.05），但均顯著低于CK組（P＜0.05）。說明在川味牦牛肉香腸中添加微生物發酵劑能夠對香腸的顏色產生積極影響，延緩色澤的衰退提高穩定性，其中兩種發酵劑的復配使用對香腸的色澤提升作用最明顯。

表3 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸顏色參數的影響Table 3 Effect of microbial starter culture on color parameter of Sichuan yak sausage

2.5 發酵劑對川味牦牛肉香腸質構特性的影響

品質上乘的牦牛肉香腸應具有硬度適宜，組織結構緊致，切片富有彈性等優良品質[28]。發酵劑對川味牦牛肉香腸質構特性的影響見表4。由表4可知，各組牦牛肉香腸質構特性差異顯著（P＜0.05），FP組的硬度值、內聚性、彈性、膠粘性、咀嚼性均高于其他組。有文獻報道，乳酸菌的蛋白分解作用會導致巰基基團減少，使產品的硬度增加，腸體更加緊密[29]。內聚性是香腸切片性的重要特征，添加發酵劑對牦牛肉香腸的內聚性提高效果顯著。LC組、LP組的內聚性、彈性、膠粘性無顯著差異（P＞0.05），而香腸的咀嚼性與硬度差異顯著（P＜0.05），CK組咀嚼性僅為101.087 mJ，而FP組高達299.287 mJ，香腸更有嚼勁?？梢姲l酵劑對改善牦牛肉香腸的質構具有重要作用，且FP組效果最好。

表4 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸質構特性的影響Table 4 Effect of microbial starter culture on texture characteristics of Sichuan yak sausage

2.6 發酵劑對川味牦牛肉香腸揮發性香氣的影響

川味牦牛肉香腸電子鼻雷分析達圖及主成分分析見圖4。由圖4a可知，18根傳感器對樣品揮發性成分的響應不同。在LY2/LG～LY2/gCT傳感器上，4種川味牦牛肉香腸的風味輪廓相似；其差異主要體現在T30/1～TA/2這12根傳感器上，CK組的響應值明顯低于其他3種發酵香腸，4種香腸對相應于氨、醇的P30/1傳感器響應值最大，其次是對應乙醛、胺類化合物的PA/2傳感器。因此，醇、胺類含量的差異可能是影響4組發酵香腸揮發性香氣差異的主要物質，添加微生物發酵劑能使川味牦牛肉香腸產生更多的乙醇。

圖4 川味牦牛肉香腸電子鼻分析雷達圖（a）及主成分分析（b）Fig.4 Sichuan yak sausage electronic nose analysis radar map (a)and principal component analysis (b)

由圖4b可知，第一主成分（principal components1，PC1）方差貢獻率為97.0%，第二主成分（PC2）方差貢獻率為2.5%，累計方差貢獻率99.5%，說明電子鼻對香腸香氣化合物的信息提取較為完整。從4種香腸分布距離來看，CK組單獨集中分布在第三象限，與其他3組香腸組間距離較大，說明自然發酵的香腸與加入發酵劑的香腸香氣差異顯著，且在PC1、PC2方向上差異均明顯。LC組和FP組均分布在第二象限，說明添加彎曲乳桿菌和復配菌組香腸的揮發性香氣成分比較接近。因此，添加微生物發酵劑會使川味牦牛肉香腸的香氣成分差異變大。

2.7 發酵劑對川味牦牛肉香腸菌落總數的影響

發酵劑對川味牦牛肉香腸菌落總數的影響見圖5。由圖5可知，各組川味牦牛肉香腸菌落總數從低到高排序為CK組＜LC組＜LP組＜FP組，LC組、LP組菌落總數分別為8.00 lg（CFU/g）、9.00 lg（CFU/g），差異不顯著（P＞0.05）。FP組菌落總數為10.17 lg CFU/g，顯著高于CK組（6.50 lg（CFU/g））（P＜0.05）。在川味牦牛肉香腸的發酵過程中，原料肉自身攜帶有優勢微生物，而發酵劑的添加使產品在發酵過程優勢菌快速生長繁殖，數量增加。復配菌組接種了彎曲和植物兩種乳桿菌，效果更明顯，可能與接種微生物的種類有關，段艷等[30]的研究表明，乳酸菌是發酵香腸中的優勢菌且植物乳桿菌的添加使其優勢更加明顯。乳酸菌在發酵過程中產酸使pH降低，可以抑制腐敗菌和病原菌的生長來防止異味和酸敗的形成，改善川味牦牛肉香腸制品的風味。

圖5 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸菌落總數的影響Fig.5 Effect of microbial starter culture on the total number of colonies of Sichuan yak sausage

2.8 發酵劑對川味牦牛肉香腸感官品質的影響

川味牦牛肉香腸各實驗組的感官評分結果見圖6。由圖6可知，添加了發酵劑的處理組各項指標均優于CK組，其中，FP組川味牦牛肉香腸感官評分最高，為72.7分。LC組、LP組、FP組川味牦牛肉香腸在外觀、質地以及氣味方面評分較高，但差異不顯著（P＞0.05）；從滋味來看，FP組評分與其他組有顯著差異（P＜0.05），評分高達18.4分。表明微生物發酵劑的添加促進了蛋白質、脂肪分解生成風味物質，提高川味牦牛肉香腸的滋氣味[31]，同時改善產品的色澤，使產品更加符合消費者的口感要求，提高其接受度。因此復配菌組發酵制得的川味牦牛肉香腸品質更優且更適合生產與推廣。

圖6 微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸感官品質的影響Fig.6 Effect of microbial starter culture on sensory quality of Sichuan yak sausage

3 結論

該實驗研究微生物發酵劑對川味牦牛肉香腸品質指標的影響。添加微生物發酵劑能降低產品pH值，抑制亞硝酸鹽的生成，減緩香腸脂肪氧化酸敗的程度，提高抑菌能力；其中復配菌組的各項指標均在不同程度上優于自然發酵組，色澤亮紅，彈性好；同時感官評分結果表明，接種發酵劑具有一定改善香腸滋氣味和外觀的效果，可以更好彌補香腸中為提高安全性而帶來口感上的缺失。因此，添加發酵劑能改善川味牦牛肉香腸的品質和食用安全性，其中采用彎曲乳桿菌和植物乳桿菌復配（1∶1）所生產出來的川味牦牛肉香腸的品質最優，可以為后續進一步研究兩種復配菌發酵劑提供理論基礎。