黨參莖葉液體發酵條件優化及成分變化分析

張月榮，姜 霞，趙俊禧，杜晨暉，王 璞，李 偉，詹海仙*

（山西中醫藥大學 中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619）

黨參來源于桔?？浦参稂h參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）、素花黨參（Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen.）或川黨參（Codonopsistangshen Oliv.）的干燥根，具有健脾益肺、養血生津等功效[1]?，F代研究證明，黨參具有增強免疫系統功能、抗炎、調節內分泌系統等藥理作用[2]。通常生產上黨參的藥用部位為根部，而莖葉部分則常作為生產副產品丟棄。近年來的研究發現，黨參莖葉所含的皂苷、黃酮、多糖、營養成分等與根部接近[3-6]，具有較強的抗氧化、增強免疫力等作用，因此對黨參莖葉進行開發研究，對于黨參資源的綜合利用具有重要意義。

隨著微生物發酵技術的廣泛應用，中藥發酵已成為一種提高傳統中藥活性成分含量、降低毒性的有效方法[7]。中藥材在一定條件下借助微生物及其產生的酶等作用，一方面增加有效成分的溶出，另一方面促使大分子物質分解，使有效成分透過細胞膜，更好的被機體吸收利用，提高藥效。張命龍等[8]研究發現，牛蒡根在靈芝發酵前后化學成分差異較大，并新產生三萜酸和腺苷，具有明顯的生物轉化作用；在靈芝菌液體發酵人參莖葉研究中，可明顯改變其化學成分，得到抗腫瘤活性更佳的藥效物質，可作為新藥研發得原料藥[9]。

為了充分利用黨參莖葉，本研究以黨參莖葉多糖含量為響應值，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面法，對靈芝菌液體發酵黨參莖葉條件進行研究，并對其發酵前后成分進行比較分析，以期為黨參莖葉的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

靈芝菌（BNCC336079）：北納創聯生物科技有限公司；黨參莖葉：采自山西省陵川縣黨參道地產區；馬鈴薯：市售。

1.1.2 化學試劑

D-（+）-葡萄糖（分析純）：斯坦福分析化學公司；蘆?。ǚ治黾儯撼啥计辗频律锛夹g有限公司；人參皂苷Re（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司G861279；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（comprehensive potato dextrose agar，CPDA）培養基：馬鈴薯煮液100 mL、葡萄糖2 g/100 mL、MgSO40.15g/100mL、KH2PO40.3g/100mL、瓊脂粉2g/100mL、維生素B1（vitamin B1，VB1）0.01 g/100 mL。

營養型培養基：蒸餾水100 mL、葡萄糖2 g/100 mL、酵母粉0.2 g/100 mL、MgSO40.1 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、蛋白胨0.5 g/100 mL。

以上培養基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD凈化工作臺：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BSD-WF2200光照全溫振蕩器：常州金壇精達儀器制造有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；Ultra-3660系列紫外-可見分光光度計：普源精電科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

在超凈工作臺上將保藏的靈芝菌斜面劃線接種于CPDA培養基，28 ℃恒溫培養，觀察平板直至長滿菌絲。用無菌接種鋤和接種鏟從CPDA培養基上取0.5×0.5 cm2小正方形塊，接種至100 mL營養型培養基中，28 ℃、170 r/min培養5 d，得種子液用于接種發酵。

1.3.2 黨參莖葉液體發酵

將黨參莖葉晾干后剪碎成長約1 cm的小段（莖∶葉=1∶1），粉碎過40目。精確稱量5 g的黨參莖葉藥材粉末，置于250 mL錐形瓶，加入100 mL營養型培養基，用10%鹽酸溶液或4%氫氧化鈉溶液將黨參莖葉液體培養基調至pH值為5.0，封口膜及牛皮紙包扎，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后接種菌齡為5 d的種子液5%，置于28 ℃、170 r/min搖床培養7 d，凍干即得黨參莖葉發酵物。接種時應注意全程保持無菌狀態。

1.3.3 黨參莖葉液體發酵條件優化

（1）單因素試驗設計

以發酵產物多糖含量為考察指標，分別考察發酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）、料液比（2.5∶100、5.0∶100、7.5∶100、10.0∶100、12.5∶100（g∶mL））、種子液菌齡（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）、接種量（3%、5%、7%、9%、11%）、培養基初始pH值（5、6、7、8、9、10）對黨參莖葉液體發酵的影響。

（2）響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇發酵時間（A）、料液比（B）、培養基初始pH值（C）3個因素為自變量，根據Box-Behnken設計進行3因素3水平的響應面分析試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 黨參莖葉液體發酵條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for optimization of liquid fermentation conditions of stems and leaves of Codonopsis

1.3.4 測定方法

總皂苷：參考文獻[10-11]測定；總黃酮：參考文獻[12]測定；總多糖：參考文獻[13]測定。

1.3.5 數據處理

采用Origin 2022進行數據處理和分析；響應面優化、顯著性差異分析采用Design-Expert 13統計軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對黨參莖葉多糖含量的影響

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，黨參莖葉發酵液多糖含量呈先升高后降低最后趨于平穩的趨勢。在發酵第6天發酵液多糖含量達到最大值，為39.355 3 mg/g；發酵6 d后多糖含量迅速下降，在第8天時發酵液多糖含量達最低并趨于穩定。究其原因可能是由于發酵前期為菌體對數生長期，培養基中營養成分充足，靈芝菌生長速率提高，代謝產物量不斷積累，使得第6天多糖含量達到最高；發酵6 d后進入穩定衰退期，菌體自身會分泌一些酶，分解菌體的同時使得菌體代謝產物合成速率下降，表現為多糖含量下降并趨于穩定。因此，選擇發酵時間為6 d。

圖1 發酵時間對多糖含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on polysaccharides contents

2.1.2 料液比對黨參莖葉多糖含量的影響

由圖2可知，隨著料液比的變化，黨參莖葉發酵液多糖含量呈先升高后降低的趨勢。在料液比為7.5∶100（g∶mL）時多糖含量達到最大值，為55.311 8 mg/g；之后多糖含量隨著料液比的變化而降低。分析認為，發酵基質含水量過低，會使黨參莖葉發酵液濃稠，靈芝菌生長緩慢甚至生長困難，影響多糖物質溶出；發酵基質含水量過高，會降低發酵基質中氧氣的含量和空氣的流通，導致靈芝菌生長和代謝產物合成緩慢。因此，選擇料液比為7.5∶100（g∶mL）。

圖2 料液比對多糖含量的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on polysaccharide content

2.1.3 種子液菌齡對黨參莖葉多糖含量的影響

由圖3可知，隨著菌齡的增加，黨參莖葉發酵液多糖含量呈現先升高后降低最后趨于平穩的趨勢。在菌齡為5 d時，多糖含量達到最大值，為32.472 3 mg/g，之后發酵液多糖含量隨著菌齡的增加而降低。分析認為，菌齡＜5 d時菌絲體量較少，酶活性較低，不能在發酵培養基中快速增殖；菌齡＞5 d后，由于營養物質的耗竭，菌絲生物量就不再增加，趨于老化，抑制了代謝產物活動，表現為多糖含量下降。因此，選擇菌齡為5 d。

圖3 種子液菌齡對多糖含量的影響Fig.3 Effect of age for bacteria in seed liquid on polysaccharide content

2.1.4 接種量對黨參莖葉多糖的影響

由圖4可知，隨著接種量的增大，黨參莖葉發酵液多糖含量呈現先升高后降低的趨勢。當接種量＜5%時，隨接種量的增加，發酵培養基中靈芝菌數量不斷增加，多糖產量增高；接種量為5%時，多糖含量達到最大值，為32.472 3 mg/g；之后隨接種量的增大，多糖含量開始逐漸降低。分析認為，隨接種量的增加，相應的代謝產物也增加；而接種量過高時，培養基中營養成分不能滿足菌株的正常生長代謝，使得代謝產物減少。因此，選擇接種量為5%。

圖4 接種量對多糖含量的影響Fig.4 Effect of inoculum on polysaccharide content

2.1.5 培養基初始pH值對黨參莖葉多糖的影響

由圖5可知，隨著培養基初始pH值的升高，多糖含量呈現先升高后降低的趨勢。當培養基初始pH為8時，多糖含量達到最大值，為49.196 4 mg/g；當培養基初始pH為9～10時逐步降低且趨于穩定。分析認為，在弱堿性條件下發酵有利于靈芝菌菌絲體的生長，更利于代謝物質的合成。因此，選擇培養基初始pH為8。

圖5 培養基初始pH值對多糖含量的影響Fig.5 Effect of initial pH of medium on polysaccharide content

2.2 發酵工藝響應面分析試驗

2.2.1 響應面分析方案與試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以發酵時間（A）、料液比（B）、培養基初始pH值（C）3個因素為自變量，以多糖含量（Y）為響應值進行3因素3水平響應面分析試驗，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表2 黨參莖葉液體發酵條件優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface tests for optimization of liquid fermentation conditions of stems and leaves of Codonopsis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression mode

利用Design-Expert 13對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到多糖含量預測值（Y）對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程：Y=37.31+7.66A+1.44B+0.96C+1.54AB+2.69AC+1.93BC-4.97A2-1.55B2-3.59C2。由表3可知，模型的P＜0.000 1，極顯著，說明該模型有效，失擬項P=0.305 4，失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型不存在失擬現象。

方差分析顯著性檢驗表明，決定系數R2=0.980 7、校正決定系數R2Adj=0.955 9，回歸方程模型與實際試驗擬合性較好，試驗誤差小，證明應用響應面優化發酵條件是可行的，具有參考性。由P值可知，一次項A、二次項A2、C2和交互項AC對多糖含量的影響極顯著（P＜0.01），一次項B和交互項BC對多糖含量的影響顯著（P＜0.05），其他項對多糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對多糖含量影響次序為發酵時間＞料液比＞培養基初始pH值。

2.2.2 發酵工藝的優化

根據回歸方程繪制各因素交互作用對黨參莖葉發酵液多糖含量影響的響應面圖和等高線圖，結果見圖6。由圖6可知，發酵時間與培養基初始pH值、料液比與培養基初始pH值交互作用較強，響應面的曲線圖中曲線走勢較陡，其影響顯著；發酵時間與料液比交互作用較弱，響應面的曲線圖中曲線走勢較平滑，其影響不顯著；與表3方差分析結果一致。由圖6可知，A、B、C存在極值點，對多糖含量的二次多項式數學模型解逆矩陣得知，最佳發酵條件為發酵時間6.559d、料液比7.638∶100（g∶mL）、培養基初始pH值8.093，此工藝條件下黨參莖葉發酵液多糖含量的預測值為37.066 mg/g。

圖6 發酵時間、料液比、培養基初始pH值間交互作用對黨參莖葉發酵液多糖含量影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time, solid to liquid ratio and initial pH of medium on polysaccharide content in fermentation broth of stems and leaves of Codonopsis

2.2.3 驗證試驗

考慮到試驗設備和實際操作可行性等因素進行調整，確定黨參莖葉發酵液發酵條件為發酵時間6.5 d、料液比7.5∶100（g∶mL）、培養基初始pH值8，在此條件下進行3次平行試驗，所得黨參莖葉發酵液多糖含量平均值為37.590 3 mg/g，與理論值誤差為1.41%，表明響應面方法可靠，可較好地應用于黨參莖葉與靈芝菌液體共發酵工藝的優化。

2.3 發酵前后有效成分含量變化研究

由表4可知，發酵后的黨參莖葉的總皂苷含量較發酵前降低了56.22%，總黃酮含量較發酵前降低了77.33%，多糖含量較發酵前提高了115.32%。

表4 發酵前后有效成分比較Table 4 Comparison of effective components before and after fermentation

3 討論

發酵時間是微生物生產及產物的累積的關鍵因素之一，發酵前期主要為菌體增長階段，中期主要為代謝物質積累階段，后期主要為營養物質大量消耗階段[15]。胡永樂等[16]研究發現，蛹蟲草與厚樸雙向液體發酵3～9 d，發酵液胞外多糖含量迅速增長，在12 d時達到最高值，繼續培養至15 d，發酵液胞外多糖逐漸減少；在黑霉菌固體發酵黃芪研究中，7 d前發酵液中多糖含量隨發酵時間的增長而增高，至7 d時達到最高，但當發酵時間再增加時多糖含量卻有略微下降[17]。與以上結果類似，本研究發現培養前期發酵培養基中營養充足時，菌體生長達到一定階段產生大量多糖，但隨著發酵天數的增加，靈芝菌迅速消耗培養基中多糖，出現營養供給不足，表現為多糖含量急速下降，此時發酵體系有可能生成較多次生代謝產物。料液比決定了發酵基質的初始含水量，對液體發酵具有重要的影響[18]。在蛹蟲草與厚樸雙向液體發酵研究中，當厚樸的添加量從2 g增加至5 g，發酵所得胞外多糖含量明顯增加，添加量為5 g時胞外多糖含量達到最大值，繼續增加至6 g時，胞外多糖含量呈下降趨勢[16]；張慶明等[19]對靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發酵結果進行分析，含水量過多或過少都會對靈芝菌的生長代謝造成不利影響，當固液比為1∶1.5時，發酵產物中多糖含量達到最高。本研究中，高壓滅菌期間，較高含水率將使發酵基質即黨參莖葉粉末排列松散，有利于菌體快速繁殖，從而加快菌體對底物的快速利用。同時發酵基質中的水環境也有助于靈芝菌產生多糖的擴散，以及分解后葡萄糖和其他物質的擴散，使更多菌體吸收和利用。發酵基質含水量太低，會使黨參莖葉發酵液濃稠，靈芝菌生長緩慢、甚至生長困難。而含水量過高，亦會使發酵基質發粘，造成通氣性不佳，影響靈芝菌的生長代謝。在種子培養過程中，菌齡的不同，菌絲生物量及酶的活性均會不同[20]。有研究表明，杏鮑菇液態發酵隨著種子液菌齡的增長，菌絲體生物量呈先增長后降低趨勢，在第6天菌絲體生物量達到最大值[21]；在元蘑液體菌種的優化培養研究中，菌齡在3～11 d，隨著菌齡的增加，菌絲體生物量和菌絲球密度先增加后減少，在菌齡為5 d 時的液體菌種，菌絲體的生長情況最佳[22]。與以上研究類似，本研究發現當菌齡＜5 d時，種子液中的菌絲體可能由于菌齡太短而菌絲體量太少，酶活性較低，不能很快的在發酵培養基中增殖；菌齡＞5 d時，可能是由于營養物質的耗竭，菌絲生物量就不再增加，趨于老化菌體衰老，抑制了代謝活動，進而導致多糖含量不高。綜合考慮，黨參莖葉靈芝菌液體發酵較適宜的種子液菌齡為5 d。接種量的大小決定培養基中菌體的生長速度[23]。在蛹蟲草菌雙向發酵杜仲和楊樹花研究中，蟲草多糖的含量與菌種含量呈正相關，多糖含量也隨之增加[24]；周向輝[25]利用格式乳酸菌發酵猴頭菇研究結果表明，隨著格氏乳桿菌接種量的提高，多糖的提取率呈先增長后降低趨勢，當接菌量為5%時，提取出的發酵猴頭菇多糖提取率最高。與前人結果相似，本研究中隨接種量的增加，發酵黨參莖葉多糖含量呈先增高后下降趨勢。接種量越大，菌細胞數量則越快達到最大值，但當接種量＞5%時，發酵培養基中靈芝菌數量過多，需氧量增大，對培養基營養成分消耗加快，但培養基中營養物質有限，其個體營養則會受到限制，從而制約菌體生長，導致多糖含量下降。綜合以上因素，黨參莖葉靈芝菌液體發酵較適宜的接種量為5%。培養基初始pH值影響真菌生長和發酵代謝產物的重要因素，在堿性條件下發酵更有利于靈芝菌菌絲體的生長[26]。在靈芝-何首烏雙向液體發酵研究中，隨著發酵培養基初始pH的升高，發酵菌質的抗氧化活性呈先降后升再降趨勢，當pH=7時，發酵菌質的抗氧化活性達到最大值，發酵菌質中多糖含量是對照靈芝菌絲體的1.96倍[27]；在靈芝-銀杏雙向液體發酵研究中，隨著初始pH值不斷增加，新型菌株的還原能力呈先增加又降低的趨勢，當pH=7時，多糖含量達到最大值[28]。同樣的隨著培養基初始pH的升高，本研究中多糖含量呈先降后升再降趨勢，當初始pH=8時，多糖含量達到最大值。真菌生長最適pH值和產物形成最適pH值不總是相同，靈芝菌在酸性或堿性環境中均可生長，但發酵物多糖含量在弱堿性環境中達到最高。

本研究中靈芝菌與黨參莖葉共發酵后靈芝菌絲體生長良好，說明黨參莖葉可為菌絲體生長及活性成分分泌提供物質基礎，同時，靈芝菌對共發酵產物中粗多糖、總黃酮、總皂苷的影響存在較大差異。研究表明，南韓靈芝發酵對靈芝-澤瀉雙向液體發酵菌質粗多糖含量由未發酵基質的5.83%增至發酵后的7.86%[29]；靈芝菌發酵玉竹產水溶性多糖較未發酵的培養基提高了73.48%[30]；靈芝黃芪雙向發酵菌質靈芝多糖組分PG-1相較于未添加黃芪發酵的菌質多糖中的PG-2組分在多糖得率上增加325%[31]。本研究在最佳發酵工藝條件下，與靈芝菌共發酵后黨參莖葉粗多糖含量較發酵前提高了115.32%，可能是因為黨參莖葉中多糖成分在靈芝菌分泌的酶作用下得到有效分解，使得植物細胞壁分解，胞內有效成分能得到更充分釋放，使得多糖的溶出率顯著增加，與以上研究結果一致。研究表明，靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發酵過程中總皂苷含量隨著時間的進行逐漸減少[19]；靈芝菌液體發酵人參莖葉后，總皂苷含量較發酵前降低了19.70%[9]。本研究在最佳發酵工藝條件下，與靈芝菌共發酵后黨參莖葉總皂苷含量較發酵前降低了56.22%，說明靈芝菌對黨參莖葉的皂苷類物質進行了轉化，具體機制后續需要進一步探索。研究發現經靈芝菌株個體發酵后，不同品種的枇杷葉總黃酮含量可以視為未檢出[32]；牛蒡根經靈芝菌絲體發酵后，總黃酮含量由3.47%降低至0.34%[8]。本研究在最佳發酵工藝條件下，與靈芝菌共發酵后黨參莖葉總黃酮的含量較發酵前下降的更為顯著，可能是因為發酵過程中靈芝菌代謝的豐富酶系破壞了黃酮類化合物能發生顯色反應的鄰苯二酚結構，或培養基高溫滅菌對黃酮類化合物有一定的降解作用，與以上研究結果一致。

4 結論

本試驗以靈芝菌為發酵菌種，通過單因素和響應面優化黨參莖葉液體發酵工藝，得到最佳條件為發酵時間6.5 d、料液比7.5 g/100 mL、培養基初始pH值為8，在此條件下測得發酵黨參莖葉粗多糖平均含量為37.590 3 mg/g。與發酵前相比，發酵黨參莖葉中粗多糖含量增加115.32%，總皂苷含量降低56.22%，總黃酮含量降低77.33%。該研究為黨參莖葉資源的開發利用提供參考，也可為中藥材非藥用部位的發酵利用提供實驗依據。