GC-MS結合自動解卷積技術分析谷殼中揮發性風味成分

畢榮宇，王國江，盧 君*，唐 平，山其木格，王 麗，王 凡，李長文，王道軍，陸安謀

（1.貴州國臺酒業集團股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.貴州國臺酒業集團研究院，天津 300410）

谷殼，又名糠殼、稻殼，是稻谷加工過成中分離出來的外殼[1]，其主要成分為纖維素（35.5%～45.0%）、木質素（21%～26%）、灰分（11.4%～22.0%）、五碳糖聚合物（16%～21%）[2-3]。谷殼具有結構緊密、質地堅硬、不易分解、耐酸耐高溫、良好的疏松度、不易與糟醅粘連等特性。利用這些特性，谷殼常用作固態大曲酒釀造的主要輔料，在大曲醬香型白酒的生產中用于糟醅和甑篦的隔離，堆積發酵時避免糟醅和晾堂地表的接觸，避免窖面糟醅和窖泥的接觸，加入糟醅中起到疏松、支撐、透氣，調劑糟醅的淀粉濃度、酸度、水分含量的作用，使得酒醅有適宜的縫隙，為微生物生長和繁殖提供必要的氧氣，利于蒸餾取酒和糟醅溶氧，提高堆積發酵質量，使蒸糧、糖化發酵、蒸酒順利進行[1，3-5]。

由于谷殼在儲存、運輸過程中容易受潮發霉，隨著儲存時間的延長，霉菌量和脂肪酸值呈增加趨勢，導致谷殼品質劣變。由于谷殼本身含有雜質、雜菌以及大量生糠味、青草味、泥腥味和苦味物質，因此，對白酒基酒的產量和質量有一定的影響[6-7]。醬香型白酒釀造過程中谷殼用量較大，因而在實際生產過程中需要預先將谷殼置于酒甑中利用清水進行敞口清蒸30 min左右，再拌和糟醅進行白酒蒸餾。目前，地方標準DB52/T 869—2014《醬香型白酒釀酒用谷殼》也只規定了水分、色澤和氣味的檢驗方法及應用標準[8]。在實際生產中谷殼使用要求“既要有糠香又要有骨力”，但是目前谷殼在蒸餾前后香氣特征的變化往往憑借操作工人的手感和聞香決定，這種評價具有極強的主觀片面性[9]。因此，弄清谷殼中揮發性成分的構成信息，對科學控制異雜味向酒中的遷移，制定谷殼的使用標準有著積極的作用。

本研究基于頂空固相微萃?。╤ead space solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結合自動質譜解卷積系統（automatic mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）和保留指數（retention index，RI）對谷殼中的揮發性成分進行分析，初步建立起谷殼揮發性成分數據庫，以期為谷殼的清蒸效果判定提供數據支撐，為實際生產的改進提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷殼：貴州國臺酒業集團股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：美國TEDIA公司；正構烷烴（C7～C30）混合對照品溶液：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Gen Pure xCAD Plus純水機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME204T電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent DB-WAX UI色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；IT-09A-5磁力攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司；頂空固相微萃取手柄和50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭：美國Supelco公司；8890-5977B MSD氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

頂空-固相微萃取法：取谷殼樣品10 g放入100 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋，用裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭的固相微萃取手柄插入頂空瓶中，對谷殼中的揮發性風味成分進行萃取，以60 ℃水浴恒溫萃取50 min，再將萃取頭取出及時插入氣相色譜-質譜聯用儀進樣口，連續解吸5min。

1.3.2 頂空固相微萃取條件優化

為獲得谷殼揮發性物質頂空固相微萃取的優化條件，在單因素試驗結果（最佳樣品質量5 g、萃取溫度50 ℃、萃取時間60 min）基礎上，以揮發性物質的總峰面積為評價指標，以樣品質量（A）、萃取溫度（B）、萃取時間（C）為影響因素，采用3因素3水平L9（33）正交試驗設計對頂空固相微萃取條件進行優化，正交試驗因素與水平見表1。

表1 頂空固相微萃取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for headspace solid phase microextraction conditions optimization

1.3.3 保留指數的測定

保留指數（RI）的測定方法參考文獻[10]所述。根據氣質聯用分析條件對C7～C30正構烷烴混合對照品進行GC-MS分析，記錄各正構烷烴的保留時間，根據線性程序升溫公式計算各待鑒定化合物的RI，其計算公式如下：

式中：x為待分析化合物；TR為保留時間，min；n、n+1為待分析化合物前后兩個正構烷烴的碳原子數，且TR（n）＜TR（x）＜TR（n+1）。

1.3.4 氣質聯用儀器檢測條件

氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃；進樣方式為分流進樣；分流比為5∶1；載氣為高純氦氣（He）；流速為1 mL/min；氣相色譜升溫程序為起始柱溫40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至240 ℃，保持20 min，總運行時間75 min。

質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；監測方式為全掃描（full scan，SCAN）；四級桿溫度150 ℃；質量數掃描范圍35～550 amu，掃描速度1 562 u/s，頻率2.9掃描數/s。

定性分析：利用儀器內置未知物分析軟件解卷積功能對色譜峰進行處理，首先將化合物的質譜圖與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）20標準數據庫中的標準圖譜進行比對，匹配度＞80%作為初步定性結果。由于RI僅與物質性質、固定相及柱溫度有關，能有效避免因質譜圖相似而導致定性錯誤，所以本研究通過測定各化合物的RI值，與文獻或數據庫報道的保留指數值（retention index of literature，RIL）進行比較，若誤差在±3%內，則可對物質定性。最后，通過與標準品進行對比以確定該化合物。

定量分析：采用峰面積歸一法，對每個樣品的所有揮發性成分進行面積積分，計算出其中每一個組分的百分含量。

1.3.5 數據處理

數據處理利用Minitab 17.0軟件對谷殼中揮發性物質測定結果進行分析，采用Origin 2021（9.8）進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 谷殼揮發性物質頂空固相微萃取條件優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇樣品質量（A）、萃取溫度（B）和萃取時間（C）3個因素，以揮發性物質的總峰面積為評價指標，采用L9（33）正交試驗設計，確定HS-SPME萃取谷殼揮發性物質的最佳參數。每組試驗3次平行，正交試驗結果與分析見表2。

表2 頂空固相微萃取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for headspace solid phase microextraction conditions optimization

由表2可知，以谷殼中揮發性物質的總峰面積為評價指標，樣品質量（A）、萃取溫度（B）和萃取時間（C）3個因素對結果影響的主次順序為C＞B＞A，即萃取時間為最主要的影響因素，其次為萃取溫度、樣品質量，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中，提取揮發性物質的最佳組合為A3B3C1，即最優頂空固相微萃取條件為樣品質量10.0 g，萃取溫度60 ℃，萃取時間50 min。

2.2 谷殼中揮發性風味物質GC-MS分析

按照最優HS-SPME條件，對谷殼中揮發性物質進行GC-MS分析，谷殼中揮發性風味物質類別組成見圖1。

圖1 谷殼中揮發性風味物質組成Fig.1 Composition of volatile flavor substances in rice husk

由圖1可知，從谷殼中共鑒定出揮發性物質173種，其中醇類17種，占10.06%，醛類23種，占15.28%，酸類11種，占40.26%，酯類6種，占2.00%，酮類21種，占4.22%，呋喃類7種，占1.34%，呋喃酮類1種，占0.15%，吡嗪類3種，占0.14%，內酯類6種，占1.95%，芳香族44種，占11.44%，烴類21種，占4.43%，雜環類7種，占1.15%，含硫化合物1種，占0.04%，萜烯類5種，占7.54%。其中氣味較明顯的醇、醛、酸、酯、酮、芳香族及雜環類物質占84.41%，這證明谷殼中異雜味物質較多，在使用前在酒甑中敞蓋大汽清蒸30 min的必要性。

2.2.1 醇類物質

谷殼中醇類物質GC-MS分析結果見表3。由表3可知，共定性出17種醇類物質，其中己醇占比最高，為3.36%，其次為正戊醇，占比1.31%。

表3 谷殼中醇類物質GC-MS分析結果Table 3 Results of alcohols in rice husks analysis by GC-MS

異戊醇、正戊醇、己醇、1-辛烯-3-醇、正庚醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇均有在醬香型白酒中檢出[11-13]。其中異戊醇、正己醇、1-辛醇是白酒中的主要雜醇油成分，其含量對白酒的風味影響很大，如果其含量過高就會破壞酒體的整體風格，還會引起飲后“上頭”等不適的癥狀，因此，需要控制其含量[14-15]。1-辛烯-3-醇又被稱為蘑菇醇，廣泛存在于各類食用菌中，在不同香型白酒中也有檢測到，其具有強烈的蘑菇味、土腥味和真菌氣味，在水中的閾值為2 μg/L，在葡萄酒中的閾值為40 μg/L[16]，在艾納香油中也被檢出，且首次準確定量[17]。

2.2.2 醛類物質

谷殼中醛類物質GC-MS分析結果見表4。由表4可知，谷殼中共檢出醛類物質23種，其中飽和醛（9種）包括戊醛、己醛、丙醛二乙基乙縮醛、庚醛、辛醛、壬醛、十一醛、肉豆蔻醛、十五醛。不飽和醛（14種）包括丙烯醛、2-甲基丙烯醛、異戊烯醛、2-己烯醛、（E）-2-庚烯醛、5-乙基環戊-1-烯甲醛、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、反-2-十一烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛。其中具有典型青草味的己醛、辛醛占比較高，分別為3.28%、1.09%。

表4 谷殼中醛類物質GC-MS分析結果Table 4 Results of aldehydes in rice husks analysis by GC-MS

丙烯醛是一種具有惡臭、刺激性氣味的物質，被國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）確認為第Ⅲ類致癌物，朱夢旭[19]研究表明，在濃香型、醬香型、清香型等白酒中都檢測到丙烯醛的存在，考慮到綜合攝入，有必要降低白酒中丙烯醛的含量并制定限量標準。戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛主要呈脂肪臭、花香、水果香、醛香，其在46%vol酒精水溶液中的嗅覺閾值分別為725.41μg/L、25.48μg/L、409.76μg/L、39.64μg/L、122.45μg/L[20]，其中丙醛二乙基乙縮醛、十一醛、肉豆蔻醛、十五醛也是首次在谷殼中被檢出。（E）-2-辛烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛呈青草和油脂的復合香氣，閾值僅為0.09 μg/L，是米飯中的主要香氣成分[21]。5-乙基環戊-1-烯甲醛、（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、反-2-十一烯醛也是首次在谷殼中被檢測到。由此可見，谷殼中含有大量的呈青草味、油脂味、花香味等復雜氣味的醛類物質，因此谷殼清蒸工藝將直接影響清蒸后谷殼的香氣特征。

2.2.3 酸類物質

谷殼中酸類物質GC-MS分析結果見表5。由表5可知，谷殼中共檢出酸類物質11種，其中含量最高為順式-13-十八碳烯酸，占比為14.86%，其次為肉豆蔻酸、棕櫚油酸，占比分別為6.60%、6.26%。

表5 谷殼中酸類物質GC-MS分析結果Table 5 Results of acids in rice husks analysis by GC-MS

脂肪酸對于白酒的風味具有重要作用，辛酸、壬酸、癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸等脂肪酸也廣泛存在于果酒中。脂肪酸類物質在酒精水溶液中主要呈酸臭、窖泥臭、汗臭，其中辛酸、壬酸、癸酸、十二酸的閾值分別為2 701.23 μg/L、3 559.23 μg/L、13 736.77 μg/L、9 153.79 μg/L[20]。十二酸、十五酸之前已在谷殼中檢出[23]，其他脂肪酸首次在谷殼中鑒定出。

2.2.4 酯類物質

谷殼中酯類物質GC-MS分析結果見表6。由表6可知，谷殼中共檢出酯類物質6種，具有醚味、水果香的乙酸乙烯酯占比最高，為0.80%，其次亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯的占比也較高，分別為0.54%和0.30%。

表6 谷殼中酯類物質GC-MS分析結果Table 6 Results of esters in rice husks analysis by GC-MS

酯類物質呈現水果香和甜香，其中正己酸乙烯酯也是豬肉中的酯類物質，棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯主要呈現蠟味，也是白酒中重要的風味物質，含量過高還會造成酒體的渾濁，因此要嚴格控制其含量[25]。

2.2.5 酮類物質

谷殼中酮類物質GC-MS分析結果見表7。由表7可知，谷殼中共檢出21種酮類物質，其中丙酮是主要的酮類物質，占比為1.01%。

表7 谷殼中酮類物質GC-MS分析結果Table 7 Results of ketones in rice husks analysis by GC-MS

丙酮、2,3-戊二酮、2-庚酮、乙偶姻、6-甲基-5-庚烯-2-酮在白酒中檢出，乙偶姻可以由枯草芽孢桿菌產生，與氨反應生成具有擴張血管和改善血液微循環的四甲基吡嗪[26]。4-己烯-3-酮是國家允許使用的食品用香料。3-辛烯-2-酮呈土腥味、奶油味，是米飯中的香氣化合物，6-甲基-2-庚酮呈香樟味，羥基丙酮具有刺激性的香氣，3-甲基-2-環戊烯-1-酮具有焦糖香味，6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮具有青草香，辛辣味。與前期研究相比[21]，本研究鑒定出的酮類物質差異性較大，這也證明谷殼中揮發性物質組成的復雜性，值得后面進一步深入探討。

2.2.6 呋喃及呋喃酮類物質

谷殼中呋喃及呋喃酮類物質GC-MS分析結果見表8。由表8可知，谷殼中共檢出7種呋喃類物質及1種呋喃酮類物質，2-戊基呋喃占比最高，為1.16%。

表8 谷殼中呋喃及呋喃酮類物質GC-MS分析結果Table 8 Results of furans and furanones in rice husks analysis by GC-MS

3-甲基呋喃具有類似乙醚的氣味，2-正丁基呋喃具有果香、酒香、甜香，在醬香型習酒中2-正丁基呋喃具有較高的香氣強度值[24]。在對醬香型缺陷白酒中風味化合物的研究表明，2-正丁基呋喃的氣味活度值（ordor activity value，OAV）＞2 000，呈現在鹽菜味酒中最高，但整體差異不明顯[27]。2-戊基呋喃是水蜜桃的香氣化合物，呈現花香、清香[26]。谷殼中含有多縮戊糖，在低pH下或受熱后會生成糠醛，其含量在醬香型白酒中含量最高，使酒產生燥辣味、糠味，糠醛具有苦杏仁氣味，也是引起白酒苦味的主要物質[21，28-29]。

2.2.7 吡嗪及內酯類物質

谷殼中吡嗪及內酯類物質GC-MS分析結果見表9。由表9可知，谷殼中共檢出3種吡嗪類物質和6種內酯類物質。

表9 谷殼中吡嗪及內酯類物質GC-MS分析結果Table 9 Results of pyrazines and lactones compounds in rice husks analysis by GC-MS

四甲基吡嗪在醬香型白酒中含量最高，有類似于爆米花、堅果和水果的特別香味，具有擴張血管、改善微循環及抑制血小板積聚的作用[30]。內酯類物質是許多食品風味的關鍵氣味物質之一，在白酒中已經檢測到γ-己內酯、γ-壬內酯，γ-壬內酯的閾值較低，僅為9.70～30.00 μg/kg，其占比分別為0.22%、0.51%。二氫獼猴桃內酯廣泛存在于多種茶中[31]，占比為0.46%。因此，谷殼也可能是白酒中四甲基吡嗪及內酯類物質的來源之一。

2.2.8 芳香族類物質

谷殼中芳香族類物質GC-MS分析結果見表10。由表10可知，谷殼中共檢出44種芳香族類物質。其中苯乙醛和4-乙烯基苯酚占比較大，分別為2.91%和2.00%。

表10 谷殼中芳香族類物質GC-MS分析結果Table 10 Results of aromatic compounds in rice husks analysis by GC-MS

苯甲醛、苯乙醛、萘、2-甲氧基苯酚（愈創木酚）、苯甲醇、苯乙醇、萘、2-甲基萘、苯并噻唑、苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-乙烯基愈瘡木酚）等都是白酒中具有典型氣味的化合物[7]。苯甲醛、苯乙醛、2-羥基苯甲醛、苯乙醇、喹啉、苯并噻唑、苯酚、異丁香酚等物質均是國家允許使用的食品添加劑。酚類物質在醬香型白酒風味和口感上也起著非常重要的作用，相關研究表明，4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈創木酚是引起白酒產生糠味的物質[32-33]。同時，谷殼中也檢測到了鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯等塑化劑成分，如果谷殼清蒸不完全，可能會隨著蒸餾遷移到白酒中造成對人體的傷害[34]。由此可見，谷殼中的芳香族物質組成復雜，也證明谷殼在使用前清蒸的重要性。

2.2.9 烴類及雜環類物質

谷殼中烴類及雜環類物質GC-MS分析結果見表11。由表11可知，谷殼中共檢出21種烴類物質及7種雜環類物質。

表11 谷殼中烴類及雜環類物質GC-MS分析結果Table 11 Results of hydrocarbons and heterocyclic compounds in rice husks analysis by GC-MS

1,1-二氯乙烯、（E）-1,2-二氯乙烯、丙烯腈具有不愉快的刺激性氣味。癸烷、十二烷、二十五烷被證明是玫瑰、蘭花及陳皮和青皮揮發油的主要成分[26]。雜環類含氮化合物吡啶、2-甲基吡啶、異噻唑具有臭味，其中吡啶在醬香型白酒的基酒及輪次酒中都有檢出[28]。4-[2,2,6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮具有甜香，花香。

2.2.10 含硫及萜烯類物質

谷殼中含硫及萜烯類物質GC-MS分析結果見表12。由表12可知，谷殼中共檢出1種含硫物質及5種萜烯物質。其中植醇的占比最高，為1.33%。

表12 谷殼中含硫及萜烯類物質GC-MS分析結果Table 12 Results of sulfur-containing and terpene compounds in rice husks analysis by GC-MS

含硫化合物二甲基亞砜帶有苦味，在酸存在時加熱會產生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫、甲磺酸等化合物。萜烯類物質中茶香酮、香葉基丙酮、反式-β-紫羅蘭酮也是國家標準允許使用的食品添加劑，分別具有茶香酮具有木香和茶葉香氣、木蘭香氣、花香。

3 結論

本研究建立了頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用結合自動質譜解卷積系統和保留指數對谷殼中的化學成分進行鑒定分析比較的方法，利用正交試驗優化了HS-SPME萃取參數。結果表明，HS-SPME的最優條件為樣品質量為10.0 g，萃取溫度為60 ℃，萃取時間50 min。GC-MS分析結果表明，谷殼中共鑒定出揮發性物質173種，其中醇類17種，占10.06%，醛類23種，占15.28%，酸類11種，占40.26%，酯類6種，占2.00%，酮類21種，占4.22%，呋喃類7種，占1.34%，呋喃酮類1種，占0.15%，吡嗪類3種，占0.14%，內酯類6種，占1.95%，芳香族44種，占11.44%，烴類21種，占4.43%，雜環類7種，占1.15%，含硫化合物1種，占0.04%，萜烯類5種，占7.54%。其中氣味較明顯的醇、醛、酸、酯、酮、芳香族及雜環類物質占到了84.41%，這也證明谷殼中影響基酒質量的異雜味物質較多，因此在使用前需進行大汽清蒸。本研究方法準確度高，有利于企業全面認識谷殼中的揮發性成分，為后續深入研究谷殼清蒸工藝和清蒸標準提供數據支撐，為實際生產提供理論指導，有效防止白酒生產過程中異雜味物質的遷移，提高白酒的質量。